《動物組織中氯丙嗪的殘留測定-酶聯免疫吸附法》編制說明

編制說明標準名稱動物組織中氯丙嗪的殘留測定-酶聯免疫吸附法任務來源（項目計劃號）《安徽省市場監(jiān)督管理局關于下達2024年第三批安徽省地方標準制修訂計劃的通知》（皖市監(jiān)函〔2024〕377號），計劃編號為2024-3-75項負責起草單位安徽省飼料獸藥監(jiān)察所單位地址安徽省合肥市洞庭湖路3355號參與起草單位安徽中青檢驗檢測有限公司、安徽賽如分析檢測科技有限公司、安徽科博產品檢測研究院有限公司標準起草人（全部起草人，應與標準文本前言中起草人排序一致）序號姓名單位職務職稱電話編制情況1、編制過程簡介2024年9月2日，收到《安徽省市場監(jiān)督管理局關于下達2024年第三批安徽省地方標準制修訂計劃的通知》（皖市監(jiān)函〔2024〕377號），本標準的計劃編號為2024-3-75項，隨后成立標準編制小組，成員有劉發(fā)全、許世富、吳昊等人。標準起草過程：2024年9月，安徽省飼料獸藥監(jiān)察所聯合安徽省獸藥飼料監(jiān)察所，安徽中青檢驗檢測有限公司、安徽賽如分析檢測科技有限公司、安徽科博產品檢測研究院有限公司成立了標準制定工作小組，分工負責標準起草相關工作，編制小組以科學、規(guī)范、可操作性強為原則，按GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》起草本標準，采取召開座談會、發(fā)電子郵件等方式，征求起草單位、相關企業(yè)等行業(yè)內的專家意見和建議，完成了本標準征求意見稿。2、制定標準的必要性和意義氯丙嗪(Chlorpromazine)系吩噻嗪類藥物，為中樞多巴胺受體的阻斷劑，作用于中樞神經系統(tǒng)，具有抗精神病、降溫、鎮(zhèn)吐、催眠、麻醉等多種藥理作用。獸醫(yī)臨床上主要被用作鎮(zhèn)靜藥。近年來，因受利益的驅使，一些不法商在飼料中私自添加氯丙嗪，達到鎮(zhèn)靜、催眠之效果，從而間接起到催肥促生長的作用；另外，在運輸過程中，為了減少途中失重和應激死亡，防止肉品質下降，常常大劑量使用氯丙嗪，尤其是在屠宰前，大量使用氯丙嗪，可造成氯丙嗪在畜產品中殘留。氯丙嗪在體內主要通過肝臟代謝，大部分從尿中排除，但因排法緩慢，易產生體內蓄積殘留，并可達數月之久。動物組織中殘留的氯丙嗪通過食物鏈進入人體內，能引起白細胞減少和粒細胞缺乏癥以及其它的一些不良反應，直接影響人們的身體健康。同時，因殘留超標影響畜產品出口，也給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經濟損失。2019年9月，《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定（GB31650—2019），氯丙嗪僅允許作治療用，但不得在動物性食品中檢出。然而，近年來各類抽檢結果顯示，仍有動物組織和禽蛋等畜禽產品中檢出氯丙嗪殘留，嚴重影響動物源性食品安全和人類健康?！秳游锝M織中氯丙嗪的殘留測定——酶聯免疫吸附法》（DB34/T1373－2011）自發(fā)布以來在畜產品質量安全及快檢領域發(fā)揮了極其重要的作用。國內目前沒有動物肌肉、肝臟、腎臟和和禽蛋中氯丙嗪殘留量的篩選檢驗方法。本方法在2011版的基礎上擴大了適用范圍，包括動物種類和組織種類，并提高了檢測靈敏度。隨著居民消費水平的升級和食品安全意識的提高，準確、可靠的快速檢測技術是提高監(jiān)管工作效率的有效支撐。目前該標準發(fā)布已有13年，快檢領域檢測技術飛速發(fā)展，該標準在檢測范圍和靈敏度方面均存在一定的局限性。本方法擴大了適用動物及組織，修訂后適用范圍將包括動物肌肉、肝臟、腎臟和禽蛋。因此，修訂并實施《動物組織中氯丙嗪的殘留測定——酶聯免疫吸附法》具有十分重要的意義。3、制定標準的原則和依據，與現行法律法規(guī)、標準的關系。本標準依據實際需要，編制遵循“前沿性、科學性、實用性、規(guī)范性”的原則，按照《中華人民共和國標準化法》和《安徽省地方標準管理辦法》等有關法律、法規(guī)制定。本標準遵循現行的國家標準、農業(yè)行業(yè)標準和相關法規(guī)的規(guī)定。4、主要條款的說明，主要技術指標、參數、試驗驗證的論述（詳細說明）1范圍本文件規(guī)定了動物肌肉、肝臟、腎臟和禽蛋中氯丙嗪殘留量的酶聯免疫吸附測定方法。本文件適用于動物肌肉、肝臟、腎臟和禽蛋中氯丙嗪殘留量的快速篩選測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3試樣制備采集的動物組織應保存于-18℃的冰柜中，用前恢復至室溫，備用。4原理本方法是酶聯免疫法中的競爭性測定法，其主要原理是：樣品中游離的氯丙嗪與酶標板上固定的氯丙嗪抗原競爭特異性抗體再通過酶標Ⅱ抗的反應，洗掉游離的酶標物，再通過酶的專一性顯色劑顯色，根據顯色的深淺來判斷樣品中氯丙嗪的含量，根據競爭性原理，樣品中游離的氯丙嗪少，則酶標Ⅱ抗結合多，顯色就深，相反，則顯色淺。結果可以通過在450nm處測定吸收值計算，顏色變化的程度反映樣品中氯丙嗪的含量，在一定濃度范圍內吸光度的高低與樣品中氯丙嗪的含量成反比。5試劑和材料除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水符合GB/T6682二級水的規(guī)定。5.1競爭酶標免疫法氯丙嗪試劑盒，2℃～8℃冰箱中保存。5.1.1微孔板：包被有氯丙嗪抗原。5.1.2氯丙嗪標準溶液：0ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.6ng/mL、1.25ng/mL、5.00ng/mL。5.1.3酶標物凍干粉：1瓶。5.1.4酶標物稀釋液：13mL，1瓶。5.1.5酶標物溶液：臨用前取酶標物凍干粉，準確加入酶標物稀釋液12mL，搖勻。5.1.6顯色劑：13mL，1瓶。5.1.7終止液：13mL，1瓶。5.2樣品稀釋液：用水10倍稀釋廠商提供的濃縮樣本稀釋液。5.3清洗液：用水10倍稀釋廠商提供的濃縮洗滌液。5.4氫氧化鈉。5.5甲醇。5.6氫氧化鈉甲醇溶液：稱取0.1g氫氧化鈉,用甲醇溶解定容至100mL。6儀器和設備6.1酶標儀（配備450nm濾光片）。6.2振蕩器。6.3離心機，不低于6000r/min。6.4分析天平：感量0.00001g，感量0.001g，感量0.01g。6.5組織勻漿機，不低于10000r/min。6.6氮吹儀。6.7微量加樣器及配套吸頭：單道20μL，50μL，100μL，1000μL，多道50μL～300μL。7測定步驟7.1樣品處理稱取2.0+0.05g均質后的組織樣本于50ml離心管中，分別加入2ml2.5%三氯乙酸，6m乙腈，渦動5min，4000g以上，離心5min，取2ml上層液于50ml離心管中加入2ml的3M氫氧化鈉溶液，再加入4.5ml的正已烷，渦動5min，4000g以上，離心5min，取上層有機相3ml于干凈離心管管中，50-60℃水浴氮氣吹干，加入0.5ml復溶工作液，用渦旋儀渦動1min，溶解干燥的殘留物，取50μL進行檢測。7.2測試程序7.2.1測定在室溫20℃～25℃條件下操作，測定之前將試劑盒以及所有試劑在室溫（20℃～25℃）下放置1h～2h。7.2.2將足夠標準和樣品所用數量的微孔條插入微孔架，標準和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準和樣品的位置。7.2.3分別在各孔中加50μL的標準品溶液或樣品溶液。7.2.4分別在各孔中加100μL的酶標物溶液。7.2.5蓋好蓋板膜，輕輕晃動反應板數秒，25±2℃反應10min。7.2.6傾出微孔中的液體，加250μL清洗液，輕輕振蕩30s，傾出微孔中的洗滌液，在吸水紙上拍打，徹底清除微孔中的殘留液和氣泡，重復上述操作3遍。7.2.7立即在每孔中加入100μL顯色劑。7.2.8蓋好蓋板膜，輕輕晃動反應板數秒，25±2℃反應10min。7.2.9每孔加100μL終止液（推薦使用多通道加樣器），輕輕振蕩混勻，10min內在450nm下檢測吸光度。8結果判定和表述按下式計算百分吸光度值：百分吸光度值（%）=×100％………（1）式中：B—為標準溶液或供試樣品的平均吸光度值；Bo—為零標準的標準溶液平均吸光度值；用專業(yè)計算機軟件求出供試樣品中氯丙嗪的濃度，乘以稀釋系數即得檢測結果。或計算出的標準相對吸光度值繪成為一個對應濃度（ng/mL）的半對數坐標系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在0.1ng/mL～5ng/mL范圍內應當成為線性。相對應每一個樣品的濃度（ng/mL）可以從校正曲線上讀出。9檢測方法靈敏度、準確度、精密度9.1靈敏度本方法在動物肌肉、肝臟、腎臟和禽蛋等組織中的檢出限為0.5μg/kg。9.2準確度本方法在100μg/kg添加濃度水平上的回收率為70％～120％。9.3精密度本方法的批內變異系數CV％≤10％，批間變異系數CV％≤15％。5、標準中如果涉及專利，應有明確的知識產權說明本標準不涉及任何專利。6、采用國際標準或國外先進標準的，說明采標程度，以