納米技術(shù) 基于NADH氧化的納米顆粒光催化活性測試 征求意見稿

1GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019納米技術(shù)基于NADH氧化的納米顆粒光催化活性測試本文件規(guī)定了一種測量納米顆粒（NP）光催化活性（PCA）的方法。該方法將NP懸浮于生理環(huán)境相關(guān)的水溶液中，測定其在紫外光（UV）輻照下導(dǎo)致的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化。本文件旨在評估納米材料產(chǎn)生光毒性的能力。該方法也適用于NP團(tuán)聚體和聚集體。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。ISO/TS80004-1納米科技術(shù)語第1部分：核心術(shù)語（Nanotechnologies—Vocabulary—Part1:Coreterms）注：GB/T30544.1—2014納米科技術(shù)語第1部分：核心ISO/TS80004-2納米科技術(shù)語第2部分：納米物體（Nanotechnologies—Vocabulary—Part2:Nano-objects）3術(shù)語、定義、符號(hào)和縮略語ISO/TS80004-1和ISO/TS80004-2界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1術(shù)語和定義3.1.1光量測定法actinometry測量規(guī)定時(shí)間內(nèi)的光子數(shù)或單位時(shí)間光子數(shù)的方法。3.1.2催化活性catalyticactivity對于指定的化學(xué)反應(yīng)，測量在規(guī)定的測試條件下，因催化導(dǎo)致的物質(zhì)轉(zhuǎn)化速率的變化。[來源：ISO18153:2003，3.2，有修改，刪除所有注]3.1.3氧化oxidation有機(jī)底物獲得氧、損失氫或分子失去一個(gè)或多個(gè)電子的化學(xué)反應(yīng)。3.1.4NADH等效比PCANADHequivalentspecificPCA單位質(zhì)量納米顆粒催化NADH光氧化（3.1.5）的速率。3.1.5光氧化photo-oxidation2GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019光引發(fā)的氧化反應(yīng)。3.2符號(hào)和縮略語以下符號(hào)和縮略語適用于本文件。DIW：電阻率≥18MΩ?cm的去離子水（deionizedwaterwith≥18MΩ?cmresistivity）NADH：還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotineadeninedinucleotidehydrate）NaOH：氫氧化鈉（sodiumhydroxide）2NB：2-硝基苯甲醛（2-nitrobenzaldehyde）NP：納米顆粒（nanoparticle）PB：磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffer）PCA：光催化活性（photocatalyticactivity）ROS：活性氧（reactiveoxygenspecies）TI：透射儀（trans-illuminator）TiO2：二氧化鈦（titaniumdioxide）UV：紫外光（ultraviolet）UV-Vis：紫外-可見（ultravioletandvisible）Ac(i,j)：UV透射儀曝光前，每個(gè)孔中酚酞的吸光度（i=B,C,D,E,F,G；j=2,3,4,…,10,11）Ae(i,j)：UV透射儀曝光后，每個(gè)孔中酚酞的吸光度（i=B,C,D,E,F,G；j=2,3,4,…,10,11）?A(i,j)：UV透射儀曝光后，每個(gè)孔中酚酞吸光度的變化（i=B,C,D,E,F,G；j=2,3,4,…,10,11）?Aa：UV透射儀照射前后所有孔中酚酞吸光度變化的平均值C0：用于制備稀釋測試溶液的NP懸浮液的初始濃度；懸浮液在310nm或365nm處（取決于使用的UV透射儀）的吸光度為1.4<A<1.6C(i,j)：每個(gè)孔的光強(qiáng)校正因子，用于校準(zhǔn)UV透射儀在每個(gè)孔位置處的光照強(qiáng)度變化（i=B,C,D,E,F,G;j=2,3,4,…,8,9）IF,0(i,j)：UV照射前，每個(gè)孔中NADH的熒光強(qiáng)度（i=B,C,D,E,F,G；j=2,3,4,…,8,9）IF,t(i,j)：UV持續(xù)照射t時(shí)間后，每個(gè)孔中NADH的熒光強(qiáng)度（i=B,C,D,E,F,G；j=2,3,4,…,8,Kapp(i,j)：每個(gè)孔中NADH的表觀光氧化速率，單位為μmol/min（i=B,C,D,E,F,G;j=2,3,4,…,8,λexc：多孔板讀取器上設(shè)定記錄熒光的激發(fā)波長λexs：多孔板讀取器上設(shè)定記錄熒光的發(fā)射波長Aλ(max)：在300nm～800nm波長范圍內(nèi)NP懸浮液的最大吸光度λ(max,TI)：UV透射儀提供的最大光強(qiáng)處的波長S(i,j)：每個(gè)孔中NADH熒光強(qiáng)度隨UV照射時(shí)間變化的斜率（i=B,C,D,E,F,G;j=2,3,4,…,8,9）Sc(i,j)：每個(gè)孔中透射儀光強(qiáng)變化校準(zhǔn)后的S(i,j)b：線性范圍內(nèi)kapp隨NP濃度變化的斜率，單位為mmol?min-1?g-14測試方法說明本文件中，水懸浮液中NP的PCA采用其懸浮液中NADH的光氧化速率進(jìn)行測量。通過檢測UV光連續(xù)照射后NADH熒光強(qiáng)度的降低，可以測出由NP光催化作用而氧化的NADH比例。利用NP濃度梯度稀釋的方法，測定若干NP濃度下NADH的光氧化速率，由此得到NADH光氧化速率與NP濃度呈線性關(guān)系的NP濃度范圍[6]。該線性范圍內(nèi)的光氧化斜率給出了水懸浮液中單位濃度NP引起的NADH光氧化速率。利用96孔板、UV透射儀和多板光學(xué)讀取器提供的多通道檢測可以實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的測量。96孔平臺(tái)可3GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019以同時(shí)測量系列NP濃度，并提供了可作為陽性和陰性對照的參比NP選項(xiàng)。這個(gè)選項(xiàng)表示無NP時(shí)UV照射下NADH的自氧化和NP的自生熒光。5試劑與儀器5.1試劑5.1.1NADH，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，CAS號(hào)：606-68-8a）NADH儲(chǔ)備溶液：1）將約35mgNADH溶解在10mL濃度為5mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH=8）中。b）NADH工作溶液：1）將NADH儲(chǔ)備溶液用5mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH=8）稀釋20倍；2）得到的NADH工作溶液的濃度約為250μmol/L；3）通過測量該溶液在λ=339nm處的吸光度確定NADH工作溶液的濃度[NADH]。如有必要，使用5mmol/L磷酸鹽緩沖液稀釋或添加NADH儲(chǔ)備溶液調(diào)整NADH濃度使得吸光度A339=1.56±0.05。5.1.22-硝基苯甲醛（2NB），CAS號(hào)：552-89-6a）將0.756g無水2NB溶解在50mL50/50DIW/乙醇（體積比）混合溶劑中，得到50mL0.1mol/L2NB溶液。b）加入0.03mol/LNaOH，將0.1mol/L2NB溶液的pH調(diào)至12±0.2。5.1.3酚酞，CAS號(hào)：77-09-8a）將20mg無水酚酞溶解在20mL50/50DIW/乙醇（體積比）混合溶劑中，得到20mL酚酞儲(chǔ)備溶液。b）將100μL酚酞儲(chǔ)備溶液添加到50ml0.1mol/L2NB溶液中（按5.1.2制備溶液變成粉紅色。c）將溶液在避光瓶中（琥珀色玻璃或鋁箔包裹）儲(chǔ)存。5.1.4磷酸鹽緩沖液，pH=8的磷酸鈉/磷酸二鈉緩沖液（pH=8時(shí)PB為5mmol/L）2）將0.041g磷酸二氫鈉一水合物（CAS：10049-215.1.5NP懸浮液a）根據(jù)推薦的納米材料特定分散方法（如文獻(xiàn)[7]在5mmol/L磷酸鹽緩沖液中配制50mLNP懸浮液。b）將NP分散液的濃度調(diào)整為C0，使其在300nm～800nm范圍內(nèi)的最大吸光度滿足1.4<A<1.6。計(jì)算調(diào)整后儲(chǔ)備溶液中NP的濃度C0（mg/L）。c）根據(jù)配制的NP儲(chǔ)備溶液的質(zhì)量濃度，可以計(jì)算出所需NP工作溶液的稀釋倍數(shù)。5.1.6無水乙醇，純度>99.5%，含水量<0.005%，CAS：64-17-55.2儀器4GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:20195.2.1UV-Vis分光光度計(jì)，波長范圍：190nm～800nm，吸光度范圍：0.1～3.0。5.2.2UV-Vis吸收測量用比色皿，石英或光學(xué)玻璃，光程1cm。5.2.396孔板，平底面在λ(max,TI)處的透光率T>60%，首選側(cè)面為深色的塑料。5.2.4多孔板的吸收和熒光讀取器，可在300nm～800nm范圍讀取吸收和熒光的測量數(shù)據(jù)。5.2.5多通道移液器，不低于6通道，每個(gè)通道最大量程300μL。5.2.6300μL移液器槍頭，與多通道移液器匹配。5.2.7UV透射儀，水平照射面積不小于96孔板的365nm光源。6測量程序6.1NP懸浮液基本性質(zhì)測量6.1.1UV-Vis吸收光譜測量在300nm～800nm范圍的UV-Vis吸收光譜。參比和樣品盡量使用同一比色皿進(jìn)行測量。b）如果懸浮液在λ(max)處的Aλ(max)超過1.6，用磷酸鹽緩沖液（5mmol/LPB，pH=8）稀釋懸浮液至1.4<Aλ(max)<1.6。如果低于1.4，則相應(yīng)地增加NP的濃度。6.1.2NP懸浮液穩(wěn)定性測量注：此為確保NP在測量期間保持懸浮狀態(tài)所必需的。a）用5mmol/LPB（pH=8）測量基線（參比吸光度）。b）測量NP工作懸浮液的UV-Vis吸收光譜，按6.1.1調(diào)整濃度。c）將比色皿在分光光度計(jì)中放置20min后，再次測量工作懸浮液的UV-Vis吸收光譜。d）比較兩個(gè)光譜，并確認(rèn)在最大吸收λ(max)處吸光度的變化小于5%。如果λ(max)處的吸光度在20min內(nèi)下降超過5%，則認(rèn)為NP工作懸浮液不穩(wěn)定。6.2基于2NB光量測定法的UV透射儀光強(qiáng)校準(zhǔn)a）按照5.1.2和5.1.3配制含有酚酞的50mL0.1mol/L2NB溶液。使用琥珀色玻璃容器儲(chǔ)存該溶b）用300μL上述制備的溶液填充96孔板的每個(gè)孔。c）將96孔板放入讀數(shù)器中，設(shè)置程序使板搖動(dòng)5s，并測量和記錄540nm處的吸光度Ac(i,j)。警告：放置多孔板的位置和方向要與NADH/NP的UV曝光位置和方向相同。按照附錄A中的說明確定孔板的放置。d）打開透射儀（波長為λ(max,TI)）并預(yù)熱30min。e）將96孔板放置于透射儀上。f）將多孔板在UV下曝光10min。g）10min后，關(guān)閉透射儀，測量并使用96孔板上的讀取器記錄540nm處的吸光度Ae(i,j)。h）將步驟g）中記錄的每個(gè)孔的吸光度值減去步驟c）中記錄的對應(yīng)吸光度值，如式(1)所示：5GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019?A(i,j)=Ae(i,j)-Ac(i,j) i）計(jì)算吸光度差值的平均值，如式(2)所示：j）計(jì)算每個(gè)孔的光強(qiáng)校準(zhǔn)因子，如式(3)所示：C(i,j)=?Aa/?A(i,j) (3)k）每個(gè)孔的光強(qiáng)校準(zhǔn)因子乘以NADH熒光下降的斜率，按中的式（5）計(jì)算。附錄B給出了UV透射儀光強(qiáng)的校準(zhǔn)實(shí)例。6.3NADH溶液熒光強(qiáng)度的測量6.3.1不同NP濃度的NADH光氧化速率測量按5.1.1配制250μmol/LNADH溶液。配制NP懸浮儲(chǔ)備溶液（使用適當(dāng)?shù)姆稚⒉襟E，參見5.1.5）C0=100%。λ(max)處的吸光度（在300nm～800nm的范圍內(nèi)）宜1.4<A<1.6。通過體積稀釋，配制系列濃度的NP懸浮液（使用磷酸鹽緩沖液，每個(gè)濃度2mL）。相對于C0=100%（參見NP懸浮液的濃度分別為100%、80%、60%、40%、20%、10%、8%、5%。將100μL250μmol/LNADH溶液加入白色標(biāo)記的孔，如圖1所示。）；濃度為C0的NP懸浮液和100μL磷酸鹽緩沖液（圖1用96孔板測定不同NP濃度的NADH光氧化速率示意圖按以下說明，將100μL系列濃度的NP懸浮液填充至相應(yīng)孔中，通過移液器吹打至少3次使得各孔中的溶液混合均勻?！狝1,B1,……,G1,H1（整列）：不使用—A2,A3,……,A10,A11（整行）：不使用—B2,C2,D2,E2,F2,G2：空白緩沖液—B3,C3,D3,E3,F3,G3：濃度為C0的NP懸浮液6GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019—B4,C4,D4,E4,F4,G4：濃度為80%C0的NP懸浮液—B5,C5,D5,E5,F5,G5：濃度為60%C0的NP懸浮液—B6,C6,D6,E6,F6,G6：濃度為40%C0的NP懸浮液—B7,C7,D7,E7,F7,G7：濃度為20%C0的NP懸浮液—B8,C8,D8,E8,F8,G8：濃度為10%C0的NP懸浮液—B9,C9,D9,E9,F9,G9：濃度為8%C0的NP懸浮液—B10,C10,D10,E10,F10,G10：濃度為5%C0的NP懸浮液—B11,C11,D11,E11,F11,G11：100μL濃度為C0的NP懸浮液和100μL磷酸鹽緩沖液（5mmol/LPB，pH=8）—A12,B12,……,G12,H12（整列不使用—H2,H3,……,H10,H11（整行）：不使用測量并記錄每個(gè)孔的熒光強(qiáng)度值(λexc=340nm和λems=460nm應(yīng)標(biāo)記為IF,0(i,j)，其中i為B~G的行數(shù)，j為2～11的列數(shù)。將96孔板放置于UV透射儀上，開燈1min。在多孔板曝光前，宜打開UV透射儀30min。在多孔板多次UV曝光期間，確保其與UV曝光位置和方向相同。多孔板的放置說明參見附錄A。測量并記錄每個(gè)孔的熒光強(qiáng)度值，應(yīng)標(biāo)記為IF,t(i,j)，其中t為UV的曝光時(shí)長。重復(fù)步驟和，直到孔B6、C6、D6、E6、F6和G6中的熒光強(qiáng)度下降到其初始值的50%以下（UV曝光之前）。6.3.2不同NP濃度的NADH光氧化速率計(jì)算將每個(gè)孔測量的熒光強(qiáng)度IF,t(i,j)按IF,0(i,j)歸一化為UV照射時(shí)間的函數(shù)，如式(4)所示：IF,t,N(i,j)=IF,t(i,j)/IF,0(i,j)…………其中：j繪制每個(gè)孔的歸一化強(qiáng)度IF,t,N(i,j)隨照射時(shí)間的函數(shù)，并在下降強(qiáng)度與照射時(shí)間呈線性相關(guān)的范圍內(nèi)進(jìn)行線性回歸。計(jì)算每個(gè)孔的斜率S(i,j)，并乘以6.2中獲得的C(i,j)，獲得UV照射強(qiáng)度的校準(zhǔn)斜率，如式(5)所示：Sc(i,j)=S(i,j)×C(i,j) (5)使用5.1.1中吸光度測量獲得的[NADH]值，計(jì)算每個(gè)孔的NADH光氧化率kapp(i,j)，如式(6)所示：kapp(i,j)=Sc(i,j)×[NADH] (6)計(jì)算每個(gè)NP濃度下kapp值的列平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。由于kapp(2,j)僅為NADH自身的光氧化值（第2列數(shù)據(jù)通過計(jì)算kapp(i,j)/kapp(2,j)的比值可對kapp進(jìn)行歸一化處理。特定NP濃度下的kapp平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差可以通過此列讀數(shù)計(jì)算出來。如果斜率Sc(i,j)>0，則舍棄數(shù)據(jù)，報(bào)告中kapp(i,j)=0。繪制歸一化的kapp值隨NP濃度的關(guān)系圖，NP濃度單位為mg/L。速率常數(shù)與濃度關(guān)系圖的實(shí)7GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019例如圖2所示。在線性范圍內(nèi)，kapp隨NP濃度的斜率b給出了單位質(zhì)量NP的NADH光氧化速率，單位為mmol?min-1?g-1。該值可以稱為NP的“NADH等效比PCA”。圖2NADH光氧化速率隨NP濃度的關(guān)系7檢測報(bào)告7.1信息檢測報(bào)告應(yīng)包括以下信息：—對本文件的引用，如：根據(jù)本文件測定；—檢測實(shí)驗(yàn)室的名稱；—樣品的所有詳細(xì)信息（生產(chǎn)商名稱、生產(chǎn)日期、批號(hào)、純度、顆粒尺寸、預(yù)期用途、安全數(shù)據(jù)表）；—如果使用陰性對照，其所有詳細(xì)信息（生產(chǎn)商名稱、生產(chǎn)日期、批號(hào)、純度、顆粒尺寸、安全數(shù)據(jù)表）；—如果使用陽性對照，其所有詳細(xì)信息（生產(chǎn)商名稱、生產(chǎn)日期、批號(hào)、純度、顆粒尺寸、安全數(shù)據(jù)表）；注：按照上述完整的測量方案獲取對照數(shù)據(jù)?！鶕?jù)6.1.2，5mmol/L磷酸鹽緩沖液中NP懸浮液的吸收光譜；—NADH生產(chǎn)商名稱及純度；—酚酞生產(chǎn)商名稱及純度；—2NB生產(chǎn)商名稱及純度；—乙醇生產(chǎn)商名稱及純度；—透射儀生產(chǎn)商名稱及型號(hào)；—96孔板生產(chǎn)商名稱及型號(hào)；8GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019—96孔板讀取器生產(chǎn)商名稱及型號(hào)；—用于吸光度和熒光測量的96孔板讀取器設(shè)置的詳細(xì)說明；—結(jié)果評估，包括統(tǒng)計(jì)方法。7.2報(bào)表數(shù)據(jù)格式7.2.1通過光量測定法（參見6.2）獲得的校準(zhǔn)因子C(i,j)每個(gè)孔的光強(qiáng)校準(zhǔn)因子C(i,j)如表1所示。表1光強(qiáng)校準(zhǔn)因子123456789ANANANANANANANANANANANANABNAC(B,2)C(B,3)C(B,4)C(B,5)C(B,6)C(B,7)C(B,8)C(B,9)C(B,10)C(B,11)NACNAC(C,2)C(C,3)C(C,4)C(C,5)C(C,6)C(C,7)C(C,8)C(C,9)C(C,10)C(C,11)NADNAC(D,2)C(D,3)C(D,4)C(D,5)C(D,6)C(D,7)C(D,8)C(D,9)C(D,10)C(D,11)NAENAC(E,2)C(E,3)C(E,4)C(E,5)C(E,6)C(E,7)C(E,8)C(E,9)C(E,10)C(E,11)NAFNAC(F,2)C(F,3)C(F,4)C(F,5)C(F,6)C(F,7)C(F,8)C(F,9)NAGNAC(G,2)C(G,3)C(G,4)C(G,5)C(G,6)C(G,7)C(G,8)C(G,9)C(G,10)C(G,11)NAHNANANANANANANANANANANANANA：不使用。注：需λ(max,TI)來確定哪些數(shù)據(jù)組能相互比較。分別使用λ(max,TI)=312nm和λ(max,TI)=365nm的UV透射儀獲得的數(shù)據(jù)不能7.2.2NADH熒光下降的校準(zhǔn)斜率每個(gè)孔的NADH熒光強(qiáng)度隨UV照射時(shí)間的校準(zhǔn)斜率Sc(i,j)（參見）如表2所示。表2NADH熒光強(qiáng)度隨UV照射時(shí)間的校準(zhǔn)斜率123456789ANANANANANANANANANANANANABNASc(B,2)Sc(B,3)Sc(B,4)Sc(B,5)Sc(B,6)Sc(B,7)Sc(B,8)Sc(B,9)Sc(B,10)Sc(B,11)NACNASc(C,2)Sc(C,3)Sc(C,4)Sc(C,5)Sc(C,6)Sc(C,7)Sc(C,8)Sc(C,9)Sc(C,10)Sc(C,11)NADNASc(D,2)Sc(D,3)Sc(D,4)Sc(D,5)Sc(D,6)Sc(D,7)Sc(D,8)Sc(D,9)Sc(D,10)Sc(D,11)NAENASc(E,2)Sc(E,3)Sc(E,4)Sc(E,5)Sc(E,6)Sc(E,7)Sc(E,8)Sc(E,9)Sc(E,10)Sc(E,11)NAFNASc(F,2)Sc(F,3)Sc(F,4)Sc(F,5)Sc(F,6)Sc(F,7)Sc(F,8)Sc(F,9)Sc(F,10)Sc(F,11)NAGNASc(G,2)Sc(G,3)Sc(G,4)Sc(G,5)Sc(G,6)Sc(G,7)Sc(G,8)Sc(G,9)Sc(G,10)Sc(G,11)NAHNANANANANANANANANANANANANA：不使用。7.2.3kapp隨NP濃度的關(guān)系圖應(yīng)繪制kapp隨NP濃度的關(guān)系圖，確定濃度的線性范圍（參見）。當(dāng)線性范圍確定（參見圖2），應(yīng)在此NP濃度范圍內(nèi)對kapp隨NP濃度進(jìn)行線性回歸，并計(jì)算斜率。9GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:20197.2.4NADH等效比PCA在線性范圍內(nèi)，測試樣品的kapp隨NP濃度的斜率b為單位質(zhì)量NP催化NADH的光氧化速率，稱為NP的“NADH等效比PCA”，單位為mmol?min-1?g-1。重復(fù)測量6次（96孔板的B行～G行），并記錄平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。對于陰性對照，按處理。對于陽性對照，按處理。8精密度8.1重復(fù)性在同一實(shí)驗(yàn)室，同一操作人員使用相同的實(shí)驗(yàn)和分析測量儀器，在短期內(nèi)對同一樣品進(jìn)行兩次獨(dú)立測量。兩次測量的絕對差值不得超過重復(fù)性極值r，即不大于測試值的5%。附錄C給出了典型的實(shí)驗(yàn)室間測試中6個(gè)實(shí)驗(yàn)室的精度數(shù)據(jù)。8.2復(fù)現(xiàn)性在不同的實(shí)驗(yàn)室，不同的操作人員使用不同的實(shí)驗(yàn)和分析測量儀器，使用相同的測試方法，對同一樣品進(jìn)行兩次獨(dú)立測量。兩次測量的絕對差值不得超過復(fù)現(xiàn)性極值R，即不大于測試值的5%。附錄C給出了典型的實(shí)驗(yàn)室間測試中6個(gè)實(shí)驗(yàn)室的精度數(shù)據(jù)。GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:201996孔板放置示意圖遮蔽塊確保96孔板每次在UV透射儀上都放置在同一位置，如圖A.1所示。標(biāo)記多孔板方向，避免方向放反。遮蔽塊可以是聚四氟乙烯（PTFE）、鋁箔或黑色厚紙。標(biāo)引序號(hào)說明：1——96孔板的位置（UV照射）表A.196孔板GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019UV透射儀光強(qiáng)的校準(zhǔn)實(shí)例UV透射儀光強(qiáng)校準(zhǔn)實(shí)例的步驟如下：a）根據(jù)5.1.2，配制50mL100mmol/L2NB溶液。使用琥珀色玻璃容器儲(chǔ)存該溶液。b）用300μL上述制備的溶液填充96孔板的每個(gè)孔。c）將96孔板放入讀取器中，搖動(dòng)5s，記錄60孔中每個(gè)孔在540nm處的吸光度。2NB的初始吸光度實(shí)例如表B.1所示。圖形表示如圖B.1所示。表B.12NB的初始吸光度Ac(i,j)123456789AB0.30800.30100.28600.29700.29700.30300.30200.29700.31000.3170C0.30500.30700.30100.29500.29700.29300.30100.30500.30800.3120D0.30900.30700.30600.30000.29400.29000.29900.30500.30800.3140E0.31100.31200.31100.30300.29600.29500.29600.30800.31100.3140F0.31100.31500.31200.30800.30200.30000.30700.30800.31300.3210G0.32600.32000.31800.31700.31700.31600.32100.31700.31900.3260H注：每個(gè)孔中均含有300μL2NB溶液。圖B.196孔板中100mmol/L2NB溶液的初始吸光度(λ=540nm)圖示GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019使用板定位器將96孔板放置于透射儀上。d）打開透射儀(λ=365nm），將多孔板曝光10min。e）10min后，關(guān)閉透射儀，并使用96孔板上的讀取器測量540nm處的吸光度（參見表B.2）。圖形表示如圖B.2所示。表B.2UV曝光10min后2NB的吸光度Ae(i,j)123456789AB0.20800.20700.20800.20800.20700.20700.20700.20600.20700.2070C0.20700.20800.20900.20800.20800.20800.20800.20800.20800.2070D0.20800.20800.21000.21000.20700.20800.20900.20700.20700.2080E0.21000.20900.20900.21300.21000.20800.20800.20700.20800.2070F0.20800.21300.20900.20800.21000.20900.20800.20700.20700.2100G0.21400.21300.20900.20800.20900.20900.21100.20800.20800.2090H注：每個(gè)孔中含有300μL2NB溶液。圖B.2透射儀(λ=365nm)曝光10min后96孔板中100mmol/L2NB溶液的吸光度(λ=540nm)圖示f）將步驟c）中記錄的每個(gè)孔的吸光度值減去步驟e）中記錄的對應(yīng)吸光度值，如式(B.1)所示：結(jié)果參見表B.3。圖形表示如圖B.3所示。GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019表B.3UV曝光10min后2NB吸光度的差值?A(i,j)123456789AB0.09900.09200.08700.08900.08500.09300.09700.10000.10500.1140C0.09900.09600.09000.08700.08200.09000.09800.10100.10600.1220D0.10300.10200.09000.08600.08700.08800.10100.10300.10700.1170E0.10200.10300.10000.09200.09100.09900.10100.10600.11100.1180F0.10700.10900.10900.10800.10700.11000.10900.11100.11700.1230G0.11100.11000.11000.10900.11600.11500.11500.11900.12000.1180H注：每個(gè)孔中含有300μL2NB溶液。圖B.3透射儀(λ=365nm)曝光10min后96孔板中100mmol/L2NB溶液的吸光度(λ=540nm)變化?A(i,j)計(jì)算吸光度差值的平均值，如公式(B.2)所示：g）計(jì)算每個(gè)孔的光強(qiáng)校準(zhǔn)因子，如公式(B.3)所示：結(jié)果參見表B.4。圖形表示如圖B.4所示。GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019表B.4光強(qiáng)校準(zhǔn)因子C(i,j)123456789AB1.03131.20121.09781.05261.02100.97240.8956C1.03131.06351.24511.04181.01090.96320.8369D0.99131.00101.01090.99130.95420.8726E1.00100.99131.02101.03131.01090.96320.91980.8653F0.95420.93670.93670.94540.95420.92820.93670.91980.87260.8301G0.91980.92820.92820.93670.88020.88780.88780.85800.85080.8653H注：每個(gè)孔中含有300μL2NB溶液。圖B.4每個(gè)孔的光強(qiáng)校準(zhǔn)因子GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019TiO2NPPCA的實(shí)驗(yàn)室間比對研究C.1研究方式日本產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所（Japan）、泰國計(jì)量研究所（Thailand）、亞利桑那大學(xué)（Arizona）和韓國每個(gè)參與實(shí)驗(yàn)室都獲得了10gNISTSRM1898（二氧化鈦粉體）。根據(jù)已發(fā)布文獻(xiàn)[7]中的方案將此納米材料分散在PBS水溶液中，可獲得平均粒徑為75nm的單峰TiO2NP。材料為銳鈦礦（帶隙Eg=3.2eV）和金紅石（Eg=3.02eV）相的混合物，比例約為3:1。所以，兩個(gè)組分都能被透射儀的UVA光激活（峰值波長λ=365nm，對應(yīng)的光子能量E=3.4eV）。其他所有試劑和設(shè)備均為當(dāng)?shù)夭少?。NIST統(tǒng)計(jì)工程部采集并分析了96孔板讀取器以1min間隔測量的NADH熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。6家實(shí)驗(yàn)室在96孔板上均使用相同的設(shè)計(jì)。在t=0、1、2、……、10min時(shí)，分別對第2列～第10列中每個(gè)孔中熒光強(qiáng)度進(jìn)行6次（對應(yīng)6列）重復(fù)測量。t=1min時(shí)，測量實(shí)例參見表C.1。表C.1在365nm暴光1min后96孔板中NADH熒光強(qiáng)度測量實(shí)例NADH0注：C0為梯度稀釋前TiO2NP儲(chǔ)備溶液的濃度。C.2數(shù)據(jù)分析計(jì)算從第1min開始每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的每個(gè)孔，與0min時(shí)的對于孔的熒光強(qiáng)度比值。該比值稱為pijk，i=1,…,9，j=1,…,6，k=1,…,10。例如，1min時(shí)[其中，i為列數(shù)（濃度），j為行數(shù)（重復(fù)），k=1]，表C.1的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成表C.2的數(shù)據(jù)。表C.2t=1min與t=0min時(shí)NADH熒光強(qiáng)度的比值C.3數(shù)據(jù)擬合每列（NP濃度）的測量值隨時(shí)間的函數(shù)可以通過變點(diǎn)回歸來擬合，即兩個(gè)獨(dú)立的線性回歸：一個(gè)GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019是將數(shù)據(jù)擬合到轉(zhuǎn)變點(diǎn)，另一個(gè)是在轉(zhuǎn)變點(diǎn)之后擬合。前一個(gè)回歸線的斜率是一個(gè)重要參數(shù)。當(dāng)測量時(shí)間tijk<轉(zhuǎn)變時(shí)間tC時(shí)，pijk=(αi-β1i×tC)+β1i×tijkpijk=(αi-β2i×tC)+β2i×tijk=λ2i+β2i×0ijk。將前一個(gè)線性擬合的斜率（參見圖C.1所示）除以第2列（僅含NADH）熒光下降的斜率，并乘以NADH濃度。由擬合獲得的兩個(gè)斜率（參見表C.3）的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，通過不確定度傳遞可獲得結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。注：數(shù)據(jù)相對于t=0min時(shí)歸一化。圖C.1UV暴光1min后NADH熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化圖表C.3NADH光氧化速率隨TiO2NP濃度變化表NADH校準(zhǔn)的斜率50GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019當(dāng)濃度高于10μg/mL，下面的線性回歸模型適用于每家實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)：使用免費(fèi)軟件OpenBUGS通過馬爾科夫鏈蒙特卡洛（BayesianMarkovChainMonteCarlo）方法進(jìn)行擬合。標(biāo)準(zhǔn)不確定度是參數(shù)b后驗(yàn)概率分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差。中位數(shù)的95%置信區(qū)間如表C.4所示，某些實(shí)驗(yàn)室的后驗(yàn)分布不對稱。b不確定度的主要來源是擬合的不確定度，以及兩個(gè)斜率比值的不確定度u1i。β19表C.4conci時(shí)的回歸斜率評估NISTArizonaC.4結(jié)果6家實(shí)驗(yàn)室8次測量的平均斜率b及不確定度界限如圖C.2所示。圖C.295%不確定度界限的斜率b（NISTSRM1898TiO2NP的NADH等效比PCA）C.5認(rèn)可值NISTSRM1898TiO2NP的NADH等效比PCA：b=(0.10±0.02)mmol?min-1?g-1。GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019通過隨機(jī)效應(yīng)元分析獲得了參數(shù)b的認(rèn)可值[8]，可使用NIST認(rèn)可生成器（NICOB）[10-11]應(yīng)用程序容易完成，下載網(wǎng)址：/。這樣生成認(rèn)可值0.10及標(biāo)準(zhǔn)不確定度0.02。NICOB還生成了±1標(biāo)準(zhǔn)不確定度的認(rèn)可圖，其中每家實(shí)驗(yàn)室斜率的±1標(biāo)準(zhǔn)不確定度如圖C.3所示。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室間增加了不確定度分量時(shí)，不確定度也隨之放大。說明：認(rèn)可值μ和區(qū)間μ±u(μ)測量值xjxj±ujxj±(uj2+τ2)1/2圖C.3具有標(biāo)準(zhǔn)不確定度界限的認(rèn)可值bGB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019參考文獻(xiàn)[1]ISO10676,Fineceramics(advancedceramics,advancedtechnicalceramics)—Testmethodforwaterpurificationperformanceofsemiconductingphotocatalyticmaterialsbymeasurementofformingabilityofactiveoxygen[2]ISO10678,Fineceramics(advancedceramics,advancedtechnicalceramics)—Determinationofphotocatalyticactivityofsurfacesinanaqueousmediumbydegradationofmethyleneblue[3]ISO18153:2003,Invitrodiagnosticmedicaldevices—Measurementofquantitiesinbiologicalsamples—Metrologicaltraceabilityofvaluesforcatalyticconcentrationofenzymes