DB51∕T 3183-2024 醫(yī)用供體豬 病原微生物監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

DB51I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定科學(xué)院?四川省人民醫(yī)院、四川泰康醫(yī)院、南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院、海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院、華愛(ài)迪眼科醫(yī)院、四川省機(jī)械研究設(shè)計(jì)院（集團(tuán)）有限公司、四王毅、陳剛、楊恒鈺、竇科峰、田偉、鐘浩、李鑫、姚曉明1醫(yī)用供體豬病原微生物監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范GB/T36789動(dòng)物狂犬病病毒核酸NY/T564豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)NY/T573動(dòng)物弓形蟲(chóng)病診斷技術(shù)2WS/T269布魯氏菌病診斷通過(guò)生物工程技術(shù)獲得，用于提供醫(yī)療用途的活器官或生物材料制備的低免疫原性豬及群體。4代孕母豬病原微生物篩查病，包括豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病、豬細(xì)小病毒5.1采樣將無(wú)菌采樣管移入隔離器內(nèi)，重新罩上傳遞通道的內(nèi)側(cè)密封5.1.3.1肛拭子采集5.1.3.2糞便標(biāo)本采集5.1.3.3鼻拭子采集3樣本應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè)，在24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)的樣本可置于2℃~8℃保存；24小時(shí)內(nèi)無(wú)法檢測(cè)的樣本則5.2微生物監(jiān)測(cè)4無(wú)菌條件下，取飲用水1mL，經(jīng)0.45μm薄膜過(guò)濾法處理，采用R2A瓊脂培養(yǎng)基，30℃~35℃培充分混勻，靜置10min。取上清液1mL，分別接種到胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、腦心浸液肉湯（BHI）和硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FT），30℃~35℃培養(yǎng)3天～5天。5夜排出殘留消毒液。并運(yùn)行24h以上，利用無(wú)菌拭子對(duì)隔），豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、腦心浸液肉湯（BHI）和硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FT），30℃~35℃培養(yǎng)3天~6根據(jù)PHEVS基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，探針在5’端標(biāo)記FAM熒光素作為報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記TAMRA，作為淬滅熒光基團(tuán)。只要這兩種熒光染料彼此靠近，報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光就會(huì)被淬滅熒光基團(tuán)吸收。在擴(kuò)增靶序列時(shí)，探針被Taq聚合酶降解，導(dǎo)致報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離。報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)將變得可檢測(cè)，并在連續(xù)的PCR循環(huán)中進(jìn)一步增A.2樣品準(zhǔn)備A.2.1樣品采集菌塑料袋（自封袋編號(hào)，置于冰盒或含有冰袋的保溫箱中，密封運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室待檢。A.2.2樣品保存樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h，若長(zhǎng)期保存應(yīng)置于-70℃超低溫冰箱中，避免A.2.3病毒核酸提取A.3cDNA模板制備按表A.1中各組分依次加入PCR反應(yīng)管，蓋緊管蓋后，瞬時(shí)離心3s，42℃水浴鍋中水浴1h；70℃水浴鍋中水浴10min；冰浴2min，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?×/7上游引物:5'-CCAGGATAAATTT下游引物:5'-AACCAGGACTAACCTTTG5'FAM-ATGTCCCCACCAAGTATGTTACAGCAAA-設(shè)置空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品各1管，每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)反應(yīng)。按表A.2中各組分依次加入PCR反應(yīng)管，蓋緊管蓋后，500r/mi1×111/2/5注1：實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混液中包含有PCR擴(kuò)增酶、擴(kuò)增注2：反應(yīng)體系中的各組分可根據(jù)不同最終反A.4.3反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)不同型號(hào)實(shí)時(shí)熒光PCR儀和所選PCR擴(kuò)增試劑體系A(chǔ).5質(zhì)量控制a)空白對(duì)照：熒光通道無(wú)熒光信號(hào)檢出，Ct值應(yīng)大b)陰性對(duì)照：熒光通道無(wú)熒光信號(hào)檢出，Cc)陽(yáng)性對(duì)照：熒光通道有熒光信號(hào)檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，A.6結(jié)果判定被檢樣品Ct值在35～40之間，應(yīng)調(diào)整模板濃度，重做熒光定量PCR。如再次8Taqman探針?lè)ㄊ歉叨忍禺惖亩縋CR技術(shù)，是利用Taq酶的5'→3’外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。由于探針與模板是特異性結(jié)合，因采樣人員應(yīng)佩戴手套、口罩、等防護(hù)裝備，保證個(gè)人安采樣人員用2根棉拭子放入無(wú)菌生理鹽水中濕潤(rùn)，使用一根拭子擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，擦拭至少3次，然后將拭子頭浸入含等滲鹽溶液的管中，尾部棄去；另一根拭子輕輕插入鼻道，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出，然后將拭子浸入同一個(gè)采樣管中，尾部棄去，用含促凝劑或不含添加劑的真空負(fù)壓采血管采集血液樣本5mL，室溫靜置30min，20rpm離心10min，收集血清于無(wú)菌螺口塑料管中。9PCMV-F:5'-TGGCACTGATACTTGACAAGCPCMV-R:5'-CTCCCGTGAAGCCGTAAA5'FAM-CAGCTTGCCCTCAAGGTGAC組分用量(μL）1×