奮森疏螺旋體PCR檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)原理

第第頁(yè)奮森疏螺旋體PCR檢測(cè)試劑盒?試驗(yàn)原理奮森疏螺旋體PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)使用方法：測(cè)定法的靈敏度來(lái)自作為報(bào)告的酶。酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供察看的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。因此該體系常被稱(chēng)為酶放大體系。1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋?zhuān)罕驹噭┖泄?yīng)原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶(hù)可依照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。24μg/ml5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液12μg/ml4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液6μg/ml3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液3μg/ml2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5μg/ml1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2.奮森疏螺旋體PCR檢測(cè)試劑盒加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。|3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。7.溫育：操作同3、8.洗滌：操作同5、9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.10.停止：每孔加停止液50μl，停止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。11.測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加停止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。奮森疏螺旋體PCR檢測(cè)試劑盒試驗(yàn)規(guī)定：1、要保證移液槍的準(zhǔn)確性，誤差不能超出2%?？捎盟碗娮犹炱竭M(jìn)行確定。但有專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行矯正。2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后，要更換槍頭。即使是吸取標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)。3、要在試驗(yàn)前1小時(shí)將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復(fù)到室溫，以使結(jié)果更穩(wěn)定。4、試驗(yàn)時(shí)，要使底物避光保管。5、用槍吸取液體時(shí)速度不能太快，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準(zhǔn)確。6、吸取液體時(shí)，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。7、將液體加到酶標(biāo)孔中時(shí)，避開(kāi)槍頭和孔內(nèi)液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會(huì)自然流下去。8、液體全部加完后，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕輕晃動(dòng)30秒，混勻液體。也可以用酶標(biāo)儀的晃動(dòng)功能。9、應(yīng)盡量做雙孔試驗(yàn)，這樣才略保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。10、對(duì)結(jié)果有疑問(wèn)的樣品要用其它方法進(jìn)行確證。奮森疏螺旋體PCR檢測(cè)試劑盒試驗(yàn)注意事項(xiàng)：1）RTPCR可以檢測(cè)組織、細(xì)胞、血液、細(xì)菌等很多料子，不同的樣本有不同要求，試驗(yàn)前請(qǐng)充分溝通確認(rèn)試驗(yàn)方案和樣本情況；2）客戶(hù)盡可能供應(yīng)試驗(yàn)的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱(chēng)和ID號(hào)；3）客戶(hù)盡量不要供應(yīng)DNA或RNA樣品。4）樣本保管于液氮或干冰，也可以保管于Trizol液中。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitativerealtimePCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，*通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包含探針類(lèi)和非探針類(lèi)兩類(lèi)，探針類(lèi)是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的加添，非探針類(lèi)是利用熒光染料或者特異性設(shè)計(jì)的引物來(lái)指示擴(kuò)增的加添。運(yùn)用該技術(shù)可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行定量