DB23T 3767-2024奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建技術規(guī)程

ICS65.020.30CCSB44232024-08-30發(fā)布IDB23/T3767—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由黑龍江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件起草單位：黑龍江八一農(nóng)墾大學、東北農(nóng)業(yè)大學、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院。本文件主要起草人：鄭家三、劉云、邵廣、張鶴飛、周志新、葛延松、徐恩爽、韓歡勝、王崢、孫悅、楊春雪、田雪。DB23/T3767—2024近年來，在市場和政策的推動下，以及地處北緯43～53°世界公認的黃金“奶牛帶”這一得天獨厚的資源優(yōu)勢，黑龍江省奶牛規(guī)模養(yǎng)殖發(fā)展速度迅速，隨之而來的是一些奶牛群發(fā)生產(chǎn)疾病特別是奶牛肢蹄病的發(fā)病率呈上升趨勢，對我省奶牛養(yǎng)殖行業(yè)的健康發(fā)展造成了巨大的威脅。在奶牛肢蹄病中蹄病發(fā)病率約占90%以上，根據(jù)表現(xiàn)形式可分為感染性和非感染性兩類，常見的感染性蹄病主要包括腐蹄病、蹄趾皮炎和趾間皮炎等，奶牛蹄病一直是困擾奶牛健康養(yǎng)殖的難題，深入闡明奶牛蹄病的病原易感性及其炎癥發(fā)生機制是十分必要的。以往對奶牛蹄部感染性疾病的研究往往采用活體實驗，不僅給實驗帶來諸多不便，而且實驗成本高昂，更重要的是違背動物福利原則，因此尋找一種可替代的離體實驗模型具有重要的現(xiàn)實意義，基于以上目的，本文件提出構(gòu)建奶牛趾間皮膚外植體。3DB23/T3067—2024奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建技術規(guī)程本文件規(guī)定了奶牛趾間皮膚外植體的來源、采樣、構(gòu)件材料、活性檢測方法、構(gòu)建成功評定方法的要求。本文件適用奶牛趾間皮膚外植體的構(gòu)建。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB16568-2006奶牛場衛(wèi)生規(guī)范DB2306/T096-2019《奶牛蹄部疾病診斷技術規(guī)程》DB23/T1618-2015奶牛蹄保健技術規(guī)范DB61/T367.16-2022荷斯坦牛生產(chǎn)技術規(guī)范第16部分：肢蹄病防治GB/T27830-2011化學品體外皮膚腐蝕人體皮膚模型試驗方法SN/T4577-2016化妝品皮膚刺激性檢測重建人體表皮模型體外測試方法JY0315-1991皮膚結(jié)構(gòu)模型技術條件3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1皮膚外植體從活體動物切取下來進行培養(yǎng)的皮膚組織。4要求4.1外植體皮膚來源要求4.1.1以新屠宰的奶牛后蹄趾間皮膚為外植體皮膚來源。4.1.2外植體所用的皮膚需從無蹄部疾病且蹄型結(jié)構(gòu)良好的奶牛后蹄蹄叉處采集。4.2人員要求4.2.1具有扎實的獸醫(yī)外科專業(yè)知識，且熟練掌握獸醫(yī)外科手術操作技能。4.2.2熟練掌握組織/細胞培養(yǎng)技術。4.2.3熟練掌握病理組織學和免疫組織化學技術并具有分析病理組織切片的能力。4.3采樣要求4DB23/T3067—20244.3.1使用的外科手術器械應經(jīng)過嚴格消毒、滅菌。4.3.2樣品采集過程保證無菌操作。5奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建材料5.1主要材料奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建所用耗材見附錄A。5.2主要設備奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建所用主要設備見附錄B。5.3奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建方法5.3.1培養(yǎng)基配制5.3.1.1運輸培養(yǎng)基每100mL運輸培養(yǎng)基中，含有青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液（100×)1mL、L-谷氨酰胺溶液1mL、5μg/mL硫酸慶大霉素9μL，余量為DMEM/F121:1培養(yǎng)基。5.3.1.2洗滌培養(yǎng)基每100mL洗滌培養(yǎng)基中，含有青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液（100×)1mL、2μg/mL硫酸慶大霉素4μL，余量為DMEM/F121:1培養(yǎng)基。5.3.1.3組織培養(yǎng)基每100mL洗滌培養(yǎng)基中，含有青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液（100×)1mL、L-谷氨酰胺溶液1mL、5μg/mL硫酸慶大霉素10μL，胎牛血清10mL，DMEM高糖培養(yǎng)基65.993mL，余量為DMEM/F-121:1培養(yǎng)基。5.3.2樣本的采集選取無蹄部疾病且蹄型結(jié)構(gòu)良好的新屠宰奶牛。首先用刷子對蹄部表面進行刷洗，流水沖洗直至表面無糞便、泥土等污物附著，然后用2%葡萄糖鹽酸氯己定沖洗蹄部8～10次，隨后用75%酒精擦拭過的電推剪除去奶牛趾間皮膚被毛，用無菌手術刀片刮凈殘留毛發(fā)，75%酒精噴洗奶牛趾間皮膚8～10次后，使用8.0mm皮膚打孔器收集奶牛蹄部趾間皮膚。5.3.3運輸將收集到的奶牛趾間皮膚放入一次性無菌培養(yǎng)皿中，加入含有1%青霉素-鏈霉素的PBS磷酸緩沖溶液中，反復洗滌至沒有血液后，立即放入裝有運輸培養(yǎng)基的容器中，隨后放入裝有冰袋的保溫箱中運輸回實驗室。5.3.4奶牛趾間皮膚外植體的組裝5.3.4.1將裝有奶牛趾間皮膚的容器放入滅菌后的超凈工作臺上，取出奶牛趾間皮膚，使用無菌手術剪去除趾間皮膚多余的皮下脂肪，75%酒精涮洗3次，然后浸入預熱至37℃的洗滌培養(yǎng)基中洗滌3次，每次洗滌時間為15min。5DB23/T3067—20245.3.4.2取500μL體積分數(shù)為1.2%的瓊脂糖置于12孔培養(yǎng)板最下層作為底座，目的是為奶牛趾間皮膚外植體提供物理支撐，在其上覆蓋0.5cm2無菌手術紗布，將洗滌后的奶牛趾間皮膚置于紗布之上5.3.4.3在12孔培養(yǎng)板內(nèi)添加組織培養(yǎng)基至奶牛趾間皮膚的表皮與真皮交界處，形成氣相與液相交替的培養(yǎng)系統(tǒng)。將組裝的奶牛趾間皮膚外植體置于37℃、5%CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12h更換1次培養(yǎng)基。5.3.4.4按照本方法組裝的奶牛趾間皮膚外植體培養(yǎng)24h時表皮結(jié)構(gòu)完整，真皮層膠原纖維排列緊密，未見明顯病理變化，可用于體外研究，體外模型構(gòu)建成功。5.3.5奶牛趾間皮膚外植體活性檢測及構(gòu)建成功的評定方法奶牛趾間皮膚外植體活性檢測及構(gòu)建成功的評定方法見附錄C。圖1皮膚趾間皮膚外植體模型組裝圖6DB23/T3067—2024奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建材料奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建材料見表A.1。表A.1奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建材料7DB23/T3067—2024奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建主要設備奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建主要設備見表A.2。表A.2奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建主要設備8DB23/T3067—2024（資料性）奶牛趾間皮膚外植體活性檢測及構(gòu)建成功的評定方法C.1奶牛趾間皮膚外植體活性檢測C.1.1HE染色法檢測奶牛趾間皮膚外植體病理變化C.1.1.1皮膚組織切片制作按上述文件外植體的構(gòu)建方法培養(yǎng)0、12、24、36、48和72h后收集奶牛趾間皮膚外植體，固定于4%多聚甲醛中。將經(jīng)過甲醛固定的奶牛趾間皮膚外植體經(jīng)流水沖洗4h后，分別在75%、85%、95%、100%酒精中浸泡1h進行脫水處理，在二甲苯中浸泡1h30min進行透明處理，最后在65℃浸蠟1h30min進行包埋，包埋好的組織塊即可按需要制作石蠟組織切片。C.1.1.2HE染色按照HE染色試劑盒說明書的步驟進行染色，封片后顯微鏡下觀察組織切片，檢測奶牛趾間皮膚外植體病理變化。C.1.2Caspase-3蛋白表達檢測C.1.2.1皮膚組織切片制作同C.1.1.1。C.1.2.2免疫組化C.1.2.2.1caspase-3是細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導通路中的重要成員之一，在細胞凋亡早期被激活。FasL與靶細胞表面的Fas結(jié)合后通過Fas分子胞內(nèi)段的死亡結(jié)構(gòu)域激活caspase-8，引起caspase酶級聯(lián)反應，最后激活內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶，誘導靶細胞的凋亡；顆粒酶通過靶細胞細胞膜上穿孔素形成的小孔進入細胞內(nèi)，激活caspase-10，也能引起caspase酶級聯(lián)反應，誘導靶細胞的凋亡；線粒體損傷時，位于線粒體內(nèi)膜和外膜間的細胞色素c會被釋放到細胞質(zhì)中，與Apaf-1結(jié)合，繼而激活caspase-9，引起caspase酶級聯(lián)反應，誘導靶細胞的凋亡。由caspase-8、caspase-10和caspase-9啟動的caspase酶級聯(lián)反應都需要首先經(jīng)過caspase-3傳導凋亡信號。所以，可以通過檢測caspase-3活化的來證明發(fā)生細胞凋亡。C.1.2.2.2按照SP檢測試劑盒說明書的步驟對組織切片進行免疫組織化學染色，封片后顯微鏡下觀察，對奶牛趾間皮膚外植體中Caspase-3凋亡蛋白的陽性表達進行檢測。選取不同培養(yǎng)時期皮膚組織切片高倍（400×)視野各3張，使用Fiji/ImageJ-win64軟件對視野下的陽性細胞和總細胞進行計數(shù)，并根據(jù)公式陽性率＝陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%，計算陽性率。C.1.3TUNEL細胞凋亡檢測C.1.3.1皮膚組織切片制作同C.1.1.1。9DB23/T3067—2024C.1.3.2TUNEL染色C.1.3.2.1TUNEL染色法是通過識別發(fā)生斷裂DNA末端游離的3'-OH檢測細胞凋亡的免疫組化技術，因其操作簡單、應用范圍廣泛及檢測結(jié)果靈敏等特點已成為實驗室、動物模型和臨床研究中檢測細胞凋亡的首選方法。C.1.3.2.2按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書的步驟對組織切片進行染色，隨后封片顯微鏡下觀察，對奶牛趾間皮膚外植體中細胞凋亡的陽性表達進行檢測。選取不同培養(yǎng)時期皮膚組織切片高倍（400×)視野各3張，使用Fiji/ImageJ-win64軟件對視野下的陽性細胞和總細胞進行計數(shù)，并根據(jù)公式陽性率＝陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%，計算陽性率。C.2奶牛趾間皮膚外植體構(gòu)建成功評定方法C.2.1奶牛趾間皮膚外植體病理變化HE染色結(jié)果如圖C.1所示，對照組0h皮膚組織的表皮完整，各層結(jié)構(gòu)清晰可見；真皮層的結(jié)締組織排列規(guī)則；肌層的肌纖維緊密排列，毛囊、皮脂腺及汗腺等散在分布，真皮層中可見少量的淋巴細胞（C.1（a））。與之相比試驗組各培養(yǎng)時期皮膚組織的表皮層均發(fā)生不同程度角化過度，真皮層膠原纖維紊亂并伴有不同程度中性粒細胞浸潤等病理變化，除72h皮膚組織表現(xiàn)為中度炎癥反應外，其余均表現(xiàn)為輕度炎癥反應。12h和24h皮膚組織的表皮結(jié)構(gòu)完整，真皮層膠原纖維排列緊密，無明顯病理變化（圖C.1（b）和（c36h皮膚組織角質(zhì)層呈網(wǎng)籃狀，偶見上皮細胞變性（圖C.1（d48h皮膚組織可觀察到大量上皮細胞變性及少量上皮細胞壞死，同時伴隨細胞核固縮（圖C.1（e72h皮膚組織可見表皮脫落、缺失，毛囊、皮脂腺等皮膚附屬器官發(fā)生程度不同的壞死（圖C.1（f。HE染色結(jié)果表明，奶牛趾間皮膚外植體在培養(yǎng)24h組織結(jié)構(gòu)完整，并未出現(xiàn)明顯病理變化；培養(yǎng)36h出現(xiàn)細胞凋亡早期的變性跡象，提示此時已不適用于體外研究。標引序號說明：a～f依次為0、12、24、36、48及72h奶牛趾間皮膚外植體；藍色箭頭所指：真皮層淋巴細胞浸潤；DB23/T3067—2024黑色箭頭所指：表皮層角化過度；紅色箭頭所指：毛囊、汗腺、皮脂腺壞死；綠色箭頭所指：細胞變性、壞死，細胞核固縮。圖C.1奶牛趾間皮膚外植體病理變化（HE×200）C.2.2奶牛趾間皮膚外植體Caspase-3蛋白表達情況免疫組化結(jié)果如圖C.2所示，對照組0h奶牛趾間皮膚外植體中可見輕微的Caspase-3蛋白陽性表達；試驗組12、24、36、48和72h奶牛趾間皮膚外植體表皮及真皮中Caspase-3蛋白明顯呈陽性表達，根據(jù)分布情況可知，表皮中Caspase-3蛋白陽性表達情況高于真皮；體外培養(yǎng)72h內(nèi)奶牛趾間皮膚外植體凋亡細胞數(shù)量從0.86%上升至46.96%，說明體外培養(yǎng)時間越長，細胞凋亡陽性率越高。免疫組化結(jié)果表明，體外培養(yǎng)時間越短，細胞凋亡陽性率越低，結(jié)合HE染色結(jié)果，確定奶牛趾間皮膚外植體培養(yǎng)24h是體外研究的最佳時間。標引序號說明：a～f依次為0、12、24、36、48及72h奶牛趾間皮膚外植體；黃色為DAB顯色下Caspase-3蛋白陽性表達細胞。圖C.2奶牛趾間皮膚外植體Caspase-3蛋白表達（DAB×400）C.2.3奶牛趾間皮膚外植體凋亡細胞表達情況TUNEL染色結(jié)果如圖C.3所示，對照組0h奶牛趾間皮膚外植體可見少量細胞發(fā)生凋亡；試驗組12、24、36、48和72h的奶牛趾間皮膚外植體表皮和真皮中凋亡細胞呈明顯陽性表達，根據(jù)分布情況可知，表皮中凋亡細胞數(shù)量高于真皮；細胞凋亡陽性率