內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法

第一節(jié)β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)一、定義β-內(nèi)酰胺類抗生素（β-lactamantibiotics）系指化學結(jié)構中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)一大類抗生素，包含臨床最慣用青霉素（penicillins）與頭孢菌素（cephalosporin），以及近年開發(fā)頭霉素類、硫霉素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類等其它非經(jīng)典β-內(nèi)酰胺類抗生素。

系對藥品中分子量大于藥品本身雜質(zhì)總稱。其分子量普通在1000～5000，個別可至約10000道爾頓，小于化工、生化領域中所指高分子化合物分子量。

9/24/20241內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第1頁β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)二、分類及起源按其起源分為兩類:外源性雜質(zhì)和內(nèi)源性雜質(zhì)。外源性雜質(zhì):包含蛋白、多肽、多糖等類雜質(zhì)或抗生素和蛋白、多肽、多糖等結(jié)合物。普通起源于發(fā)酵工藝，如青霉素中青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等。9/24/20242內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第2頁內(nèi)源性雜質(zhì):抗菌藥品本身聚合產(chǎn)物。聚合物即可來自生產(chǎn)過程，又可在儲存中形成，甚至在用藥時使用不妥也可產(chǎn)生?？股鼐酆衔锩庖咴酝ǔ］^弱，但作為多價半抗原，可引發(fā)速發(fā)型過敏反應。

免疫原性(immunogenicity):抗原刺激機體產(chǎn)生免疫應答，誘生抗體或致敏淋巴細胞能力?？乖?antigenicity):抗原與其誘生抗體或致敏淋巴細胞有特異性結(jié)合能力。也寫作反應原性。完全抗原:同時具備2個性質(zhì)。天然蛋白質(zhì)都是完全抗原。半抗原(hapten):只有抗原性而沒有免疫原性物質(zhì)，即只能與抗體結(jié)合，卻不能單獨誘導抗體產(chǎn)生物質(zhì)，稱為半抗原。普通分子量較小，如化學藥品。半抗原+載體(carrier)→完全抗原。速發(fā)型過敏反應是一個常見過敏反應,主要為呼吸道過敏反應、消化道過敏反應、皮膚過敏反應以及過敏性休克。伴隨當代生產(chǎn)工藝不停改進和提升,當前產(chǎn)品中外源性雜質(zhì)日趨降低,對內(nèi)源性聚合物控制是當前抗生素藥品高分子雜質(zhì)控制重點。9/24/20243內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第3頁圖1水溫引發(fā)阿莫西林干糖漿中高分子雜質(zhì)含量改變9/24/20244內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第4頁β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)三、形成機理及結(jié)構特征（一）青霉類抗生素:高分子雜質(zhì)有蛋白（多肽）類雜質(zhì)和聚合物雜質(zhì)兩大類。9/24/20245內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第5頁青霉噻唑多肽:制劑中青霉噻唑多肽分子量主要分布在3500～2400道爾頓左右，有青霉素β-內(nèi)酰胺環(huán)和多肽伯氨基按親核反應機理縮合而成，主要發(fā)生在發(fā)酵工藝中。樣品在儲存過程中，多肽類雜質(zhì)殘留自由氨基仍與β-內(nèi)酰胺反應，直至被飽和，反應速度和樣品本身水分含量及儲存溫度相關。9/24/20246內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第6頁青霉噻唑蛋白基本結(jié)構青霉素G內(nèi)酰胺環(huán)斷裂點9/24/20247內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第7頁青霉素聚合物:1.反應僅和母核結(jié)構相關，側(cè)鏈中活性基團不參加反應。一分子青霉素首先開環(huán)，形成一新活性位點，并與另一分子青霉素聚合。2.側(cè)鏈參加聚合反應主要以氨芐青霉素為代表，反應時側(cè)鏈上氨基親核攻擊β-內(nèi)酰胺抗生素羰基碳原子，形成聚合物。9/24/20248內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第8頁頭孢菌素:頭孢菌素中高分子雜質(zhì)主要是不一樣類型聚合物。1.只與母核結(jié)構相關N型聚合反應eg.頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢哌酮等2.側(cè)鏈參加L型聚合反應。eg.頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢噻肟等在堿性條件下，兩種反應都能夠發(fā)生。9/24/20249內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第9頁β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)四、結(jié)構特點高度不均一性和不確定性。1.青霉噻唑多肽（蛋白）類雜質(zhì)發(fā)酵中產(chǎn)生任何蛋白及蛋白碎片都可能帶入到產(chǎn)品中；相同蛋白或蛋白碎片上能夠結(jié)合不一樣數(shù)目標藥品分子。9/24/202410內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第10頁2.聚合物類雜質(zhì):青霉素、頭孢菌素不但能形成聚合度不一樣聚合物，許多樣品還能同時發(fā)生不一樣機理聚合反應。3.形成聚合物可發(fā)生不一樣程度分（降）解反應，如開環(huán)等。4.對以異構體形式存在樣品，同聚和異聚反應可同時發(fā)生。5.實踐中發(fā)覺高分子雜質(zhì)種類及數(shù)量和生產(chǎn)工藝親密相關，如氨芐西林鈉，溶媒法和噴霧干燥法高分子雜質(zhì)含有不一樣特異性，且二者聚合物含量顯著不一樣。凍干粉二聚物溶媒粉二聚物9/24/202411內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第11頁β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)五、影響聚合物形成原因1.青霉素聚合物青霉素聚合反應速度在溶液條件下和溶液酸堿度關系親密；在固體條件下主要和樣品水分含量相關。

9/24/202412內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第12頁2.頭孢菌素聚合物固體狀態(tài)下頭孢菌素類產(chǎn)品聚合速度與含水量和貯存溫度關系親密。貯存溫度較低時,含水量差異對聚合物含量盡管有影響,但影響不大；但當貯存溫度上升至37℃時,含水量差異對聚合物含量影響十分顯著。9/24/202413內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第13頁β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)六、口服青霉素類藥品使用前進行皮試必要性口服青霉素類抗生素在國內(nèi)外都有過敏反應報道,但其原因未有試驗報道。有相關報道,在青霉素V聚合物可經(jīng)胃腸道吸收而引發(fā)過敏反應。所以,在口服青霉素類抗生素前,必須進行皮膚過敏試驗,這是十分必要。9/24/202414內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第14頁β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)七、抗生素高分子雜質(zhì)質(zhì)控意義1.β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)是引發(fā)臨床速發(fā)型過敏反應過敏原；2.高分子雜質(zhì)經(jīng)注射和口服都可引發(fā)過敏反應,所以注射劑和口服劑都應控制。3.高分子雜質(zhì)是β-內(nèi)酰胺類抗生素質(zhì)量評價主要指標,可評價藥品質(zhì)量和穩(wěn)定性,并可借此深入評價其生產(chǎn)工藝。9/24/202415內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第15頁第二節(jié)高分子雜質(zhì)分析方法高分子雜質(zhì)質(zhì)控方法化學分析免疫學分析色譜法分光法（P值法）間接血凝法豚鼠PCA法反相模式離子交換模式凝膠色譜模式一、概述9/24/202416內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第16頁因為結(jié)構不一樣高分子雜質(zhì)通常有相同生物學特征，如:均為過敏性雜質(zhì)，所以，在藥品質(zhì)量控制中普通不需分別控制不一樣結(jié)構高分子雜質(zhì)含量，而只需控制藥品中高分子雜質(zhì)總量。故依據(jù)分子量差異進行分離凝膠色譜模式是簡便易行分離模式。以葡聚糖凝膠SephadexG-10為基礎凝膠色譜分析方法，可簡便地用于對各種β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)分離、分析，并滿足藥品質(zhì)量控制需要。9/24/202417內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第17頁高分子雜質(zhì)分析方法二、凝膠色譜系統(tǒng)分離原理及特點

9/24/202418內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第18頁凝膠色譜系統(tǒng)分離原理及特點1.凝膠色譜法凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜法主要用于高聚物相對分子質(zhì)量分級分析以及相對分子質(zhì)量分布測試。凝膠色譜法又叫凝膠色譜技術,是六十年代初發(fā)展起來一個快速而又簡單分離分析技術,因為設備簡單、操作方便,不需要有機溶劑,對高分子物質(zhì)有很高分離效果。它是利用一些凝膠對混合物各組分因分子量不一樣,其阻滯作用也不一樣而進行分離、分析方法。9/24/202419內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第19頁凝膠色譜系統(tǒng)分離原理及特點2.凝膠色譜系統(tǒng)分離原理（1）利用凝膠色譜分子篩機制,但凝膠孔徑要比分子篩大得多,普通為幾百至幾千埃。讓藥品分子自由進入凝膠顆粒內(nèi)部,而全部高分子雜質(zhì)被排阻,進而實現(xiàn)讓全部高分子雜質(zhì)含有相同保留時間構想。9/24/202420內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第20頁凝膠滲透色譜按分子大小分離原理圖9/24/202421內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第21頁凝膠過濾柱層析所用基質(zhì)是含有立體網(wǎng)狀結(jié)構、篩孔直徑一致,且呈珠狀顆粒物質(zhì)。這種物質(zhì)能夠完全或部分排阻一些大分子化合物于篩孔之外,而對一些小分子化合物則不能排阻,但可讓其在篩孔中自由擴散、滲透。任何一個被分離化合物被凝膠篩孔排阻程度可用分配系數(shù)Kav（被分離化合物在內(nèi)水和外水體積中百分比關系）表示。9/24/202422內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第22頁試驗證實，SephadexG-10凝膠可基本確保全部β-內(nèi)酰胺抗生素中高分子雜質(zhì)被排阻。Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)Kav:分配系數(shù)；Ve:被分離物質(zhì)洗脫體積；Vo:柱內(nèi)凝膠床中顆粒間自由空間所占有體積（外水體積）；Vt:柱內(nèi)凝膠顆粒占有體積與外水體積之和（柱床體積）普通Kav≈0洗脫組分視作高分子雜質(zhì)。9/24/202423內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第23頁外水體積（Vo）:凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間體積，即液體流動相體積；內(nèi)水體積（Vi）:凝膠顆粒中孔穴體積，即固定相體積；基質(zhì)體積（Vg）:凝膠顆粒實際骨架體積。Vt=Vo+Vi+Vg柱床體積（Vt）:凝膠柱所能容納總體積9/24/202424內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第24頁洗脫體積（Ve）:將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液體積。普通是介于Vo和Vt之間。（1）對于完全排阻大分子，因為其不進入凝膠顆粒內(nèi)部，而只存在于流動相中，故Ve=Vo；（2）對于完全滲透小分子，因為能夠存在于凝膠柱整個體積內(nèi)，故Ve=Vt；分子量介于二者之間分子，其洗脫體積也介于二者之間，但，有時也出現(xiàn)Ve＞Vt，這是因為這種分子與凝膠吸附作用造成。9/24/202425內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第25頁凝膠層析洗脫示意圖（1）完全排阻大分子（2）中等分子（3）完全滲透小分子（4）吸附分子9/24/202426內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第26頁通常選取藍色葡聚糖作為測定外水體積物質(zhì)。該物質(zhì)分子量大（為200萬）,呈藍色,它在各種型號葡聚糖凝膠中都被完全排阻,并可借助其本身顏色,采取肉眼或分光光度儀檢測（210nm或260nm或620nm）洗脫體積（即Vo）。不過,在測定激酶等蛋白質(zhì)分子量時,不宜用藍色葡聚糖測定外水體積,因為它對激酶有吸附作用,所以有時用巨球蛋白代替。9/24/202427內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第27頁Vo測定9/24/202428內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第28頁Vt測定9/24/202429內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第29頁（2）因為溶質(zhì)分子和凝膠介質(zhì)間存在各種次級相互作用,溶質(zhì)分子可被吸附于凝膠介質(zhì)表面。（3）在凝膠顆粒內(nèi)部含有較大比表面積和較小自由空間,故溶質(zhì)分子更易和凝膠介質(zhì)接觸,所以溶質(zhì)分子在凝膠顆粒內(nèi)部較凝膠顆粒外部更易被吸附。（4）即,色譜過程中除分子排阻作用外,凝膠對藥品分子吸附作用大于對高分子雜質(zhì)吸附作用。9/24/202430內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第30頁有目標利用藥品分子和凝膠間次級相互作用,使藥品分子吸附于凝膠顆粒內(nèi)表面,進而改進高分子雜質(zhì)和藥品分子之間分離度。（5）在深入研究藥品和葡聚糖凝膠相互作用及流動相對該相互作用影響基礎,經(jīng)過調(diào)整色譜過程中流動相組成、濃度、pH和流速等參數(shù),調(diào)整藥品分子和凝膠顆粒間相互作用,進而調(diào)整高分子雜質(zhì)和藥品分子間分離度。9/24/202431內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第31頁凝膠色譜系統(tǒng)分離原理及特點3.SephadexG-10凝膠色譜法分離β-內(nèi)酰胺抗生素中高分子雜質(zhì)概況:在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中，理論上β-內(nèi)酰胺抗生素三聚體以上高分子雜質(zhì)均集中在Kav=0色譜峰中；調(diào)整各種色譜條件，既可使β-內(nèi)酰胺抗生素寡聚物（如青霉素類抗生素二聚物等）和其它高分子雜質(zhì)分離，又可使其二者合二為一，所以可用于不一樣分析目標。9/24/202432內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第32頁高分子雜質(zhì)分析方法三、色譜條件對β-內(nèi)酰胺類抗生素在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中色譜行為影響9/24/202433內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第33頁色譜條件影響1.流動相離子強度對溶質(zhì)保留行為影響:流動相離子強度和色譜行為即使并無直接聯(lián)絡，但普通說來，當流動相中離子種類不改變時，離子強度越大，β-內(nèi)酰胺類抗生素Kav值越大。

9/24/202434內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第34頁在被測物濃度較高時,流動相中應含有足量緩沖鹽以改進色譜峰形和分離效果。有研究表明,在流動相中添加中性鹽如氯化鈉或增加緩沖液濃度后,均使離子強度增加,使β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)得到有效分離。9/24/202435內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第35頁色譜條件影響2.流動相種類對溶質(zhì)色譜行為影響:慣用流動相有:檸檬酸緩沖液、硫酸銨緩沖液、磷酸緩沖液、醋酸緩沖液等。改變流動相中緩沖液種類，能夠改變?nèi)苜|(zhì)色譜行為，對β-內(nèi)酰胺類抗生素，表現(xiàn)為其Kav值改變及色譜峰型改變。

9/24/202436內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第36頁流動相0.1mol/L頭孢菌素Kav值頭孢他啶頭孢曲松頭孢噻吩檸檬酸緩沖液0.452.522.06硫酸銨0.361.761.45磷酸緩沖液0.311.361.42醋酸緩沖液0.270.791.00碳酸鹽緩沖液0.210.550.88硝酸鈉0.150.210.58流動相中緩沖液種類對頭孢菌素色譜行為影響9/24/202437內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第37頁測定次數(shù)緩沖鹽0.1mol/L理論板數(shù)拖尾因子1磷酸緩沖液31911.43檸檬酸緩沖液23852.542磷酸緩沖液41211.43檸檬酸緩沖液31202.40流動相對頭孢他啶高分子雜質(zhì)色譜行為影響9/24/202438內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第38頁分析證實,影響這種改變決定原因是緩沖液中陰離子種類,陰離子所帶負電荷越多,溶質(zhì)Kav值相對越大,色譜峰也越易拖尾。9/24/202439內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第39頁色譜條件影響3.流動相pH影響對于弱酸,流動相pH值越小,組分k值越大,當pH值遠遠小于弱酸pKa值時,弱酸主要以分子形式存在；對弱堿,情況相反。當流動相中有多元酸/鹽存在時,pH經(jīng)過影響多元酸解離,改變緩沖液中陰離子類型,來改變?nèi)苜|(zhì)保留時間。9/24/202440內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第40頁色譜條件影響4.洗脫速度影響流速越大,溶質(zhì)保留值減小。反之,溶質(zhì)保留值增大。這是因為流速較快時,溶質(zhì)分子進入凝膠顆粒內(nèi)部概率減小,造成與葡聚糖凝膠相互作用機會降低之故。9/24/202441內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第41頁色譜條件影響5.溶質(zhì)保留值和半峰寬關系β-內(nèi)酰胺抗生素在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中半峰寬與其保留時間均呈線性關系。也就是說,保留時間越大,半峰寬越大,峰型越難看。9/24/202442內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第42頁第三節(jié)分子排阻色譜法中國藥典版二部要求,分子排阻色譜法是依據(jù)待測組分分子大小進行分離一個液相色譜技術,其分離原理即為凝膠色譜柱分子篩機制。β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)測定采取分子排阻色譜法。9/24/202443內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第43頁本身對照外標法原理——在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中,因為SephadexG-10排阻分子量僅為700道爾頓,所以,除部分寡聚物外,β-內(nèi)酰胺抗生素中高分子雜質(zhì)在色譜過程中均不保留；即全部高分子雜質(zhì)表現(xiàn)為單一色譜峰,其kav=0。

9/24/202444內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第44頁本身對照外標法在特定條件下,β-內(nèi)酰胺抗生素因為分子間氫鍵、靜電、疏水相互作用等次級相互作用,能夠形成締合物,造成其表觀分子量增大。此時,在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中和高分子雜質(zhì)含有相同色譜行為,即在kav=0處表現(xiàn)為單一色譜峰。9/24/202445內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第45頁本身對照外標法測定方法——利用以上所述原理,在SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中,以藥品本身為對照品,測定其在特定條件下締合時峰響應指標；再改變色譜條件,測定樣品高分子雜質(zhì)和藥品分離后,kav=0處高分子雜質(zhì)峰響應指標；按外標法計算,既得藥品中高分子雜質(zhì)相當于藥品本身相對含量。流動相B：水流動相A：磷酸鹽緩沖液9/24/202446內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第46頁為何采取本身對照外標法？定量分析法理論基礎：經(jīng)過檢測器物質(zhì)量與檢測器響應信號成正比，其檢測器響應能夠是面積或峰高。含量響應值(A或H)定量方法:外標法內(nèi)標法峰面積歸一法主成份對照法9/24/202447內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第47頁1.外標法以待測物質(zhì)對照品為參考物,依據(jù)供試品量和對照品量以及對應響應信號進行定量方法。高聚物對照品較難制備,即使制備高聚物對照品因為不穩(wěn)定也較難保留,而且不一樣批制備對照品極難同質(zhì)。β-內(nèi)酰胺抗生素高分子雜質(zhì)含有高度不均一性和不確定性。9/24/202448內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第48頁2.歸一化法將測得色譜圖上,全部色譜峰面積求和,與每個色譜峰面積相比較,即得每個色譜峰百分比,把全部色譜峰百分比相加即得100%,稱為峰面積歸一化。對于高分子雜質(zhì)來說,其含量和藥品本身含量相差甚遠,測量誤差較大。9/24/202449內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第49頁高分子雜質(zhì)樣品主峰9/24/202450內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第50頁3.內(nèi)標法內(nèi)標法是結(jié)合了峰面積歸一法和外標法優(yōu)點一個方法,它在加入內(nèi)標后,按峰面積歸一法分析方法進行分析,這就防止了因為進樣一致性及樣品歧視效應造成偶然誤差,因而,它分析精密度也是比較高,是氣相色譜一個比較理想定量分析方法。9/24/202451內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第51頁4.主成份對照法因為SephadexG-10凝膠色譜分離系統(tǒng)柱效較低,進樣微量藥品極難表現(xiàn)出眾譜峰。9/24/202452內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第52頁基本分析方法9/24/202453內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第53頁儀器1.恒流泵1）轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速范圍:0.1-120rpm,正反轉(zhuǎn)可逆

2）調(diào)速方式:無級調(diào)速配以線性數(shù)碼旋鈕連續(xù)可調(diào)

3）速度分辯率:30rpm以下為0.1rpm，30rpm以上為1rpm硅膠管

1）粗細適當2）壁厚1.5mm3）耐磨9/24/202454內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第54頁儀器2.玻璃層析柱合理選擇層析柱長度和直徑，是確保分離效果主要步驟，理想層析柱直徑與長度之比普通為1:25～1:100.9/24/202455內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第55頁儀器3.檢測器β-內(nèi)酰胺抗生素通常都有較顯著紫外吸收特征,所以測定中普通選擇紫外檢測器,通慣用到檢測波長是254nm。9/24/202456內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第56頁儀器3.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

積分儀選擇性統(tǒng)計,進行積分處理和定量計算色譜工作站色譜控制\數(shù)據(jù)采集\統(tǒng)計\計算\分析\圖譜保留\試驗結(jié)果編排\打印于一體9/24/202457內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第57頁系統(tǒng)適用性試驗1.以藍色葡聚糖保留時間來表示高分子雜質(zhì)保留特征,考查對照品色譜峰及高分子雜質(zhì)色譜峰與藍色葡聚糖溶液色譜峰保留時間比值均應不超出某一程度。中國藥典要求是0.93～1.07。對照品峰和供試品溶液聚合物峰與對應色譜中藍色葡聚糖峰保留時間比值也是0.93～1.07。9/24/202458內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第58頁流動相A:磷酸鹽緩沖液流動相B:水5.3495.1869/24/202459內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第59頁2.理論板數(shù)在兩種流動相系統(tǒng)中,按藍色葡聚糖峰計算,理論板數(shù)均大于700。9/24/202460內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第60頁3.拖尾因子在兩種流動相系統(tǒng)中,按藍色葡聚糖峰計算,拖尾因子均小于2.0。9/24/202461內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第61頁4.重復性RSD考查對照品在流動相B系統(tǒng)中重復進樣后峰面積相對標準偏差應符合要求。9/24/202462內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第62頁流動相B:水測定對照品，在Kav=0處表現(xiàn)為單一色譜峰，以藥品本身為對照品，測定這一條件下締合時峰響應指標。5.305測定過程9/24/202463內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第63頁流動相A:磷酸鹽緩沖液測定供試品，測定樣品中高分子雜質(zhì)和藥品分離后，Kav=0處高分子雜質(zhì)峰響應指標。5.3459/24/202464內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第64頁影響準確測定若干原因1.峰響應值選擇2.檢測器類型及其線性范圍3.進樣量影響4.對照品異質(zhì)性影響9/24/202465內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第65頁分離度定義:分離度是指高分子聚合物與藥品單體之間分離程度（或分離能力）。Hp——次高峰到基線高。Hv——次高峰與最大峰曲線分離最低點到基線高。

9/24/202466內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第66頁分離度影響原因1.凝膠對藥品吸附作用強弱與結(jié)構相關2.與洗脫劑組成相關3.與流動相離子強度相關4.與流動相pH相關5.與流動相流速相關9/24/202467內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第67頁第四節(jié)SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)相關試驗技術1.凝膠預處理凝膠:溶膠或溶液中膠體粒子或高分子在一定條件下相互連接，形成空間網(wǎng)狀結(jié)構，結(jié)構空隙中充滿了作為分散介質(zhì)液體（在干凝膠中也能夠是氣體），這么一個特殊分散體系稱作凝膠。沒有流動性。內(nèi)部常含有大量液體。葡聚糖凝膠屬于彈性凝膠彈性凝膠失去分散介質(zhì)后，體積顯著縮小，而當重新吸收分散介質(zhì)時，體積又重新膨脹。9/24/202468內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第68頁凝膠粒度選擇:普通來說，細顆粒分離效果好，但流速慢；而粗顆粒流速快，但會使區(qū)帶擴散，使洗脫峰變平而寬。所以，如用細顆粒凝膠宜用大直徑層析柱，用粗顆粒時用小直徑層析柱。在實際操作中，要依據(jù)工作需要，選擇適當顆粒大小并調(diào)整流速。

9/24/202469內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第69頁凝膠溶脹方法:稱取葡聚糖凝膠，遲緩地傾倒入5～10倍去離子水中或蒸餾水，攪拌均勻，在室溫溶脹6小時，或沸水浴溶脹

2小時，普通采取后一個方法（能除去凝膠中污染細菌，同時排除氣泡）。再用傾瀉法除去凝膠上層水及細小顆粒，用蒸餾水重復洗滌幾次，最終減壓抽去溶液及凝膠顆粒內(nèi)部氣泡，準備裝柱。商品凝膠是干燥顆粒,使用時需經(jīng)溶脹處理,依據(jù)所需凝膠體積,預計所需干膠量。普通葡聚糖凝膠吸水后凝膠體積約為其吸水量2倍,比如SephadexG-20吸水量為20,1克SephadexG─20吸水后形成凝膠體積約40ml。

9/24/202470內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第70頁凝膠再生:對于不銹鋼色譜柱其方法是:先用水重復進行逆向沖洗，再用緩沖溶液平衡，即可進行下一次分析。

對于玻璃層析柱其方法是:將凝膠從柱柱中取出，將已使用過凝膠先用0.2mol/L氫氧化鈉與0.2mol/L氯化鈉混合液浸泡半小時后，用水洗至中性，再裝柱。對于長久不使用硅膠其方法是:將洗好凝膠用50%乙醇浸泡，抽干，然后，依次用75%、95%和無水乙醇浸泡抽干，最終用乙醚浸泡抽干置37℃烘干后，即可長久保留。9/24/202471內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第71頁2.裝柱取層析柱一根,底部用玻璃纖維或砂蕊濾板襯托,并要求濾板下體積盡可能小。將柱垂直至于鐵架上,然后在柱頂連接一長頸漏斗（漏斗頸直徑約為柱直徑二分之一）。在柱中加水或洗脫液,并趕凈濾板下方氣泡,使支持濾板底部完全充滿液體,然后將柱出口關閉。把已經(jīng)溶脹好凝膠調(diào)成薄漿,從漏斗倒入柱內(nèi),膠粒逐步擴散下沉,薄漿連續(xù)加入。9/24/202472內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第72頁裝柱關鍵點:1）凝膠漿濃度應適宜（普通為70%水混懸液），分散均勻不結(jié)團（不宜強烈攪拌）。2）一根理想凝膠柱要求柱中填料(凝膠)密度均勻一致，沒有空隙和氣泡。3）通常新裝凝膠柱用適當緩沖溶液平衡后，將帶色蘭葡聚糖–溶液過柱，觀察色帶是否均勻下移，以判定新裝柱技術質(zhì)量是否合格，不然，必須重新裝填。9/24/202473內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第73頁3.加樣加樣方法:凝膠床經(jīng)平衡后，吸去上層液體，待平衡液下降至床表面時，關閉流出口，用滴管加入樣品液，打開流出口，使樣品液遲緩滲透凝膠床內(nèi)。當樣品液面恰與凝膠床表面持平時，小心加入數(shù)mL洗脫液沖洗管壁。然后繼續(xù)用大量洗脫液洗脫。9/24/202474內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第74頁加樣量:加樣量與測定方法和層析柱大小相關。假如檢測方法靈敏度高或柱床體積小，加樣量可??；不然，加樣量增大。普通來說，加樣量越少或加樣體積越小(樣品濃度高)，分辨率越高。通常樣品液加入量應掌握在凝膠床總體積5％～10％。樣品體積過大，分離效果不好。

9/24/202475內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第75頁4.洗脫加完樣品后,將層析床與洗脫液儲瓶、檢測儀、及統(tǒng)計儀相連,依據(jù)被分離物質(zhì)性質(zhì),預先預計好一個適宜流速。凝膠柱層析普通都以單一緩沖溶液或鹽溶液作為洗脫液,有時甚至可用蒸餾水。洗脫時用于流速控制裝置最好是恒流泵。9/24/202476內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第76頁色譜柱維護保養(yǎng)玻璃層析柱:1.裝柱要均勻，不要過松也不要過緊，最好也在要求操作壓下裝柱，流速不宜過快，防止所以而壓緊凝膠。但也不要過慢，使柱裝得太松，造成層析過程中，凝膠床高度下降。2.一直保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，不然水分揮發(fā)，凝膠變干。9/24/202477內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第77頁色譜柱維護保養(yǎng)3.葡聚糖凝膠耐受壓力為0.3兆帕，過高壓力會損傷填料性能。4.預防柱長霉:可用20%乙醇或0.04%疊氮鈉保留。5.預防柱受污染:可用0.2mol/L氫氧化鈉與0.2mol/L氯化鈉混合液清洗。9/24/202478內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第78頁色譜柱維護保養(yǎng)不銹鋼色譜柱:1.在高于室溫條件下使用時，不要在測量完成馬上停泵，應該是繼續(xù)通流動相直到色譜柱溫度低于室溫為止。假如在色譜柱很熱時候停泵，當流動相冷卻過程中色譜柱就會進入氣泡。9/24/202479內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第79頁色譜柱維護保養(yǎng)2.若色譜柱在短期內(nèi)不再使用,應用蒸餾水將含鹽流動相從色譜柱中替換掉,將色譜柱從儀器上取下,擰上塑料堵頭。3.色譜柱長久不用,應在4℃儲備。若儲備溫度低于0℃,則會降低柱效。4.防止陽光直射,防止與腐蝕性氣體接觸。9/24/202480內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第80頁總結(jié)反抗生素中高分子雜質(zhì)分析依據(jù)不一樣品種特點和不一樣質(zhì)控要求靈活掌握,優(yōu)先采取凝膠色譜法,但不排除其它驗證良好其它分析系統(tǒng)應用,對不一樣品種,視分離情況和分離要求,將SephadexG-10和高效凝膠色譜系統(tǒng)綜合應用。9/24/202481內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第81頁總結(jié)高效、快速、簡便是抗生素高分子雜質(zhì)測定方法發(fā)展目標,也是必定趨勢。在版中國藥典中,發(fā)展較為完善SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)對多個品種抗生素高分子雜質(zhì)控制有著主要意義?，F(xiàn)在已經(jīng)有專門β-內(nèi)酰胺抗生素聚合物測定儀,對β-內(nèi)酰胺抗生素高分子聚合物檢驗方法研究將起到推進作用。9/24/202482內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第82頁復習題一、1.β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì):對藥品中分子量大于藥品本身雜質(zhì)總稱。其分子量普通在1000～5000，個別可至約10000道爾頓。2.分離度:是指高分子聚合物與藥品單體之間分離程度（或分離能力）。9/24/202483內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第83頁復習題1.β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)按其起源分為:和。（外源性雜質(zhì)、內(nèi)源性雜質(zhì)）2.青霉類抗生素高分子雜質(zhì)有雜質(zhì)和兩大類。（蛋白（多肽）類雜質(zhì)、聚合物雜質(zhì)）3.青霉類抗生素樣品在儲存過程中，多肽類雜質(zhì)不停生成，其反應速度與和相關。（水分含量、儲存溫度）4.β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)含有性和性。5.青霉素聚合反應速度在溶液條件下和關系親密；在固體條件下主要和含量相關。(溶液酸堿度、樣品水分)6.葡聚糖凝膠耐受壓力為，過高壓力會損傷填料性能。(0.3兆帕)7.色譜柱在短期內(nèi)不再使用，應用將含鹽流動相從色譜柱中替換掉，將色譜柱從儀器上取下，擰上塑料堵頭。（蒸餾水）8.色譜柱長久不用，應在儲備。若儲備溫度低于0℃，則會降低柱效。（4℃）9/24/202484內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第84頁復習題1.內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定中影響分離度原因（ABCD）A.與洗脫劑組成相關B.與流動相離子強度相關C.與流動相PH相關D.與流動相流速相關2.當流動相中離子種類不改變時，離子強度越大，β-內(nèi)酰胺類抗生素Kav值（B）。A.越小B.越大C.不變D.沒有影響3.當改變流動相離子種類時，其Kav值會隨之改變，決定這種改變原因是流動相中陰離子種類，陰離子所帶負電荷越多，溶質(zhì)Kav值相對（B）A.越小B.越大C.不變D.沒有影響4.在色譜過程中，除分子排阻作用外，凝膠對藥品分子吸附作用與對高分子雜質(zhì)吸附作用相比（C）A.小于B.等于C.大于D.不一定9/24/202485內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第85頁復習題1.簡述影響β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)形成原因？1)青霉素聚合物聚合反應速度在溶液條件下和溶液酸堿度關系親密；在固體條件下主要和樣品水分含量相關。2)頭孢菌素聚合物固體狀態(tài)下頭孢菌素類產(chǎn)品聚合速度與含水量和貯存溫度關系親密。貯存溫度較低時，含水量差異對聚合物含量盡管有影響，但影響不大；但當貯存溫度上升至37℃時，含水量差異對聚合物含量影響十分顯著。9/24/202486內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測定法第86頁復習題2.簡明說明凝膠色譜分離原理？利用凝膠色譜分子篩機制，但凝膠孔徑要比分子篩大得多，普通為幾百至幾千埃。讓藥品分子自由進入凝膠顆粒內(nèi)部，而全部高分子雜質(zhì)被排阻，進而實現(xiàn)讓全部高分子雜質(zhì)含有相同保留時間構想。9/24/202