PGDPGS技術臨床應用及相關遺傳咨詢

體外受精過程中，對具有單基因病及染色體非整倍性遺傳風險的胚胎，行單基因病及染色體結構和數(shù)目異常的檢測，選擇無特定基因異常、染色體結構和數(shù)目正常的胚胎植入母體子宮。從而提高患者的臨床妊娠率，降低流產率及子代出生缺陷風險的技術。PCR 聚合酶鏈式反應FISH 熒光原位雜交CMA 染色體微陣列分析NGS 高通量測序技術成熟有較多的胚胎可供活檢支持新鮮胚胎移植Blastomere存在整倍體與非整倍體嵌合現(xiàn)象，可信度不高對胚胎的后續(xù)發(fā)育有不良影響臨床妊娠率較低可信度更高相對更安全胚胎發(fā)育基本無不利影響臨床妊娠率較高TEICM囊胚形成數(shù)目有限，可供活檢的胚胎較少需要冷凍胚胎不能新鮮移植D5

非整倍性比率D5

較D3

染色體整倍性比例高染色體非整倍性胚胎具有自我修復的能力D5檢測，減少了嵌合帶來的誤診，結果更可靠D5臨床結局胚胎的損傷小平均治療周期少移植胚胎數(shù)量少植入率增加多胎率降低持續(xù)臨床妊娠率增加活產率增加高保真、均一的全基因組擴增胚胎活檢1-5個細胞10pg級DNA含量聚合酶鏈式反應PCR熒光原位雜交FISHPGD/PGS檢測技術除FISH外，均需105

pg級DNA檢測起始量高通量測序NGS微陣列雜交CMAFISH高分辨率多個基因位點或片段PCR高分辨率單個突變位點檢查Array分辨率Mb水平基因組固定雜交位點高分辨率覆蓋整個基因組NGS聚合酶鏈式反應PCR分辨率單堿基對照標尺：可以識別單個堿基異常局限性：無法進行大片段分析，例如：易位、倒位、三體等。特點：能做單細胞定位點的分析?？捎糜赑GD熒光原位雜交FISH分辨率50kb對照標尺：比G顯帶提高了100倍的分辨率0 5||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||局限性：無法完成23對染色體同時檢測。特點：能做單細胞特定位點的分析，可用于PGD/PGS。對照標尺：0 5 1015202530|

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|比G顯帶提高了10倍的分辨率//特點：能做單細胞23對，染色體CNV分析。適用于PGD/PGS局限性：只能對預設定染色體片段進行分析。不能發(fā)現(xiàn)設定范圍之外的異常。微陣列雜交CMA（aCGH、aSNP）分辨率0.5Mb高通量測序NGS，分辨率Mb~bp，隨測序深度增加，可實現(xiàn)單堿基讀取優(yōu)勢：能開放式完成單細胞23對染色體CNV分析及單基因病診斷，適用于PGD/PGS。測序深度染色體非整倍體唐氏綜合征、愛德華氏綜合征、等染色體微缺失微重復綜合征Digeorge綜合征、貓叫綜合征、等單基因病DMD、地中海貧血、苯丙酮尿癥等…AAGCTTGCGACTTCAGTTAGCGCTAAGCCAGTGCATG…又稱二代測序技術，是以大規(guī)模并行測序為特征，可一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定。由于NGS實現(xiàn)了大量片段的并行處理，測序效率較經典Sanger測序提高了成千上萬倍，同時單位測序量的成本僅為Sanger測序的萬分之一。覆蓋度：覆蓋全基因組靈敏度：隨測序深度的提高而提高準確度：定量水平數(shù)據(jù)分析：可持續(xù)升級，可隨數(shù)據(jù)庫更新重新分析特異性數(shù)據(jù)分析：能發(fā)現(xiàn)新的基因突變、基因融合等數(shù)據(jù)庫依賴：不依賴于數(shù)據(jù)庫無雜交干擾、一致性好、能夠檢測染色體平衡易位等反復胚胎植入失敗、復發(fā)性流產不良孕產史、女方年齡≥35歲嚴重男性不育癥親代染色體正常，但存在上述指征染色體異常：結構、數(shù)目異常單基因疾病：常顯、常隱、X連鎖親代有已知單基因病或染色體異常指征周期占比夫婦染色體異常352416.21%單基因病診斷353016.24%性別選擇---性連鎖10574.86%PGS1305360.03%社會原因性別選擇5792.66%總計21743ESHREPGDconsortiumdatacollectionIX,

2009染色體異常：結構、數(shù)目異常單基因疾?。撼ｏ@、常隱、X連鎖K.HaapaniemiKouruetal.HumanReproduction,Vol.27,No.9pp.2843–2849,

2012瑞典斯德哥爾摩PGD中心1996年~2009年256對夫婦569個促排卵周期Part

1數(shù)目異常（純合或嵌合）結構異常（純合或嵌合）性染色體Turner綜合征（45，XO）易位相互易位克氏綜合征（47，XXY）羅氏易位超雌、超雄（47，XXX或XYY）缺失倒位常染色體21三體重復標記染色體染色體結構異常類型正常配子攜帶者表型正常相互易位1/181/181/9羅氏易位1/61/61/3倒位1/41/41/2子宮內膜損傷心里負擔不孕復發(fā)性流產臨床診斷思路被 動流產組織染色體CNV檢測孕中期羊水穿刺主 動胚胎植入前遺傳學診斷結果對后續(xù)診治有參考價值對染色體病患兒實施引產篩選染色體CNV正常胚胎植入適應癥強度子代風險度評估患者受益PGD結局風險預測親代染色體異常遺傳咨詢要點病史及相關檢查：進周期前遺傳咨詢：進周期前遺傳咨詢：促排卵：遺傳咨詢與溝通：遺傳學檢測及結果：新發(fā)片段異常Part

2隱匼性強種類繁多輔助生殖難度大單基因遺傳病特點懷孕期間無異常，漏診率極高。需一定年齡才發(fā)病，對患者及家庭造成嚴重影響目前發(fā)現(xiàn)6600多種表型各異屬于試管嬰兒中最復雜情況，需個體化精準治療無法干預：隨機生育患病或健康孩子羊水穿刺：可以引產阻斷但會造成身、心損傷植入前遺傳學診斷PGD：主動選擇完全健康胚胎，進而完成孕育經驗醫(yī)療詢證醫(yī)學精準醫(yī)療

單體型分析

分子診斷 特異標記分子位點保證后繼準確篩選

PGD+PGS篩選正常胚胎植入母體孕育

構建家系

遺傳咨詢 尋找治病分子位點掌握疾病遺傳規(guī)律咨詢病情了解家史1.

目標區(qū)域捕獲聯(lián)合高通量測序技術全外顯子高通量測序技術基于高通量測序的單體型分析實現(xiàn)了單基因病準確、快速的分子診斷，同時防止了胚胎篩選過程中ADO產生的假陰性結果。適應癥強度遺傳家系圖譜疾病遺傳類型子代風險度評估患者受益PGD結局風險預測產前診斷必要性告知遺 單傳 基咨 因詢 遺要 傳點 病單病類型子代風險常染色體顯性遺傳

AD1/2正常；1/2患病常染色體隱性遺傳

AR1/4正常；1/2攜帶；1/4患病性連鎖隱性遺傳

XR女方攜帶1/2

后代正常；剩余1/2：男性患病、女性攜帶男方患者男性均正常；女性均攜帶女方患者男性均患病；女性均攜帶※

告知有新發(fā)突變的可能主要是男孩發(fā)病，病變呈進行性加重1

歲以后開始逐漸出現(xiàn)站立和行走困難患兒動作笨拙，由坐、臥位起立困難。行走時呈鴨步，患兒從仰臥位起立時困難患兒雙側腓腸肌逐漸呈假性肥大，腱反射減弱或消失。常到

10

歲時已不能行走，大多數(shù)患兒在

20

歲前死亡。先證者：路XX，男，5歲，進行性肌營養(yǎng)不良2013年1月，MLPA檢測到先證者DMD基因46-50外顯子缺失2014年6月，MLPA檢測到其母親王XX

DMD基因46-50外顯子雜合突變2014年8月，來我中心就診，希望通過第三代試管嬰兒助孕進行性肌營養(yǎng)不良（DMD），是一類非常常見的單基因遺傳疾病，屬于X連鎖隱性遺傳，男嬰患病率約1/3500DMD基因定位于Xp21.2，人類最大的基因之一（2.2Mb）79個外顯子，編碼區(qū)長度11058bp，已報道致病突變2754個突變涉及到整個外顯子的缺失（60-70%）或重復（10%）外顯子內部單個或者幾個堿基的突變（20-30%）DMD遺傳學基礎知識：新發(fā)攜帶?路XX王XX構建家系圖譜：子代風險評估：DMD是X連鎖隱性遺傳病母親為DMD攜帶者子代1/2正常；剩余1/2：男性患病、女性攜帶進周期前遺傳咨詢：進周期前遺傳咨詢：第一周期：5枚

D5胚胎活檢，行單基因病與染色體非整倍性的檢測（PGD+PGS）結果：2枚女性攜帶，3枚異常胚胎編號性別PGSSTR檢測PCR檢測結果2﹟女異?！荒芤浦?﹟男未見異常攜帶DMD缺失X染色體致病型不能移植7﹟女未見異常攜帶DMD缺失X染色體攜帶型患者選擇放棄8﹟女未見異常攜帶DMD缺失X染色體攜帶型患者選擇放棄9﹟男未見異常攜帶DMD缺失X染色體致病型不能移植胚胎遺傳學檢測：第二周期：8枚

D5胚胎活檢，行單基因病與染色體非整倍性的檢測（PGD+PGS）結果：1枚正常男性胚胎，4枚女性攜帶胚胎，3枚異常胚胎胚胎遺傳學檢測：胚胎編號性別PGSSTR檢測PCR檢測結果2-4女未見異常攜帶DMD缺失X染色體攜帶型患者選擇放棄2-8女未見異常攜帶DMD缺失X染色體攜帶型患者選擇放棄1-8男未見異常無DMD缺失X染色體正常移植1-5男異?！荒芤浦?-3男未見異常攜帶DMD缺失X染色體致病型不能移植2-2男異?！荒芤浦?-6女未見異常攜帶DMD缺失X染色體攜帶型患者選擇放棄1-3女未見異常攜帶DMD缺失X染色體攜帶型患者選擇放棄妊娠結局：第二周期移植1枚正常男性胚胎，移植后未獲得臨床妊娠第三周期：4枚胚胎待做……遺傳咨詢：解釋移植后未獲得臨床妊娠的可能原因充分告知DMD攜帶胚胎移植后，如果獲得臨床妊娠，可生育表型正常的女孩女方年齡≥35歲、復發(fā)性流產反復胚胎植入失敗、不良孕產史嚴重男性不育癥AMA：高齡RM：復發(fā)性流產RIF：反復種植失敗 SMF：嚴重男性因素HumanReproductionUpdate,Vol.18,No.3

pp.234-247,2012Part

3FragouliE.2011,AneuploidyintheHuman

Blastocyst.CytogeneticandGenome

Research占總病例數(shù)比例文獻對照aCGH絨毛染色體異常42.56%（157/390）55.12%（350/635）NGS絨毛染色體異常52.5%(159/303)截止2015.12適應癥強度患者受益PGS結局風險性預測胚胎嵌合與自我修