脂肪組織來源的干細(xì)胞提取、制備及儲存質(zhì)量管理專家共識

脂肪組織來源的干細(xì)胞提取、制備及儲存質(zhì)量管理專家共識脂肪組織來源的干細(xì)胞(adiposetissue-derivedstromal/stemcells，ASCs)是從脂肪組織中分離提取得到的，具有取材容易、對機(jī)體損傷小、體內(nèi)儲備量大、體外可大規(guī)模培養(yǎng)、可多向分化等優(yōu)點(diǎn)。ASCs在人體修復(fù)重建、免疫調(diào)節(jié)及組織再生等方面的應(yīng)用成為近年來干細(xì)胞研究的重要內(nèi)容，也是組織工程及再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。大量研究表明，自體脂肪組織移植到軟組織缺損部位后，其中40%~60%會被吸收，自體脂肪組織結(jié)合ASCs移植，能明顯減少自體脂肪組織移植的吸收、液化、壞死及纖維化等情況發(fā)生，有利于構(gòu)建具有生物學(xué)結(jié)構(gòu)和功能的脂肪組織。同時，利用脂肪組織可以進(jìn)行大規(guī)模的ASCs提取、制備、儲存，為再生醫(yī)學(xué)提供種子細(xì)胞。目前，國內(nèi)外尚缺乏ASCs提取、分離、制備及儲存的標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量管理規(guī)范，導(dǎo)致各制備機(jī)構(gòu)或研究應(yīng)用機(jī)構(gòu)之間無法進(jìn)行統(tǒng)一評估和交流，嚴(yán)重制約了ASCs在皮膚軟組織修復(fù)重建等相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。為了建立安全、規(guī)范、穩(wěn)定、可追溯的行業(yè)共識、指南及標(biāo)準(zhǔn)，從源頭保證ASCs的提取、制備、儲存的高質(zhì)性和安全性，中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會皮膚軟組織修復(fù)與重建技術(shù)分會聯(lián)合從事細(xì)胞制備和存儲、皮膚軟組織修復(fù)重建、分子生物學(xué)及整形和美容外科等多學(xué)科的專家，參照中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會《細(xì)胞庫質(zhì)量管理規(guī)范》及《干細(xì)胞制劑制備質(zhì)量管理自律規(guī)范》，組織起草脂肪組織采集及ASCs制備、檢測、儲存的標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量管理專家共識，旨在促進(jìn)ASCs在皮膚軟組織修復(fù)重建技術(shù)等領(lǐng)域研究成果的轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步促進(jìn)多學(xué)科的交流和發(fā)展。1脂肪組織采集1.1脂肪組織采集機(jī)構(gòu)要求脂肪組織的采集工作應(yīng)在取得《醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證》的醫(yī)療機(jī)構(gòu)中實(shí)施。采集人員應(yīng)持醫(yī)師或者護(hù)士執(zhí)業(yè)證書，經(jīng)過相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)。采集機(jī)構(gòu)應(yīng)具有完整的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程(standardoperationprocedure，SOP)，并備有采集過程中的應(yīng)急預(yù)案。采集過程應(yīng)在層流手術(shù)室內(nèi)進(jìn)行無菌操作，最大限度地減少污染和交叉感染的發(fā)生。1.2脂肪組織供者要求對供者健康狀況進(jìn)行全面檢查(如一般信息、既往病史和家族性遺傳病等)及病原微生物的感染篩查和在危險疫區(qū)停留情況的調(diào)查。身體狀態(tài)良好、有完整體檢報(bào)告、無遺傳性家族病史、無惡性腫瘤、無急慢性傳染病及血液系統(tǒng)疾??；血常規(guī)及分類、肝腎功能正常；人源性特定病毒(包括但不僅限于HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)陰性、梅毒螺旋體陰性(提供脂肪組織的同時，另需提供不少于8ml外周血用于復(fù)檢，ABO血型、HLA-Ⅰ類和Ⅱ類分型檢查，以備追溯性查詢)。若供者HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV檢查結(jié)果為陽性，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有處理感染性樣本的獨(dú)立物理空間、獨(dú)立的空調(diào)系統(tǒng)，能做到使用后的器具和相關(guān)物品可經(jīng)過滅活處理后再移出該區(qū)域。感染性樣本與非感染性樣本的處理及制備不使用同一設(shè)備，方可進(jìn)行脂肪組織的采集，但必須使供者知情，同時通知接收、制備、質(zhì)控及醫(yī)護(hù)人員等做好防護(hù)措施。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室不具備上述相對應(yīng)病原體陽性制備/培養(yǎng)區(qū)時，不得采集上述陽性供者的脂肪組織。若供者HIV、梅毒螺旋體檢查結(jié)果為陽性時，不得采集供者的脂肪組織。高度懷疑HIV感染或者考慮HIV感染窗口期的供者不予采集。1.3采集方式、采集部位和采集量1.3.1采集方式用腫脹液(生理鹽水250ml＋2%利多卡因10~15ml＋腎上腺素0.25mg)局部浸潤麻醉供脂肪組織區(qū)域，以20ml注射器配備口徑1.5~3.5mm、側(cè)孔3.0~5.0mm的吸脂針，進(jìn)入供區(qū)，形成負(fù)壓，呈扇形手動均勻吸取脂肪組織，吸出3~5mm3脂肪組織顆粒，若脂肪組織顆粒較大，則需要進(jìn)行手工剪制。1.3.2采集部位選擇下腹部或者大腿內(nèi)、外側(cè)或者身體其他部位(供者要求的吸脂部位)。接受注射溶脂、冷凍溶脂、熱立塑及超聲溶脂的部位不建議作為脂肪組織采集部位。供區(qū)針眼或切口處按壓排除腫脹液，進(jìn)行適當(dāng)?shù)募訅喊?4~48h后更換包扎敷料，預(yù)防感染，7d針眼或切口愈合。1.3.3采集量(脂肪組織，腫脹液除外)女性≤45歲，男性≤50歲，脂肪組織采集量不少于50ml。女性45~55歲、男性50~60歲者不少于80ml。男性體脂＞25%、腰圍＞100cm，女性體脂＞33%、腰圍＞88cm，不少于100ml。體脂率=[1.2×BMI+0.23×年齡－5.4－10.8×性別系數(shù)(男=1，女=0)]。女性＞55歲，男性＞60歲，或者近期服用減肥藥者不建議采集脂肪組織提取ASCs。1.4脂肪組織運(yùn)輸和接收吸取的脂肪組織應(yīng)保存于標(biāo)準(zhǔn)配置的無菌容器內(nèi)，貼條碼標(biāo)簽，應(yīng)遵從安全與準(zhǔn)確的原則，做到樣本與供者一一對應(yīng)，記錄啟運(yùn)時間和到達(dá)時間，低溫冷鏈運(yùn)輸，建議時間控制在48h內(nèi)，送達(dá)制備機(jī)構(gòu)。制備機(jī)構(gòu)應(yīng)設(shè)置脂肪組織的接收取樣工作區(qū)，執(zhí)行登記、初檢、核對、暫存、交接等；目檢脂肪組織有無污染或變質(zhì)，應(yīng)建立脂肪組織異常情況處置標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。2ASCs的制備與儲存制備機(jī)構(gòu)或研究應(yīng)用機(jī)構(gòu)應(yīng)建立相應(yīng)完善的SOP，所有試劑和原材料應(yīng)明確其來源、批號、質(zhì)量檢定合格報(bào)告，應(yīng)盡可能采用GMP臨床應(yīng)用級別的原料或國家已批準(zhǔn)的可臨床應(yīng)用的產(chǎn)品，相關(guān)制備、生產(chǎn)記錄及留樣應(yīng)至少保存至使用結(jié)束后3個月。制備人員應(yīng)該經(jīng)過專門的技術(shù)培訓(xùn)，ASCs的制備建議在B級背景下A級潔凈度級別的環(huán)境中進(jìn)行。2.1脂肪干細(xì)胞的分離采集的脂肪組織用無菌生理鹽水沖洗，按照脂肪組織體積加入相應(yīng)濃度Ⅰ型膠原酶(建議GMP級)或胰蛋白酶混合液，37℃水浴或氣浴振蕩，離心，吸棄上層脂肪和液體層，加入生理鹽水重懸細(xì)胞沉淀，用細(xì)胞濾器過濾，去除未消化完全的組織團(tuán)塊，濾液離心，棄上清，獲得基質(zhì)血管成分(stromalvascularfraction，SVF)。SVF是圍繞在脂肪細(xì)胞周圍，含有內(nèi)皮細(xì)胞、非特征性基質(zhì)細(xì)胞、血液細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、造血祖細(xì)胞、脂肪來源的基質(zhì)/干細(xì)胞等細(xì)胞的異質(zhì)性細(xì)胞群，臺盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。填寫細(xì)胞操作記錄，包括組織酶解分離時間、細(xì)胞數(shù)量和活性等。2.2脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代接種SVF至培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃常規(guī)培養(yǎng)，保持濕度。細(xì)胞融合度達(dá)到70%~80%時可以傳代，收集消化的細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)瓶中，傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基應(yīng)使用無血清培養(yǎng)基或不含血清添加物的細(xì)胞培養(yǎng)基。填寫細(xì)胞操作記錄，包括時間、批次、細(xì)胞數(shù)量等。2.3建立脂肪干細(xì)胞種子細(xì)胞庫收集P2或P3代細(xì)胞，做質(zhì)量檢測和性能指標(biāo)檢測(包括細(xì)菌、支原體、內(nèi)外源病毒、細(xì)胞活力、細(xì)胞鑒別、生長特性、細(xì)胞純度、均一性及內(nèi)毒素等)，調(diào)整細(xì)胞濃度至(2~3)×106個/ml，分裝至細(xì)胞凍存管中，貼標(biāo)簽，標(biāo)注細(xì)胞數(shù)量、凍存日期及代次等。將凍存管程序降溫后，轉(zhuǎn)入–196℃液氮保存，即為種子細(xì)胞庫，供建立工作細(xì)胞庫用。填寫細(xì)胞操作記錄，包括時間、批次、細(xì)胞數(shù)量、凍存數(shù)量等。2.4建立脂肪干細(xì)胞工作細(xì)胞庫經(jīng)脂肪干細(xì)胞種子細(xì)胞庫傳代增殖，將傳至P5代的細(xì)胞制成均質(zhì)細(xì)胞懸液，取樣進(jìn)行臨床使用前的質(zhì)量控制和安全鑒定。分裝于一定數(shù)量的凍存管，貼好對應(yīng)批次細(xì)胞標(biāo)簽，保存于–196℃液氮中，即為工作細(xì)胞庫。填寫細(xì)胞操作記錄，包括時間、批次、細(xì)胞數(shù)量、凍存數(shù)量等。工作細(xì)胞庫的質(zhì)量控制和安全鑒定＞種子細(xì)胞庫質(zhì)量控制和安全鑒定。2.5脂肪干細(xì)胞凍存數(shù)量脂肪干細(xì)胞凍存的數(shù)量是根據(jù)實(shí)際需求來計(jì)算的，應(yīng)考慮后續(xù)檢定需要、保藏年限、檢測用數(shù)量及復(fù)檢頻率等，根據(jù)個體的需要確定，遵循“夠用原則”。ASCs細(xì)胞制劑建議設(shè)1×107個ASCs為1個單位。填寫細(xì)胞操作記錄，包括時間、批次、細(xì)胞數(shù)量、凍存數(shù)量等。3ASCs的運(yùn)輸3.1參照中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會《干細(xì)胞制劑制備質(zhì)量管理自律規(guī)范》，ASCs制劑采取冷鏈運(yùn)輸，建議運(yùn)輸時間控制在48h內(nèi)。3.2應(yīng)建立ASCs制劑運(yùn)輸?shù)臉?biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，運(yùn)輸方式等應(yīng)經(jīng)過驗(yàn)證。防止發(fā)生損害、變質(zhì)、污染或其他不良影響。每批次ASCs制劑的整個運(yùn)輸過程應(yīng)有發(fā)運(yùn)記錄，并能夠追蹤。3.3若存在安全隱患，應(yīng)立即召回ASCs制劑，由制備機(jī)構(gòu)進(jìn)行合法和符合倫理要求的處置并記錄存檔。3.4制備機(jī)構(gòu)如委托第三方機(jī)構(gòu)運(yùn)輸ASCs制劑，應(yīng)評估其承運(yùn)機(jī)構(gòu)的資質(zhì)。承運(yùn)人應(yīng)接受制備機(jī)構(gòu)相應(yīng)的培訓(xùn)，確保其可按照脂肪干細(xì)胞制劑運(yùn)輸要求完成運(yùn)輸過程。應(yīng)由設(shè)有資質(zhì)的第三方機(jī)構(gòu)復(fù)核ASCs制劑運(yùn)輸。4ASCs的質(zhì)量安全性制備機(jī)構(gòu)根據(jù)ASCs自身特性、臨床研究情況，配備相關(guān)專業(yè)技術(shù)人員和設(shè)備，確立制劑質(zhì)量檢驗(yàn)操作規(guī)程，所有檢測方法應(yīng)經(jīng)過驗(yàn)證，可以委托有資質(zhì)的第三方開展相關(guān)質(zhì)量檢測。檢驗(yàn)應(yīng)滿足安全性、質(zhì)量可控性和(或)有效性的基本要求，檢測結(jié)果應(yīng)有質(zhì)量負(fù)責(zé)人或質(zhì)量受權(quán)人簽字審核。4.1基本性能ASCs的基本性能指標(biāo)包括細(xì)胞形態(tài)、周期倍增時間、細(xì)胞活性、增殖、細(xì)胞表型、集落形成、端粒酶活性等。4.2安全性能ASCs的安全性能指標(biāo)包括微生物、內(nèi)毒素、核型、致瘤性、毒性、殘留物及人畜共患豬細(xì)小病毒檢測，必要時包括病毒核酸檢測，確保ASCs制劑臨床應(yīng)用的安全性。如果Asc采用胰蛋白酶消化,建議檢測豬細(xì)小病毒。5ASCs的分化功能測定5.1向成骨細(xì)胞分化能力取對數(shù)生長的ASCs，加入成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)，第19天行茜素紅染色，鏡下觀察。脂肪干細(xì)胞被茜素紅染成紅色，染色面積占總面積的比例≥50%。5.2向成軟骨細(xì)胞分化能力取對數(shù)生長的ASCs，加入成軟骨誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)，第14天行甲苯胺藍(lán)或Ⅱ型膠原蛋白抗體進(jìn)行染色分析，染色面積占總面積比例≥80%。5.3向成脂肪細(xì)胞分化能力取對數(shù)生長的ASCs，加入成脂肪分化條件培養(yǎng)基，第12天行油紅O染色，脂肪干細(xì)胞被油紅O染成紅色，染色面積占總面積的比例≥50%。6ASCs的組織再生功能檢測6.1促血管形成功能用含100ml/LFBS的DMEM/F12培養(yǎng)體系將ASCs以1×105個/ml密度與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)_胞共培養(yǎng)，4h后，鏡下統(tǒng)計(jì)形成的血管環(huán)數(shù)≥37/10000個細(xì)胞。6.2巨噬細(xì)胞極化用含100ml/LFBS的DMEM/F12培養(yǎng)體系將ASCs以1×105個/ml密度與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，24h后，與巨噬細(xì)胞對照組相比，用ELISA試劑盒檢測上清中TNF-α、IL-1β、TGF-β及IL-10的表達(dá)水平，其中TNF-α、IL-1β水平應(yīng)下降，TGF-β、IL-10水平應(yīng)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。6.3抗凋亡功能ASCs培養(yǎng)24h后，取上清液，培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，與普通培養(yǎng)基成纖維細(xì)胞對照組相比，ASCs上清液培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞組，成纖維細(xì)胞凋亡比例下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。此三項(xiàng)內(nèi)容建議為ASCs質(zhì)量的參考指標(biāo)，應(yīng)為制備機(jī)構(gòu)或研究應(yīng)用機(jī)構(gòu)ASCs研究內(nèi)容。7追溯7.1應(yīng)建立完整的ASCs制備記錄系統(tǒng)、標(biāo)識標(biāo)簽系統(tǒng)、ASCs細(xì)胞制劑編碼系統(tǒng)，以便于辨識并防止制劑混雜。7.2ASCs制備記錄包括每天的細(xì)胞狀況、細(xì)胞數(shù)量、培養(yǎng)條件等具體信息。標(biāo)識系統(tǒng)應(yīng)記錄供者信息、脂肪組織收獲日期及ASCs制備時間、細(xì)胞數(shù)量/體積、儲存條件等。7.3每份ASCs細(xì)胞制劑應(yīng)編制唯一的編碼。編碼應(yīng)能追溯到供者信息以及該細(xì)胞制劑操作和最終處理的所有記錄。7.4轉(zhuǎn)移和運(yùn)輸記錄應(yīng)能追溯ASCs由采集機(jī)構(gòu)到制備儲存機(jī)構(gòu)的所有流轉(zhuǎn)過程。參與制訂專家共識人員：湯蘇陽：中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會皮膚軟組織修復(fù)重建技術(shù)分會主任委員，原武警總醫(yī)院皮膚再生醫(yī)學(xué)科主任史央：江蘇得康生物科技有限公司技術(shù)總監(jiān)鄭巖：成都華美紫馨醫(yī)學(xué)美容醫(yī)院主任于卉影：原沈陽軍區(qū)總醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室主任邵小燕：上海賽傲生物技術(shù)有限公司技術(shù)總監(jiān)，中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會皮膚軟組織修復(fù)與重建技術(shù)分會細(xì)胞制備與存儲學(xué)組組長陳惠華：北京恒峰銘成生物科技有限公司技術(shù)總監(jiān)共識評審專家：夏照帆：中國工程院院士，海軍軍醫(yī)大學(xué)全軍燒傷研究所所長艾玉峰：美萊集團(tuán)總醫(yī)院院長，中國醫(yī)師協(xié)會美容與整形醫(yī)師分會副會長，中國整形美容協(xié)會美容與再生醫(yī)學(xué)分會副會長，中國整形美容協(xié)會民營醫(yī)療機(jī)構(gòu)分會副會長，PAAFRRS中國整形分會副主席楊力：四川華美紫馨醫(yī)學(xué)美容醫(yī)院院長，中華醫(yī)學(xué)會整形外科分會腫瘤整形外科學(xué)組副組長，中華醫(yī)學(xué)會整形外科分會血管瘤與脈管畸形學(xué)組副組長郜恒駿：中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會生物樣本庫分會主任委員，上海分子醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心主任，上海生物芯片國家工程研究中心副主任蔡志剛：北京大學(xué)口腔醫(yī)院副院長，中華醫(yī)學(xué)會組織再生專業(yè)委員會常委馬潔：北京醫(yī)院生物治療中心主任魏英杰：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外醫(yī)院心血管疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教授(PI)王建華：首都兒科研究所生物技術(shù)研究室教授(PI)張傳宇：中國研究型醫(yī)院學(xué)會細(xì)胞研究與治療專業(yè)委員會副主任委員郝好杰：中國香港生命工程研究院首席教授侯明曉：原沈陽軍區(qū)總醫(yī)院院長，全軍醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)委員會重癥醫(yī)學(xué)委員會副主任委員胡敏捷：蘇州般若生物科技有限公司總經(jīng)理姜篤銀：山東大學(xué)第二附屬醫(yī)院燒傷整形科主任史春夢：陸軍醫(yī)科大學(xué)創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副主任，復(fù)合傷分室主任盧安軍：銀河生物江蘇得康公司