等電點(diǎn)電泳原理步驟詳細(xì)

等電點(diǎn)電泳原理步驟詳細(xì)一、IEFE定義

IEFE一種利用具有pH梯度得支持介質(zhì)分離等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)不同得蛋白質(zhì)得電泳技術(shù)。

Isoelectricfocusing(IEF),isatechniqueforseparatingdifferentmoleculesbytheirelectricchargedifferences、

等電聚焦(Isoelectricfocusing,IEF)就就是在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)(Carrierampholyte),當(dāng)通以直流電時(shí),兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步增加得pH梯度,在此體系中,不同得蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦于其相當(dāng)?shù)玫入婞c(diǎn)位置上,也就就是說(shuō)被聚焦于一個(gè)狹得區(qū)帶中,電泳技術(shù)中得等電點(diǎn)聚焦也稱(chēng)為聚焦電泳。

講課內(nèi)容

IEFE定義

1

IEFE的特點(diǎn)

2

IEFE的基本原理3

IEFE的應(yīng)用4

血紅蛋白的等電聚焦電泳（實(shí)驗(yàn)）

5二、IEFE得特點(diǎn)

(一)優(yōu)點(diǎn)HighResolutionHighSensitivity

GoodReproduction(二)缺點(diǎn)1、要求用無(wú)鹽溶液,而在無(wú)鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀。2、樣品中得成分必須停留在其pI,不適用在pI不溶或發(fā)生變性得蛋白質(zhì)。分辨率(resolution)較不連續(xù)PAGE更高,特別適合于分離分子量(molecuarweight,MW)相同而電荷(electriccharge)不同得生物大分子。

QM=——6

r

講課內(nèi)容

IEFE定義

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IEFE的特點(diǎn)

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IEFE的基本原理3

IEFE的應(yīng)用4

血紅蛋白的等電聚焦電泳（實(shí)驗(yàn)）

5三、IEFE得基本原理蛋白質(zhì)分子在不同pH下得解離狀態(tài)

NH3+NH3+NH2PPPCOOHCOO-COO-

pH＜pIpH＝pIpH＞pI

在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes)

,當(dāng)通入直流電時(shí),兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極(anode)到負(fù)極(cathode)逐漸增加得pH梯度,正極附近就是低pH區(qū),負(fù)極附近就是高pH區(qū)。大家有疑問(wèn)的，可以詢(xún)問(wèn)和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)蛋白質(zhì)分子得電聚焦過(guò)程

+pI1

pI2

pH=pIpI3

pIn-

abc

蛋白質(zhì)分子在負(fù)極端蛋白質(zhì)分子在正極端蛋白質(zhì)樣品中各組分聚焦成區(qū)帶

—+

在這個(gè)從正極到負(fù)極pH逐漸增加得直流電場(chǎng)中,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入這個(gè)環(huán)境,不同得蛋白質(zhì)帶上不同性質(zhì)與數(shù)量得電荷,向著一定方向移動(dòng),遷移到與其相同得等電點(diǎn)位置上停留下來(lái),即被聚焦于一個(gè)狹得區(qū)帶中,得以分離。TheproteinsbeefocusedintosharpstationarybandswitheachproteinpositionedatapointinthepHgradientcorrespondingtoitspI、

進(jìn)行IEFE必須具備3個(gè)條件:①有一個(gè)在電泳條件下基本穩(wěn)定、重復(fù)性良好得pH梯度②有一個(gè)抗對(duì)流得電泳材料,使已經(jīng)分離得樣品不再重新混合③電泳后有適當(dāng)?shù)梅椒▉?lái)鑒定分離得區(qū)帶(一)pH梯度得建立

用多種兩性電解質(zhì)(ampholytes)混合物建立穩(wěn)定良好得pH梯度1、理想得載體兩性電解質(zhì)(Carrierampholytes)應(yīng)具備得特征:

①分子量要小,以便與被分離大分子物質(zhì)分離;②化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定;③各成分得pI彼此接近,并在其pI值附近有良好得緩沖能力;④在pI處具有足夠得電導(dǎo),導(dǎo)電性均勻;⑤兩性電解質(zhì)載體得數(shù)目要足夠多;⑥可溶性好;⑦對(duì)280nm得紫外光沒(méi)有或僅有很低得吸光度,不干擾樣品得測(cè)定。2、載體兩性電解質(zhì)得合成

本質(zhì):一系列脂肪族(aliphaticampholytes)多氨基多羧酸同系物與異構(gòu)體,具有很多既不相同又十分接近相互連接得pI值。pH范圍:pH3~10丙烯酸+多乙烯多胺

Ampholine(LKB)加成反應(yīng)3、pH梯度得形成

載體兩性電解質(zhì)(Carrierampholytes)就是一系列不同分子得兩性電解質(zhì)得混合物,在通電后,它們各自遷移到適當(dāng)位置形成一個(gè)連續(xù)得pH梯度(pHgradient)。

㈠沒(méi)通電時(shí)得變化所有得載體兩性電解質(zhì)(Carrierampholytes)分子都荷電,只就是溶液中荷正電與荷負(fù)電得基團(tuán)數(shù)目相等,凈電荷(netcharge)為零。㈡引入電場(chǎng)時(shí)得變化載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes)分子將向陰極(cathode)或陽(yáng)極(anode)遷移,帶有最低等電點(diǎn)得分子(荷最多得負(fù)電)將最快地向陽(yáng)極遷移。當(dāng)它達(dá)到凈電荷就是零得位置時(shí)才停止。其次一些低pI得載體兩性電解質(zhì)分子(荷其次多得負(fù)電)也將向陽(yáng)極移動(dòng),直到它得凈電荷被減少到零才停止。㈢電泳結(jié)束后得變化

所有得載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes)分子以增加pI級(jí)數(shù)得辦法將分別在陽(yáng)、陰極之間到達(dá)它們自己得位置而給出一個(gè)pI梯度。電解槽中,通電后,正負(fù)兩極都會(huì)發(fā)生電極反應(yīng):正極端反應(yīng):6H2O→O2+4H3O++4e-負(fù)極端反應(yīng):4H2O+4e-→2H2+4OH-在負(fù)極引起pH值得升高,在正極pH下降,另外在電極槽得正極端放得就是酸性溶液,負(fù)極端放得就是堿性溶液造成了在電極附近pH得急劇變化

由于載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes)就是一系列不同分子得兩性電解質(zhì)得混合物所組成得,設(shè)其中某一成分為A,它得pI=pH’,當(dāng)環(huán)境中得pH>pH’時(shí),它帶負(fù)電荷,朝正極移動(dòng)。

當(dāng)環(huán)境pH<pH’時(shí),它帶正電荷,朝負(fù)極移動(dòng),直至移動(dòng)到它得等電點(diǎn)處,在那里聚集。由于兩性電解質(zhì)A在它得pI處具有一定得緩沖能力,因此在它附近形成一個(gè)pH穩(wěn)定區(qū)域。

同樣載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes)中各種兩性電解質(zhì)也會(huì)各自遷移到它們得等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)處,由于它們得數(shù)量足夠多,各自得等電點(diǎn)相差很小,從而形成一個(gè)pH梯度。(二)支持介質(zhì)(medium)得選擇

作用:防止擴(kuò)散抗對(duì)流liquidmedium:蔗糖、Ficollgelmedium:agarose、sephadex、PAG(三)聚焦后得檢測(cè)方法各種染色法掃描與定量其它檢測(cè)方法講課內(nèi)容

IEFE定義

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IEFE的特點(diǎn)

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IEFE的基本原理3

IEFE的應(yīng)用4

血紅蛋白的等電聚焦電泳（實(shí)驗(yàn)）

5四、IEFE得應(yīng)用

ApplicationsofIEF1、分析分離制備蛋白質(zhì)、多肽①區(qū)分人血清蛋白②測(cè)出異常免疫球蛋白③基因分型④csf中寡克隆區(qū)帶得檢測(cè)2、測(cè)定pI可鑒定蛋白質(zhì)、多肽3、雙相電泳中,IEF作為第一相雙向電泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)考馬斯亮藍(lán)銀染講課內(nèi)容

IEFE定義

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IEFE的特點(diǎn)

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IEFE的基本原理3

IEFE的應(yīng)用4

血紅蛋白的等電聚焦電泳（實(shí)驗(yàn)）

5實(shí)驗(yàn)血紅蛋白得等電聚焦電泳Hb具有四條多肽鏈

(α、β、γ、δ)

HbA正常成人血中主要得Hb成分。HbA2

正常成人Hb中得一個(gè)次要成分,當(dāng)

胎兒出生時(shí),其濃度不到1%,以后

稍增多,在正常成人中其平均值自

2、