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21/26非病毒性基因編輯載體開(kāi)發(fā)第一部分非整合型載體:質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)座子 2第二部分編輯酶遞送系統(tǒng):RNA導(dǎo)向和同源重組 4第三部分植物中非病毒載體介導(dǎo)的基因編輯 7第四部分動(dòng)物中非病毒載體介導(dǎo)的基因編輯 10第五部分臨床應(yīng)用中的非病毒載體安全性 14第六部分非病毒載體基因整合控制 16第七部分非病毒載體的規(guī)模化生產(chǎn) 19第八部分基于非病毒載體的未來(lái)基因治療前景 21
第一部分非整合型載體:質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)座子關(guān)鍵詞關(guān)鍵要點(diǎn)質(zhì)粒DNA
*環(huán)狀結(jié)構(gòu):質(zhì)粒DNA是具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA分子,不整合到宿主基因組中。
*攜帶外源基因:質(zhì)粒DNA可以攜帶外源基因,并通過(guò)轉(zhuǎn)染或電穿孔等方法將基因?qū)胨拗骷?xì)胞。
*轉(zhuǎn)瞬表達(dá):外源基因在質(zhì)粒DNA中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯,產(chǎn)生非整合型轉(zhuǎn)染,但隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加,轉(zhuǎn)染效率下降。
轉(zhuǎn)座子
*序列重復(fù):轉(zhuǎn)座子是能夠在基因組中移動(dòng)的DNA序列,兩端通常具有特定的重復(fù)序列。
*轉(zhuǎn)座機(jī)制:轉(zhuǎn)座子通過(guò)轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的切割-粘貼機(jī)制移動(dòng),不整合到宿主基因組中。
*隨機(jī)插入:轉(zhuǎn)座子可以隨機(jī)插入基因組的各個(gè)位置,但某些轉(zhuǎn)座子具有偏好于整合到特定位點(diǎn)的能力。非整合型載體:質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)座子
在基因編輯領(lǐng)域,非整合型載體是不會(huì)整合到宿主基因組中的載體,從而避免了整合相關(guān)的不良影響,例如基因組不穩(wěn)定性、插入突變和潛在的致癌效應(yīng)。非整合型載體可用于暫時(shí)表達(dá)編輯組件,并允許對(duì)基因組的精確編輯,而無(wú)需擔(dān)心持久性的影響。
#質(zhì)粒DNA
質(zhì)粒DNA是最常用的非整合型載體。它們是小的環(huán)狀雙鏈DNA分子,通常攜帶一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記。質(zhì)粒DNA可以通過(guò)轉(zhuǎn)染或電穿孔等方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
優(yōu)點(diǎn):
*生產(chǎn)和純化簡(jiǎn)單方便。
*可以攜帶較大的DNA插入片段(高達(dá)20kb)。
*可以進(jìn)行各種分子克隆和操縱。
缺點(diǎn):
*轉(zhuǎn)染效率通常較低。
*只能在分裂中的細(xì)胞中復(fù)制。
*在長(zhǎng)期培養(yǎng)中可能不穩(wěn)定。
#轉(zhuǎn)座子
轉(zhuǎn)座子是移動(dòng)的基因元件,能夠在基因組中插入或刪除自身。這些元件可用于開(kāi)發(fā)非整合型基因編輯載體,將編輯組件靶向特定基因組位點(diǎn)。
基于CRISPR-Cas9的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng):
CRISPR-Cas9轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)結(jié)合了CRISPR-Cas9基因編輯機(jī)制和轉(zhuǎn)座子元件。Cas9蛋白與引導(dǎo)RNA(gRNA)靶向特定的DNA序列,而轉(zhuǎn)座子元件負(fù)責(zé)將編輯組件(例如供體DNA模板)插入或刪除目標(biāo)位點(diǎn)。
優(yōu)點(diǎn):
*高靶向性和編輯效率。
*能夠插入較長(zhǎng)的DNA片段(高達(dá)10kb)。
*在分裂和非分裂細(xì)胞中均有效。
缺點(diǎn):
*轉(zhuǎn)座子元件的插入可能會(huì)影響基因組穩(wěn)定性。
*可能存在脫靶效應(yīng)。
*構(gòu)建和生產(chǎn)復(fù)雜。
#其他非整合型載體
除了質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)座子外,還有其他正在開(kāi)發(fā)的非整合型基因編輯載體:
*mRNA:mRNA分子編碼編輯組件,可直接翻譯而不整合到基因組中。
*腺相關(guān)病毒(AAV):AAV是單鏈DNA病毒,不整合到宿主基因組中。
*脂質(zhì)納米顆粒:脂質(zhì)納米顆粒可以用作編輯組件的遞送載體,而無(wú)需整合。
選擇非整合型載體的考慮因素:
選擇非整合型載體時(shí),需要考慮以下因素:
*編輯效率:不同載體系統(tǒng)的編輯效率各不相同。
*靶向性:某些載體更適合靶向特定基因組區(qū)域。
*細(xì)胞類(lèi)型:載體的選擇取決于要編輯的細(xì)胞類(lèi)型。
*成本和可用性:不同載體系統(tǒng)的生產(chǎn)成本和可用性各不相同。
#結(jié)論
非整合型基因編輯載體為基因組編輯提供了一種安全有效的選擇。質(zhì)粒DNA、轉(zhuǎn)座子和mRNA等不同載體系統(tǒng)提供了一系列優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn),允許研究人員選擇最適合特定應(yīng)用的載體。隨著研究的不斷進(jìn)行,預(yù)計(jì)非整合型載體在基因治療和基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用將繼續(xù)擴(kuò)大。第二部分編輯酶遞送系統(tǒng):RNA導(dǎo)向和同源重組關(guān)鍵詞關(guān)鍵要點(diǎn)RNA導(dǎo)向編輯
1.利用CRISPR-Cas9、Cas12a和Cas13a等RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶,切割目標(biāo)基因組DNA,產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)。
2.DSB會(huì)觸發(fā)細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制,包括非同源末端連接(NHEJ)和同源重組(HR)途徑。
3.通過(guò)向細(xì)胞中引入攜帶所需編輯的供體DNA或RNA模板,可以利用HR途徑實(shí)現(xiàn)基因靶向編輯。
同源重組編輯
1.同源重組是一種利用一段與靶基因序列同源的DNA或RNA模板,來(lái)修復(fù)雙鏈斷裂的DNA修復(fù)途徑。
2.HR介導(dǎo)的基因編輯包括基因敲入、敲除、點(diǎn)突變和插入,允許研究人員對(duì)基因組進(jìn)行精確修改。
3.優(yōu)化HR效率對(duì)于提高基因編輯的準(zhǔn)確性和效率至關(guān)重要,可以利用核酸酶、供體模板設(shè)計(jì)和細(xì)胞周期控制策略來(lái)實(shí)現(xiàn)。編輯酶遞送系統(tǒng):RNA導(dǎo)向和同源重組
RNA導(dǎo)向編輯酶遞送系統(tǒng)
RNA導(dǎo)向編輯酶遞送系統(tǒng),如CRISPR-Cas9和Cas12a,利用RNA引導(dǎo)鏈引導(dǎo)編輯酶靶向特定的基因位點(diǎn)。這些系統(tǒng)包括一個(gè)可編程的單導(dǎo)RNA(sgRNA),其包含一個(gè)靶向序列和一個(gè)反向序列,可與Cas蛋白結(jié)合。
*CRISPR-Cas9:Cas9蛋白是一種核酸酶,可切割雙鏈DNA。它與sgRNA結(jié)合,sgRNA將Cas9引導(dǎo)至靶位點(diǎn)。Cas9識(shí)別靶位點(diǎn),并產(chǎn)生一個(gè)雙鏈斷裂,從而促進(jìn)非同源末端連接(NHEJ)或同源重組(HR)介導(dǎo)的修復(fù)。
*Cas12a:Cas12a是一種另一種核酸酶,它也具有靶向雙鏈DNA的能力。與Cas9不同,Cas12a切割DNA后會(huì)產(chǎn)生粘性末端,更適合HR介導(dǎo)的修復(fù)。
同源重組介導(dǎo)的編輯
同源重組(HR)是一種基因編輯技術(shù),利用供體模板修復(fù)雙鏈斷裂,從而引入預(yù)期的改變。HR介導(dǎo)的編輯需要一個(gè)供體模板,其中包含所需的突變或插入。當(dāng)雙鏈斷裂發(fā)生時(shí),細(xì)胞的HR機(jī)制會(huì)使用供體模板修復(fù)斷裂并引入編輯。
*供體模板:供體模板可以是一條單鏈寡核苷酸、質(zhì)粒DNA或細(xì)菌人工染色體(BAC)。它包含所需的突變或插入序列,以及與靶基因位點(diǎn)同源的序列。
*HR介導(dǎo)的修復(fù):HR修復(fù)過(guò)程涉及同源重組因子Rad51、BRCA1和BRCA2。這些因子將供體模板與斷裂的DNA配對(duì),促進(jìn)交叉互換,并實(shí)現(xiàn)編輯的整合。
編輯酶遞送系統(tǒng)的選擇
編輯酶遞送系統(tǒng)的選擇取決于所需的編輯類(lèi)型:
*插入或刪除:NHEJ介導(dǎo)的編輯適用于插入或刪除短序列,如點(diǎn)突變或小片段插入。CRISPR-Cas9或Cas12a均可用于此目的。
*基因替換:HR介導(dǎo)的編輯適用于替換較長(zhǎng)的基因序列。Cas12a更適合HR介導(dǎo)的編輯,因?yàn)樗a(chǎn)生粘性末端,可以更有效地與供體模板配對(duì)。
編輯酶遞送系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)
*可編程性高,可靶向特定的基因位點(diǎn)
*精度高,可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)編輯
*效率高,可產(chǎn)生大量的編輯事件
編輯酶遞送系統(tǒng)的局限性
*脫靶效應(yīng):CRISPR-Cas9和Cas12a有時(shí)會(huì)靶向非預(yù)期位點(diǎn),導(dǎo)致脫靶編輯。
*免疫原性:Cas蛋白是外源蛋白,可能會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)。
*效率變化:編輯酶遞送系統(tǒng)的效率可能因基因位點(diǎn)、細(xì)胞類(lèi)型和供體模板的設(shè)計(jì)而異。
正在進(jìn)行的優(yōu)化
研究正在進(jìn)行中,以?xún)?yōu)化編輯酶遞送系統(tǒng),包括:
*減少脫靶效應(yīng)
*提高免疫相容性
*提高編輯效率
*探索新的編輯酶,具有更寬的靶向范圍和更高的特異性第三部分植物中非病毒載體介導(dǎo)的基因編輯關(guān)鍵詞關(guān)鍵要點(diǎn)CRISPR-Cas系統(tǒng)用于基因編輯
1.CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種高效的基因編輯工具,可通過(guò)靶向特定DNA序列對(duì)植物基因組進(jìn)行精確修改。
2.CRISPR-Cas系統(tǒng)由導(dǎo)向RNA(gRNA)和Cas核酸酶組成,gRNA引導(dǎo)Cas核酸酶切割目標(biāo)DNA,從而實(shí)現(xiàn)基因的插入、刪除或修改。
3.CRISPR-Cas系統(tǒng)在植物中已被成功應(yīng)用于育種和研究,可改善農(nóng)作物性狀,提高作物的抗病性和產(chǎn)量。
TALENs用于基因編輯
1.TALENs(轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶)是一種人工設(shè)計(jì)酶,可通過(guò)靶向特定DNA序列對(duì)基因組進(jìn)行編輯。
2.TALENs包含一個(gè)DNA結(jié)合域,可與目標(biāo)DNA結(jié)合,以及一個(gè)核酸酶域,可切割目標(biāo)DNA。
3.TALENs在植物基因編輯中應(yīng)用廣泛,可用于創(chuàng)建基因敲除、基因突變和基因插入。
ZFNs用于基因編輯
1.ZFNs(鋅指核酸酶)是一種人工設(shè)計(jì)酶,可通過(guò)靶向特定DNA序列對(duì)基因組進(jìn)行編輯。
2.ZFNs包含一個(gè)靶向特定DNA序列的鋅指結(jié)構(gòu),以及一個(gè)核酸酶域,可切割目標(biāo)DNA。
3.ZFNs在植物基因編輯中應(yīng)用廣泛,可用于創(chuàng)建基因敲除、基因突變和基因插入。
轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)用于基因編輯
1.轉(zhuǎn)座子是一種基因元件,可移動(dòng)到基因組的另一個(gè)位置。
2.轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可用于將外源基因插入植物基因組,實(shí)現(xiàn)基因編輯。
3.轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在植物中已被成功用于創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因植物,可改善農(nóng)作物性狀,提高作物的抗性。
同源重組用于基因編輯
1.同源重組是一種天然的DNA修復(fù)機(jī)制,可通過(guò)利用同源序列介導(dǎo)DNA交換實(shí)現(xiàn)基因編輯。
2.同源重組可用于敲除或插入基因,以及對(duì)基因進(jìn)行定位突變。
3.同源重組在植物基因編輯中應(yīng)用廣泛,可用于創(chuàng)建精確的基因組編輯事件。
其他非病毒載體介導(dǎo)的基因編輯方法
1.除了上述方法外,還有一些其他非病毒載體介導(dǎo)的基因編輯方法,如基因槍轉(zhuǎn)化、電穿孔和微注射。
2.這些方法也可用于將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞,并實(shí)現(xiàn)基因編輯。
3.不同的基因編輯方法各有優(yōu)缺點(diǎn),可根據(jù)具體的研究目標(biāo)和植物材料選擇最合適的技術(shù)。植物中非病毒載體介導(dǎo)的基因編輯
近年來(lái),基因編輯技術(shù)在植物生物學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。非病毒載體,如CRISPR-Cas系統(tǒng),已被開(kāi)發(fā)用于在植物中進(jìn)行高效且精確的基因組編輯。
CRISPR-Cas系統(tǒng)
CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種細(xì)菌和古菌中發(fā)現(xiàn)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。它由兩種主要成分組成:Cas酶和向?qū)NA(gRNA)。Cas酶負(fù)責(zé)切割目標(biāo)DNA,而gRNA引導(dǎo)Cas酶到特定的目標(biāo)位點(diǎn)。
非病毒載體介導(dǎo)的CRISPR-Cas基因編輯在植物中的應(yīng)用
非病毒載體介導(dǎo)的CRISPR-Cas基因編輯在植物中已成功用于:
*基因敲除:通過(guò)在目標(biāo)基因上引入雙鏈斷裂,可靶向敲除特定基因。
*基因插入:通過(guò)使用同源重組模板,Cas9可以將外源DNA片段插入到特定基因組位點(diǎn)。
*基因定點(diǎn)突變:通過(guò)使用Cas9的核酸酶失活變異體(dCas9),結(jié)合gRNA和靶基因的互補(bǔ)序列,可以在特定的基因組位點(diǎn)誘導(dǎo)定點(diǎn)突變。
非病毒載體介導(dǎo)的CRISPR-Cas基因編輯的優(yōu)勢(shì)
相較于病毒載體,非病毒載體介導(dǎo)的CRISPR-Cas基因編輯具有以下優(yōu)勢(shì):
*生物安全性高:非病毒載體不具有復(fù)制能力,降低了對(duì)植物或環(huán)境造成傷害的風(fēng)險(xiǎn)。
*靶向性強(qiáng):gRNA可高度特異性地引導(dǎo)Cas酶到目標(biāo)基因組位點(diǎn),實(shí)現(xiàn)精確基因編輯。
*易于設(shè)計(jì)和構(gòu)建:gRNA的合成簡(jiǎn)單快捷,無(wú)需復(fù)雜的分生系統(tǒng)。
非病毒載體介導(dǎo)的CRISPR-Cas基因編輯在植物中的進(jìn)展
非病毒載體介導(dǎo)的CRISPR-Cas基因編輯在植物中取得了顯著進(jìn)展。例如:
*在水稻中,非病毒CRISPR-Cas系統(tǒng)成功敲除了多個(gè)靶基因,改善了農(nóng)藝性狀。
*在番茄中,非病毒CRISPR-Cas系統(tǒng)被用于插入外源基因,提高了對(duì)病害的抗性。
*在大豆中,非病毒CRISPR-Cas系統(tǒng)被用于誘導(dǎo)定點(diǎn)突變,為提高產(chǎn)量和品質(zhì)提供了新途徑。
挑戰(zhàn)和未來(lái)展望
盡管取得了進(jìn)展,非病毒載體介導(dǎo)的CRISPR-Cas基因編輯在植物中的應(yīng)用仍面臨一些挑戰(zhàn),包括:
*遞送效率低:非病毒載體很難有效遞送到植物細(xì)胞中。
*脫靶效應(yīng):Cas9可能會(huì)切割與目標(biāo)序列相似但不同的DNA位點(diǎn)。
未來(lái),研究將集中于開(kāi)發(fā)更有效的遞送方法和改善Cas9的靶向性。非病毒載體介導(dǎo)的CRISPR-Cas基因編輯有望徹底變革植物育種和改良,從而為可持續(xù)的農(nóng)業(yè)和糧食安全做出貢獻(xiàn)。第四部分動(dòng)物中非病毒載體介導(dǎo)的基因編輯動(dòng)物中非病毒載體介導(dǎo)的基因編輯
非病毒載體介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)已成為動(dòng)物模型研究和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的寶貴工具。與病毒載體相比,非病毒載體具有安全、免疫反應(yīng)低、產(chǎn)能高和靶向性好的優(yōu)點(diǎn)。
脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)
LNPs是通過(guò)自我組裝陽(yáng)離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、膽固醇和PEG化脂質(zhì)形成的納米顆粒。它們可用于遞送mRNA、質(zhì)粒DNA、CRISPR-Cas9系統(tǒng)和基因編輯工具,在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)染效率和低毒性。
例如,在小鼠模型中,LNPs遞送CRISPR-Cas9系統(tǒng)可有效靶向肝臟、肺和心臟等組織,并實(shí)現(xiàn)基因敲除或敲入。此外,LNPs還可用于遞送mRNA編碼的Cas9蛋白,從而減少脫靶效應(yīng)。
聚合物納米顆粒
聚合物納米顆粒是通過(guò)聚合物與DNA或RNA的電荷相互作用形成的。常用的聚合物包括陽(yáng)離子聚合物、陽(yáng)離子脂質(zhì)聚合物和聚醚-酰胺共聚物。這些納米顆粒具有良好的成瘤性和生物相容性,可用于遞送CRISPR-Cas9系統(tǒng)和基因編輯工具。
在豬模型中,聚合物納米顆粒遞送CRISPR-Cas9系統(tǒng)可有效靶向肌肉組織,并實(shí)現(xiàn)特定基因的敲除。此外,聚合物納米顆粒還可用于遞送mRNA編碼的Cas9蛋白,從而降低脫靶效應(yīng)。
電穿孔
電穿孔是一種通過(guò)電脈沖暫時(shí)破壞細(xì)胞膜,促進(jìn)DNA或RNA進(jìn)入細(xì)胞的非病毒載體介導(dǎo)的基因編輯方法。電穿孔的效率受脈沖參數(shù)、電極形狀和細(xì)胞類(lèi)型等因素的影響。
在小鼠模型中,電穿孔可用于遞送CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向腦組織、肌肉組織和胚胎干細(xì)胞。電穿孔還可用于遞送mRNA編碼的Cas9蛋白,從而減少脫靶效應(yīng)。
轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)
轉(zhuǎn)座子是能夠在其基因組中插入或轉(zhuǎn)座其他DNA片段的DNA序列。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可用于將基因編輯工具整合到動(dòng)物基因組中,實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、可遺傳的基因修飾。
例如,SleepingBeauty轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)已成功用于小鼠、豬和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型中。SleepingBeauty轉(zhuǎn)座酶可識(shí)別特定的靶序列,并介導(dǎo)基因編輯工具的整合。
CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)
CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)是一種強(qiáng)大的基因編輯工具,可實(shí)現(xiàn)基因敲除、敲入、替換和修復(fù)。該系統(tǒng)包括導(dǎo)向RNA(gRNA)和Cas蛋白,gRNA指導(dǎo)Cas蛋白靶向特定DNA序列并進(jìn)行切割。
CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)可通過(guò)非病毒載體遞送至動(dòng)物模型中。LNPs、聚合物納米顆粒和電穿孔均可用于遞送CRISPR-Cas系統(tǒng),并實(shí)現(xiàn)基因編輯。
應(yīng)用
非病毒載體介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)在動(dòng)物模型研究中得到了廣泛應(yīng)用,包括:
*研究疾病的發(fā)病機(jī)制
*開(kāi)發(fā)新的治療方法
*改進(jìn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型
*生產(chǎn)用于生物醫(yī)學(xué)研究和農(nóng)業(yè)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
優(yōu)勢(shì)
非病毒載體介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)與病毒載體相比具有以下優(yōu)勢(shì):
*安全性:非病毒載體不會(huì)整合到動(dòng)物基因組中,因此不存在插入突變和致癌的風(fēng)險(xiǎn)。
*免疫反應(yīng)低:非病毒載體通常不會(huì)引起顯著的免疫反應(yīng),因此可以重復(fù)使用。
*產(chǎn)能高:非病毒載體可以在大規(guī)模生產(chǎn),這對(duì)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的大規(guī)模生產(chǎn)至關(guān)重要。
*靶向性好:非病毒載體可以通過(guò)修飾其表面或使用靶向性配體來(lái)實(shí)現(xiàn)特定的組織或細(xì)胞靶向。
局限性
非病毒載體介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)也存在一些局限性:
*轉(zhuǎn)染效率:非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率通常低于病毒載體。
*脫靶效應(yīng):CRISPR-Cas系統(tǒng)存在脫靶效應(yīng),這可能會(huì)導(dǎo)致基因組中意外的修改。
*持久性:非病毒載體介導(dǎo)的基因編輯通常是瞬時(shí)的,這對(duì)于需要長(zhǎng)期基因修飾的應(yīng)用來(lái)說(shuō)是一個(gè)限制。
結(jié)論
非病毒載體介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)為動(dòng)物模型研究和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)提供了強(qiáng)大的工具。通過(guò)優(yōu)化非病毒載體和CRISPR-Cas系統(tǒng),可以提高轉(zhuǎn)染效率,降低脫靶效應(yīng),并實(shí)現(xiàn)更持久、更靶向的基因編輯。第五部分臨床應(yīng)用中的非病毒載體安全性臨床應(yīng)用中的非病毒載體安全性
引言
非病毒載體因其低免疫原性、潛在的規(guī)?;a(chǎn)能力和安全性而被視為基因編輯治療的重要工具。然而,確保非病毒載體的安全性至關(guān)重要,以使其在臨床應(yīng)用中具有可行性和接受性。
免疫反應(yīng)
非病毒載體主要通過(guò)免疫反應(yīng)觸發(fā)安全性問(wèn)題。這些載體由外源材料制成,可以被免疫系統(tǒng)識(shí)別為非己,從而觸發(fā)免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)可以包括炎癥、細(xì)胞毒性以及抗體產(chǎn)生。
載體類(lèi)型的影響
不同類(lèi)型的非病毒載體具有不同的免疫風(fēng)險(xiǎn)。脂質(zhì)納米顆粒(LNP)和脂質(zhì)體通常被認(rèn)為是免疫原性較低的載體,而聚合物和肽載體則可能引發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。載體的大小、表面電荷和化學(xué)組成也影響其免疫原性。
劑量和給藥途徑
載體的劑量和給藥途徑也會(huì)影響安全性。高劑量載體更有可能引發(fā)免疫反應(yīng)。全身給藥,例如靜脈注射,可以導(dǎo)致載體分布更廣泛,增加免疫激活的風(fēng)險(xiǎn)。相反,局部給藥,例如吸入或肌肉注射,通常與較低的免疫原性相關(guān)。
臨床前安全性評(píng)估
在進(jìn)入臨床試驗(yàn)之前,非病毒載體必須進(jìn)行徹底的臨床前安全性評(píng)估。這些評(píng)估包括免疫學(xué)研究、毒性研究和生殖毒性研究。這些研究旨在檢測(cè)載體的免疫原性、靶器官毒性以及對(duì)生殖健康的潛在影響。
臨床安全性監(jiān)測(cè)
在臨床試驗(yàn)期間,仔細(xì)監(jiān)測(cè)患者安全性至關(guān)重要。這包括評(píng)估局部和全身反應(yīng),例如注射部位反應(yīng)、發(fā)熱、炎癥和過(guò)敏反應(yīng)。還需要監(jiān)測(cè)載體的長(zhǎng)期毒性,包括肝毒性和心臟毒性。
案例研究
mRNA載體的安全性
mRNA載體是LNP封裝的編碼治療性mRNA分子的載體。它們已在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估,總體耐受性良好。最常見(jiàn)的副作用是注射部位反應(yīng)和短暫的發(fā)熱。在罕見(jiàn)情況下,mRNA載體可能會(huì)引發(fā)嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng),稱(chēng)為超敏反應(yīng)。
CRISPR-Cas9載體的安全性
CRISPR-Cas9載體已在臨床試驗(yàn)中用于治療多種疾病。這些載體通常由腺相關(guān)病毒(AAV)或脂質(zhì)納米顆粒(LNP)遞送。CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯與靶向脫靶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),這可能會(huì)導(dǎo)致不可預(yù)見(jiàn)的毒性。此外,CRISPR-Cas9載體可能會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng),包括抗Cas9抗體產(chǎn)生。
結(jié)論
非病毒載體在基因編輯治療中具有巨大的潛力。然而,重要的是要認(rèn)識(shí)到這些載體與免疫反應(yīng)和毒性相關(guān)的潛在安全性問(wèn)題。通過(guò)精心設(shè)計(jì)、徹底的臨床前評(píng)估和持續(xù)的臨床安全性監(jiān)測(cè),我們可以最大限度地降低這些風(fēng)險(xiǎn),并確保非病毒載體的安全應(yīng)用于基因編輯治療領(lǐng)域。第六部分非病毒載體基因整合控制關(guān)鍵詞關(guān)鍵要點(diǎn)【轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)基因整合】
1.利用轉(zhuǎn)座子基因序列特異性靶向特定基因位點(diǎn),實(shí)現(xiàn)基因遞送和編輯。
2.通過(guò)設(shè)計(jì)帶有特定靶向序列的轉(zhuǎn)座子載體,實(shí)現(xiàn)高效率和定點(diǎn)基因整合。
3.優(yōu)化轉(zhuǎn)座子活性,增強(qiáng)基因編輯效率,降低非特異整合風(fēng)險(xiǎn)。
【質(zhì)粒整合酶介導(dǎo)基因整合】
非病毒性基因編輯載體開(kāi)發(fā):非病毒載體基因整合控制
引言
非病毒性載體是一種用于基因編輯的載體系統(tǒng),不依賴(lài)于病毒來(lái)遞送遺傳物質(zhì)。與病毒載體相比,它們具有固有的安全性和免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)。然而,非病毒載體也面臨著基因整合控制的挑戰(zhàn),即精準(zhǔn)調(diào)節(jié)靶基因的插入,以避免脫靶效應(yīng)和基因組不穩(wěn)定性。
非病毒載體基因整合控制機(jī)制
非病毒載體通常通過(guò)同源重組(HR)或非同源末端連接(NHEJ)機(jī)制實(shí)現(xiàn)基因整合。
*同源重組(HR):HR是DNA修復(fù)的一種機(jī)制,利用供體序列的同源性來(lái)精確編輯基因組。非病毒載體載入含有與靶基因同源序列的編輯模板,通過(guò)HR將編輯后的序列整合到靶基因中。
*非同源末端連接(NHEJ):NHEJ是一種快速而有效的DNA修復(fù)機(jī)制,但缺乏同源性要求。非病毒載體利用NHEJ在靶基因處產(chǎn)生雙鏈斷裂,并通過(guò)內(nèi)切酶或轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行非特異性連接,將編輯模板整合到基因組中。
非病毒載體基因整合控制策略
為了控制非病毒載體的基因整合,研究人員開(kāi)發(fā)了各種策略:
1.基于靶向核酸酶的策略
*鋅指核酸酶(ZFNs):ZFNs是包含鋅指結(jié)構(gòu)域(可識(shí)別特定DNA序列)和核酸酶結(jié)構(gòu)域的工程蛋白。利用ZFNs在靶基因處產(chǎn)生特定切割位點(diǎn),誘導(dǎo)HR或NHEJ介導(dǎo)的編輯模板整合。
*轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs):TALENs與ZFNs類(lèi)似,但使用轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物(TALEs)識(shí)別靶DNA序列。TALEs具有可重復(fù)的氨基酸模塊,每個(gè)模塊與DNA堿基特異性結(jié)合,提供了比ZFNs更高的靶向靈活性。
*CRISPR-Cas系統(tǒng):CRISPR-Cas9系統(tǒng)是由Cas9核酸酶和單向?qū)NA(sgRNA)組成的,共同指導(dǎo)Cas9切開(kāi)靶基因。sgRNA由一個(gè)靶向序列和一個(gè)PAM(質(zhì)粒相鄰基序)序列組成,Cas9識(shí)別PAM序列并切割與sgRNA配對(duì)的靶DNA。
2.基于同源重組的策略
*同源臂延伸(HDR):HDR是通過(guò)在編輯模板中包含靶基因側(cè)翼區(qū)域的同源臂來(lái)促進(jìn)同源重組。同源臂與靶基因配對(duì),引導(dǎo)HDR介導(dǎo)的精準(zhǔn)基因編輯。
*質(zhì)粒整合(PI):PI涉及將編輯模板設(shè)計(jì)為環(huán)狀質(zhì)粒,其中包含與靶基因同源的序列。質(zhì)粒與靶基因整合,提供穩(wěn)定的序列插入。
3.基于轉(zhuǎn)座酶的策略
*轉(zhuǎn)座酶:轉(zhuǎn)座酶是將DNA序列插入基因組特定位置的酶。非病毒載體可以利用轉(zhuǎn)座酶在靶基因處介導(dǎo)編輯模板的整合,實(shí)現(xiàn)靶向基因編輯。
*睡美人轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng):睡美人轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)由轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座子元件組成。轉(zhuǎn)座子元件包含編輯模板,而轉(zhuǎn)座酶識(shí)別轉(zhuǎn)座子元件中的靶序列并促進(jìn)其整合到基因組中。
整合控制的評(píng)估和優(yōu)化
非病毒載體基因整合控制的評(píng)估至關(guān)重要,以確?;蚓庉嫷臏?zhǔn)確性和安全性。常見(jiàn)的評(píng)估方法包括:
*T7內(nèi)切酶測(cè)定:T7內(nèi)切酶是一種特異識(shí)別和切割錯(cuò)配的酶。通過(guò)T7內(nèi)切酶測(cè)定可以檢測(cè)NHEJ介導(dǎo)的非特異性整合事件。
*PCR擴(kuò)增:PCR擴(kuò)增可以檢測(cè)編輯模板與靶基因的整合,并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證整合的準(zhǔn)確性。
*熒光原位雜交(FISH):FISH利用熒光探針可視化編輯模板在基因組中的位置和整合拷貝數(shù)。
*單細(xì)胞測(cè)序:?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序可以表征不同細(xì)胞中的基因整合事件,評(píng)估整合控制的異質(zhì)性。
研究人員通過(guò)優(yōu)化編輯模板的設(shè)計(jì)、載體遞送條件和整合控制策略,不斷改進(jìn)非病毒載體基因整合的控制。這對(duì)于提高基因編輯的準(zhǔn)確性和安全性至關(guān)重要,并為非病毒載體在疾病治療和基礎(chǔ)生物學(xué)研究中應(yīng)用提供了更大的潛力。第七部分非病毒載體的規(guī)?;a(chǎn)關(guān)鍵詞關(guān)鍵要點(diǎn)【規(guī)?;a(chǎn)】
1.生物反應(yīng)器技術(shù):優(yōu)化載體生產(chǎn)的生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)、培養(yǎng)基成分和工藝參數(shù),提升細(xì)胞增殖和載體表達(dá)效率。
2.高密度培養(yǎng):探索細(xì)胞密度的極限,通過(guò)介導(dǎo)載體釋放或優(yōu)化培養(yǎng)條件,實(shí)現(xiàn)高效的載體規(guī)?;a(chǎn)。
3.流式細(xì)胞術(shù)分選:利用流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)篩選高產(chǎn)細(xì)胞種群,通過(guò)克隆或亞克隆擴(kuò)大這些細(xì)胞,以獲得高表達(dá)效率的細(xì)胞株。
【規(guī)?;兓?/p>
非病毒載體的規(guī)?;a(chǎn)
電穿孔法
電穿孔法是一種物理方法,通過(guò)短暫的電脈沖在細(xì)胞膜上產(chǎn)生可逆性孔隙,允許外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。該方法適用于多種細(xì)胞類(lèi)型,包括原代細(xì)胞和難轉(zhuǎn)染細(xì)胞。規(guī)?;a(chǎn)中,電穿孔法采用電脈沖發(fā)生器或電容放電裝置,將細(xì)胞懸液置于電極之間,施加電脈沖。電脈沖的強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間和脈沖個(gè)數(shù)等參數(shù)需經(jīng)過(guò)優(yōu)化,以達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活力。
脂質(zhì)體法
脂質(zhì)體法利用人工合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹DNA,形成脂質(zhì)體復(fù)合物。脂質(zhì)體復(fù)合物與細(xì)胞膜相互作用,通過(guò)膜融合或內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。規(guī)?;a(chǎn)中,脂質(zhì)體復(fù)合物可以通過(guò)薄膜分散法、超聲分散法或微流控技術(shù)制備。薄膜分散法將脂質(zhì)和DNA溶液混合后,形成薄膜,再通過(guò)水化形成脂質(zhì)體復(fù)合物;超聲分散法利用超聲波將脂質(zhì)和DNA分散成脂質(zhì)體復(fù)合物;微流控技術(shù)利用微流控裝置控制流體流速和流型,形成均勻穩(wěn)定的脂質(zhì)體復(fù)合物。
聚合物法
聚合物法使用陽(yáng)離子聚合物包裹DNA,形成聚合物復(fù)合物。聚合物復(fù)合物與細(xì)胞膜相互作用,通過(guò)膜融合或內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。規(guī)模化生產(chǎn)中,聚合物復(fù)合物可以通過(guò)靜電沉淀法、乳液聚合法或超聲乳化法制備。靜電沉淀法將聚合物溶液與DNA溶液混合,通過(guò)電荷相互作用形成聚合物復(fù)合物;乳液聚合法將聚合物單體和DNA溶液分散在水中,通過(guò)乳化反應(yīng)形成聚合物復(fù)合物;超聲乳化法利用超聲波將聚合物溶液和DNA溶液乳化形成聚合物復(fù)合物。
納米顆粒法
納米顆粒法使用納米顆粒作為載體,攜帶DNA進(jìn)入細(xì)胞。納米顆粒可以由多種材料制成,如脂質(zhì)、聚合物、金屬或碳納米管。規(guī)?;a(chǎn)中,納米顆??梢酝ㄟ^(guò)自組裝、沉淀法或微流控技術(shù)制備。自組裝法利用納米顆粒的表面特性,在水中自發(fā)形成納米顆粒復(fù)合物;沉淀法將納米顆粒溶液與DNA溶液混合,通過(guò)溶劑沉淀形成納米顆粒復(fù)合物;微流控技術(shù)利用微流控裝置控制流體流速和流型,形成均勻穩(wěn)定的納米顆粒復(fù)合物。
生產(chǎn)工藝優(yōu)化
為了提高非病毒載體的規(guī)?;a(chǎn)效率和質(zhì)量,需要對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化參數(shù)包括:
*原料質(zhì)量:使用高純度DNA和高質(zhì)量的載體材料。
*生產(chǎn)條件:優(yōu)化電穿孔參數(shù)、脂質(zhì)體和聚合物復(fù)合物的組分比例、納米顆粒的性質(zhì)和表面修飾。
*生產(chǎn)效率:提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染率、減少細(xì)胞毒性和純化步驟。
*生產(chǎn)成本:降低原料成本、優(yōu)化生產(chǎn)流程和減少?gòu)U物產(chǎn)生。
質(zhì)控體系
建立嚴(yán)格的質(zhì)控體系,對(duì)生產(chǎn)過(guò)程和最終產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。質(zhì)控參數(shù)包括:
*載體特性:如粒徑、zeta電位、DNA包封效率和穩(wěn)定性。
*細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率:如轉(zhuǎn)染率、細(xì)胞活力和基因表達(dá)水平。
*免疫原性:評(píng)估載體對(duì)免疫系統(tǒng)的激活程度。
*雜質(zhì)水平:如殘留DNA、蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素。
法規(guī)要求
非病毒載體的規(guī)?;a(chǎn)需符合相關(guān)法規(guī)要求。在生產(chǎn)之前,應(yīng)制定生產(chǎn)規(guī)范和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),并向監(jiān)管部門(mén)申報(bào)和獲得許可。生產(chǎn)過(guò)程中需遵守良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)要求,確保產(chǎn)品的安全性和有效性。第八部分基于非病毒載體的未來(lái)基因治療前景關(guān)鍵詞關(guān)鍵要點(diǎn)主題名稱(chēng):新型遞送技術(shù)提升非病毒載體效率
1.納米顆粒和脂質(zhì)體等新型非病毒載體平臺(tái)能夠有效包裹和遞送基因編輯成分。
2.靶向性修飾增強(qiáng)了載體與特定細(xì)胞類(lèi)型的親和力,提高了基因編輯的效率。
3.優(yōu)化遞送途徑(如電穿孔、超聲波)進(jìn)一步促進(jìn)了非病毒載體的細(xì)胞攝取和基因編輯效率。
主題名稱(chēng):精準(zhǔn)基因編輯工具拓展治療適應(yīng)癥
基于非病毒載體的未來(lái)基因治療前景
非病毒載體的開(kāi)發(fā)為基因治療領(lǐng)域帶來(lái)了激動(dòng)人心的新機(jī)遇,其具有以下優(yōu)勢(shì):
#安全性增強(qiáng)
非病毒載體比病毒載體更安全,因?yàn)樗鼈儾痪哂胁《靖腥炯?xì)胞和引起免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。這對(duì)于治療遺傳疾病至關(guān)重要,其中患者的健康狀況已經(jīng)受到損害。
#免疫反應(yīng)降低
非病毒載體通常不會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),這意味著它們可以重復(fù)給藥,而不會(huì)出現(xiàn)針對(duì)載體的抗體反應(yīng)。這種降低的免疫原性對(duì)于需要長(zhǎng)期基因表達(dá)的治療尤為重要,例如神經(jīng)退行性疾病。
#組織特異性靶向
可以通過(guò)修飾非病毒載體來(lái)靶向特定組織或細(xì)胞類(lèi)型。這對(duì)于治療僅影響身體特定區(qū)域的疾病非常有前途,例如癌癥或神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
#成本效益
非病毒載體通常比病毒載體更具成本效益,因?yàn)樗鼈兛梢源笠?guī)模生產(chǎn),并且不需要復(fù)雜的生產(chǎn)設(shè)施。這可以使基因治療對(duì)更廣泛的患者群體更易于獲得。
#隨著研究和開(kāi)發(fā)的持續(xù)進(jìn)展,基于非病毒載體的基因治療前景極其光明。
應(yīng)用領(lǐng)域
非病毒基因編輯載體在多種疾病治療中具有廣闊的應(yīng)用前景,包括:
*癌癥:非病毒載體可用于靶向突變基因,抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
*遺傳疾病:非病毒載體可用于糾正或補(bǔ)充有缺陷的基因,治療囊性纖維化、鐮狀細(xì)胞性貧血等疾病。
*神經(jīng)退行性疾?。悍遣《据d體可用于遞送治療性基因,減緩或阻止神經(jīng)退行性疾病,如阿爾茨海默病和帕金森病。
*心血管疾?。悍遣《据d體可用于靶向?qū)е滦难芗膊〉幕?,改善心臟功能和預(yù)防心血管事件。
當(dāng)前挑戰(zhàn)和未來(lái)方向
非病毒載體的發(fā)展面臨著一些挑戰(zhàn),需要進(jìn)一步的研究和改進(jìn)。
*遞送效率:提高非病毒載體的遞送效率和靶向特異性至關(guān)重要。
*持續(xù)表達(dá):開(kāi)發(fā)持久性遞送系統(tǒng),以維持基因表達(dá)的長(zhǎng)期持續(xù)性。
*免疫耐受性:優(yōu)化非病毒載體,以避免免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除。
*監(jiān)管批準(zhǔn):制定監(jiān)管框架,以評(píng)估非病毒載體的安全性和有效性,并促進(jìn)其臨床應(yīng)用。
結(jié)論
基于非病毒載體的基因治療擁有巨大的潛力,可以為多種疾病提供創(chuàng)新和有效的治療選擇。隨著研究和開(kāi)發(fā)的持續(xù)進(jìn)展,非病毒載體有望成為基因治療未來(lái)的基石。關(guān)鍵詞關(guān)鍵要點(diǎn)動(dòng)物中非病毒載體介導(dǎo)的基因編輯
主題名稱(chēng):脂質(zhì)納米顆粒(LNP)
關(guān)鍵要點(diǎn):
*LNP是一種脂質(zhì)納米顆粒,可封裝mRNA或CRISPR組件遞送至目標(biāo)細(xì)胞。
*LNP具有高轉(zhuǎn)染效率和低免疫原性,使其成為動(dòng)物模型中基因編輯的有力工具。
*LNP在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物等各種動(dòng)物模型中顯示出成功遞
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