DB23T 3733-2024 紅松無性系SSR鑒別技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.01CCSB60

DB23黑 龍 江 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB23/T3733—2024紅松無性系SSR鑒別技術(shù)規(guī)程2024-8-30發(fā)布 2024-9-29施黑龍江省市場監(jiān)督管理局 發(fā)布DB23/T3733—2024DB23/T3733—2024前 言GB/T1.1-20201本文件由黑龍江省林業(yè)和草原局提出。本文件由黑龍江省林業(yè)和草原局標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本文件起草單位：東北林業(yè)大學(xué)、佳木斯市孟家崗林場、葦河林業(yè)局青山林木種子園、寧安市渤海林木種子園、五常市寶龍店種子林場、鶴崗市林木良種繁育中心。本文件主要起草人：張含國、閆平玉、張磊、孫國飛、潘鳳剛、李金泉、石寶英、胡振宇、曹振宇、李志新。DB23/T3733—2024DB23/T3733—2024PAGEPAGE1紅松無性系SSR鑒別技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了紅松（PinuskoraiensisSiebold&Zucc.）無性系SSR鑒別技術(shù)中技術(shù)原理、儀器設(shè)備及試劑、溶液配制、操作程序、數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計、判定規(guī)則及檔案管理等要求。本文件適用于紅松無性系的SSR指紋數(shù)據(jù)采集及品種鑒定。下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法下列術(shù)語和定義適用于本文件?？焖?、準(zhǔn)確、穩(wěn)定鑒定無性系的SSR引物。核心引物檢測出不同無性系差異位點數(shù)小于2時可選擇的引物。DNA：DeoxyriboNucleicAcidPCR：PolymeraseChainReactionSequenceRepeatsDiamineAcidtriphosphatePAGE：PolyacrylamideGelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝膠電泳。CTAB：HexadecyltrimethylammoniumBromide十六烷基三甲基溴化銨。TBE：Tris-Borate-EDTAbuffer-硼酸-乙二胺四乙酸二鈉緩沖液。由于不同紅松無性系遺傳組成不同，基因組DNA中SSR的重復(fù)次數(shù)存在廣泛差異。簡單重復(fù)序列差異可以通過PCR擴(kuò)增及電泳方法進(jìn)行檢測，從而區(qū)分不同紅松無性系。PR擴(kuò)增儀；電泳儀（具有恒電壓、恒電流功能；垂直電泳槽及配套的制膠附件；水平電泳槽及配（1500g（0.125、20、20、100L800（含2+25oL；NPAA標(biāo)準(zhǔn)；核酸染色劑；去離子甲酰胺；溴酚藍(lán)；二苯甲青；甲叉雙丙烯酰胺；丙烯酰胺；硼酸；無水乙醇；DNA0.5oLCI25L（3~800。TE：1mol/LTris-HCl5mL，0.5mol/L1mL0.5mol/LHCIpH8.0500mL。0.5mol/L186.1g800mLpH8.0，1L1mol/LTris-HCI溶液：60.55g三羥甲基氨基甲烷溶于適量水中，加0.5mol/LHCI溶液調(diào)pH至8.0定容至500mL，高壓滅菌。81.7g20g1mol/LTris-HCl100mL，0.5mol/L401L，4℃PCRSSR引物：用超純水分別配制前引物和后引物終濃度均10μmol/L的工作液。（×9，0.5oL的A1L.125g0.125g。30%PAGE膠：丙烯酰胺290g，甲叉雙丙烯酰胺10g，定容至1L。7%PAGE膠：10×TBE50mL，30%PAGE膠233.3mL，定容至1L。25%過硫酸銨溶液：0.25g過硫酸銨溶于1mL超純水中。TE（0×108g550.5oLDA溶液37L1L。TE（.：0TE0L1L。染色液：1g硝酸銀，定容至1L。1L15g5mL（。銀染溶液的配制使用符合GB/T6682中4.3規(guī)定的三級水，試驗過程使用符合分析純的試劑和GB/T6682中4.3規(guī)定的一級水。送檢樣品宜為一年生針葉，-80℃超低溫冷凍保存。同一紅松無性系樣品數(shù)量應(yīng)大于5個。DNA使用CTAB提取法，或適合SSR指紋技術(shù)的商業(yè)試劑盒進(jìn)行DNA提取。瓊脂糖凝膠（1%）電泳檢測DNA質(zhì)量并進(jìn)行濃度測定，稀釋至20ng/μL充分溶解后備用。PCR引物信息包括核心引物信息和補充引物信息。選擇使用核心引物進(jìn)行檢測，核心引物信息見附錄A.1。當(dāng)檢測出不同無性系差異位點數(shù)小于2時，選擇使用補充引物進(jìn)行檢測，補充引物信息見附錄A.2。PCR反應(yīng)采用20μL體系。943min，19430s，51~6030s，7215s3572℃延伸7min，4℃保存。PCR將玻璃板擦洗干凈，雙蒸水擦洗2遍，95%乙醇擦洗2遍，干燥。待玻璃板徹底干燥后組裝電泳板，調(diào)平。在40mL7%PAGE膠中加入TEMED和25%過硫酸銨各60μL，迅速混勻后勻速灌膠，以防出現(xiàn)氣泡，在上部插入梳子，使其聚合1h，凝膠規(guī)格為186mm×95mm×1mm。拔去梳子后，使用移液器吹吸點樣孔，清除氣泡和雜質(zhì)，每一個加樣孔點入1μL混合有加樣緩沖液（終濃度為1×）的樣品，180V恒電壓電泳1h。電泳結(jié)束后分開兩塊玻璃板，取下凝膠。150bp300bp染色：凝膠置于染色液中水平搖動染色8min；漂洗：雙蒸水快速漂洗15s;顯影：凝膠置于染色液中水平搖動至帶紋出現(xiàn)；漂洗：雙蒸水漂洗1min。X/XX/YXY0/0。對送檢樣品進(jìn)行分析時，直接進(jìn)行無性系之間的對比，如果送檢樣品某個引物位點出現(xiàn)可見的異質(zhì)性10DNADNA在各引物位點的基因型以及樣品在各引物位點的等位變異，并統(tǒng)計其在各引物位點的各種基因型（或等位變異。2=1=0對于利用附錄A.1中核心引物未能檢測到≥2個差異位點的無性系，應(yīng)選擇附錄A.2中補充引物進(jìn)行鑒別。；。應(yīng)建立技術(shù)檔案，內(nèi)容包括無性系來源、定植地點、無性系名稱、檢測日期、基因型數(shù)據(jù)、判定結(jié)果等。附錄A引物信息表包括核心引物信息表，見表A.1，補充引物信息表，見表A.2。表A.1核心引物信息表位點名稱引物序列預(yù)期片段大小/bp退火溫度/℃參考無性系基因型ALBI_160F:TGTTATTGCTAACGGAGATGGR:TTTTCTATTGTAGACAGTGTCGTCTT21553渤海省67215/215EPD11F:GTGGATGCAATGAAGAAAAACATR:ACGAATTGCAAAACTGCATAACT138-14553渤海省10138/145鶴崗5138/138葦青1號028140/143EPD12F:CTAAAGGAAACTCGAAACCCTTGR:ATGTCGATGATGATGAGGATGAT140-14455小北湖007142/142葦青2號042140/144EPD32F:CCTGCTAAAATTCATCTACATCCCR:AAAGCGAGGAAAATTTGCAGTAT150-15655渤海省51150/150渤海省69150/156葦青2號042154/156EPD70F:AGGCTTTAGTTTTTCAAATCCCAR:AAGTTGTTTGCTCGACTGTTAGC140-14555小北湖024140/140小北湖007140/145P49F:GAGATGAGCGAATCTGGGR:TACAAGTTCCACCTACGG290-29452小北湖007290/294小北湖024294/294鶴崗29290/290P70F:CAACATCGCCAATGACTCR:CCTACCTACGCTCTGCTC296-30254渤海省71298/300渤海省73302/302渤海省92296/296渤海省93296/298P72F:TGGGTTACCACCTTTAGCR:CAATCAGAGTCTGGAGCA200-20852渤海省008200/202小北湖024202/208渤海省51208/208葦青5號074200/208P79F:CCACCGCCAAGTCCATTAR:GCTTTGTTAGCCGTCCAG200-20355渤海省69203/203渤海省71200/200葦青1號028200/203P82F:GGAAGATGAATCGCAAACCR:ACACCCGCCTGAAGAGCA284-29054小北湖007284/290小北湖024290/290葦青5號074287/290P90F:R:141-14756渤海省70145/145渤海省71145/147孟家崗090141/145表A.2補充引物信息表位點名稱引物序列退火溫度/℃P11F：TGAGAATGAGGCGAACTGR：GAAGGAAAGGTAAGGTGGA53P25F：AAAGTTCACATTGGCACATCR：TCAGTCCAGCGACAACAG55P44F：TTTCGGTTCTCAGGCTCTR：CCCTGGTGGTACAATGAC53P47F：GTTTCCGAGATTCCCAGACR：CAGTAGTAATATCCCGTTT51P60F：AAACGCAGAGTGGAGGAAR：AACTCGGAGCATTTGGTG52P62F：AGTGGTCTACGCTGGAGTR：AACATTTAGGTCTTGGAGG51P63F：GCAGCAGATCAGAGGGAGR：CAGCCAACAACTGGTCATAC56P67F：TGAACGCACAGGCAAGTTR：GCGAAGGCAATGGTGAAA52P74F：ACGCTACCGATTCTTACCR：GTGTTCGCCTACAACTCAT52P92F：ACTTTGCGTGAATCAGACCR：AAAGTAAGGCTGCTTGCATGA53P010F：AATAAAGGAACTTACAGAGCR：GAACTTAGAAATAGGGTAGAA50P019F：AGAGCGTAAAACAGTTCAGTCR：ATGTCACCATTCCACTTGTC54P021F：TAGCGAAGGAAAAGGAGGTTR：CCAATGATTGAAGATGGTGA50P035F：TGTGGGTTTTTAGCAAGTAGGCR：ATACGTGAGTGGTGCTCTAT50P038F：ATTGTGAAGGTTCCTGCTGR：AGGTTTATGGTTTGGTGCT50P040F：ATATGACCTTGGGACATCTTR：CTACGCTTGAGTTATTCTTG50P042F：ATGGGATTGTGGTATGGTGR：TGAATTGAAGCGCAGTTAT51P044F：TATGTGCTTAGTGGTGAGR：AAAGATTGAGGAGTTGAA50P050F：TTACATAATACCTCATCCGTR：TGTGAACTCCATAGATTTAGA50P053F：GCCGTTGGCTCTGGAAATGAR：ATTGCCCTAGTGGGGACCTT50P056F：TAGAAACATTCCCTAAAACAAGR：GAAACAAACACCGAAATAGTC50Q010F：GGTTGCAAAAGGAATTGATAR：TTACTTAGGTAGGCAGGGTG50Q030F：CTTCTATGATATTGGTTCCTR：AGATGGAGATAAACTGAAGG50Q033F：TCTTTGTCGATCACCCTTTCR：TTGATTGTTTGCACTAAATG57Q059F：CAGGTGCCTTGGAAGAGGTTR：GGTGGAGAAATACGGGAGTG54Q069F：GGAGAAAAGGATGGTGAAAGR：GAGATGCAAAGACAGGGTGC50Q083F：AAAAGGGAGATGAAAGGTCAR：GAAACATACTCGAAGGGAAA50Q092F：CATGTCTCAAAAGACGTGATR：GAAATAGTTGGAGCAAGTGT50Q103F：TGATTGTTTGCACTAAATTCR：ACCCTCCATCCATATCTATA50Q141F：CTCTTTGTCAATCCCTCCTCR：GATAGCCAGAGTGACAAGGG50附 錄 (資性)數(shù)據(jù)統(tǒng)計樣表樣品ALBI160EPD11EPD12EPD32EPD70P49P70P72P79P82P901*/**/**/**/**/**/**/**/**/**/**/*2*/**/**/**/**/**/**/**/*