論文研究-鹽酸氨溴索對百草枯中毒大鼠肺SPD表達(dá)及肺損傷的保護(hù)作用

鹽酸氨溴索對百草枯中毒大鼠肺SPD表達(dá)及肺損傷的保護(hù)作用【摘要】目的觀察鹽酸氨溴索對百草枯中毒致急性肺損傷大鼠肺表面活性物質(zhì)蛋白-D（alveolarsurfaceactivesubstance-D，SP-D）及各相關(guān)指標(biāo)的影響，并評價(jià)鹽酸氨溴索對百草枯中毒治療作用。方法將120只雄性大鼠，隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為3組：生理鹽水組（NS組），百草枯中毒組（PQ組），鹽酸氨溴索治療組（AT組）；再分別將每組按時(shí)間點(diǎn)（第1、3、5、7天）隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為4組。各組以Westernblot法檢測肺組織SP-D蛋白含量，以HE染色觀察大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化，并同時(shí)檢測各組大鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)（whitebloodcount，WBC）和中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear，PMN）百分比及動(dòng)脈血氧分壓（arterialoxygenpressure，PaO2）。結(jié)果AT組第3、5、7天WBC計(jì)數(shù)均低于PQ組，高于NS組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；AT組與PQ組相比PMN百分比，第3、5、7天下降，但高于NS組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；AT組PaO2各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均低于NS組（P<0.01），第3、5、7天AT組PaO2高于PQ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；HE染色結(jié)果顯示三組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化具有明顯不同；AT組肺組織SP-D含量第5、7天高于PQ組，而低于NS組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，差異具·有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論鹽酸氨溴索具有抗炎作用及促進(jìn)肺泡Ⅱ型細(xì)胞表面相關(guān)活性物質(zhì)SP-D蛋白合成與分泌，對百草枯中毒所致急性肺損傷有一定治療效果?！娟P(guān)鍵詞】百草枯；急性肺損傷；肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白-D；鹽酸氨溴索

百草枯（paraquat，PQ）為中等毒性速效季胺鹽類除草劑，在我國農(nóng)村廣泛使用，但其對人體毒性極大，且無特效解毒藥，病死率高達(dá)60.0%～81.6%[1-2]。百草枯可經(jīng)皮膚、呼吸道、消化道吸收，口服后吸收快，吸收后通過血液循環(huán)幾乎分布于所有的組織器官，但主要蓄積在肺，導(dǎo)致急性肺損傷，晚期可發(fā)生肺泡內(nèi)和肺間質(zhì)纖維化，會(huì)導(dǎo)致難以治療的呼吸衰竭，繼而發(fā)生多器官功能障礙綜合征及多器官衰竭而致患者死亡。因此，在百草枯中毒的早期是否能有效的治療和逆轉(zhuǎn)急性肺損傷（Acutelunginjury，ALI），是搶救的關(guān)鍵。鹽酸氨溴索（ambroxolhydrochloride）是溴乙新的代謝產(chǎn)物，因具有祛痰并抑制支氣管炎癥作用3而成為一種新型治療呼吸系統(tǒng)疾病的新型藥物。本課題組研究發(fā)現(xiàn)給予百草枯中毒所致急性肺損傷大鼠大劑量鹽酸氨溴索后，大鼠肺損傷減輕，這可能與鹽酸氨溴索促進(jìn)SP-A分泌有關(guān)4。研究發(fā)現(xiàn)肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白-D（alveolarsurfaceactivesubstance-D，SP-D）在急性肺損傷中起著極為重要作用。因此，筆者擬通過腹腔注射百草枯，建立急性肺損傷大鼠模型，進(jìn)而觀察鹽酸氨溴索對百草枯中毒致急性肺損傷SP-D的影響，并評價(jià)鹽酸氨溴索對百草枯中毒治療作用，為今后臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑與藥品

20%百草枯，先正達(dá)生物科技（中國）有限公司；鹽酸氨溴索注射液，德國勃林格殷格翰公司；Ghrelin一抗（山羊來源多抗）SantaCruz，美國；二抗（兔抗山羊），北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，中國。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

清潔級健康成年雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量200～250g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證明書編號為：1203095。將SD大鼠飼養(yǎng)于SPF級實(shí)驗(yàn)室，一周后將120只SD大鼠隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組：（1）生理鹽水組（NS組，n=24），每日腹腔注射6ml/kg0.9%生理鹽水；（2）百草枯中毒組（PQ組，n=48），以30mg/kg腹腔注射0.5%百草枯稀釋液（抽取20%百草枯1ml，用0.9%生理鹽水稀釋為40ml，即為0.5%百草枯稀釋液，每毫升稀釋液含百草枯5mg），建立大鼠百草枯中毒模型；（3）鹽酸氨溴索治療組（AT組，n=48），百草枯注射后每日腹腔注射含鹽酸氨溴索（35mg/kg）等容量生理鹽水。三組再分別按時(shí)間點(diǎn)（第1、3、5、7天）隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為4個(gè)小組，PQ組、AT組每小組均為12只，NS組每小組為6只。

1.3血液標(biāo)本的采集

以3%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后，將其置于手術(shù)臺上（仰臥位），并固定。用碘伏消毒腹部皮膚，沿腹部正中線剪開腹壁，暴露腹腔，分離股動(dòng)、靜脈。無菌注射器抽取股靜脈血2ml，注入抗凝血采血管1ml并充分搖勻，同時(shí)以毛細(xì)采血管采血20μl，以檢測白細(xì)胞計(jì)數(shù)（whitebloodcount，WBC）和中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear，PMN）百分比。無菌血?dú)忉槼槿」蓜?dòng)脈血1ml，并迅速將針尖插入橡皮塞內(nèi)達(dá)密封狀態(tài)，充分搖勻后測定動(dòng)脈血氧分壓（arterialoxygenpressure，PaO2）。

1.4肺組織標(biāo)本采集

血液標(biāo)本采集的同時(shí)，取出左、右肺組織，并用4℃生理鹽水沖洗，左肺置于4%多聚甲醛固定液中固定24h后，制備石蠟切片，行HE染色觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。右肺置于-80℃冰箱冰凍保存，通過Westernblot方法檢測肺組織中SP-D蛋白含量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組均數(shù)行正態(tài)性檢驗(yàn)后采用單因素方差分析法（ANOVA）以LSD法做均數(shù)間兩兩比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1靜脈血液中WBC的變化

NS組靜脈血液白細(xì)胞計(jì)數(shù)各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。第1天PQ組、AT組WBC計(jì)數(shù)均于中毒后升高，第5天時(shí)PQ組達(dá)最高值，各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于NS組（P<0.01）；AT組于第3天達(dá)最高值，第7天開始明顯下降，但各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)仍顯著高于NS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），第1天AT組與PQ組異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），第3、5、7天WBC計(jì)數(shù)均低于PQ組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1）。

2.2靜脈血液中PMN百分比的變化

NS組PMN百分比各個(gè)時(shí)間點(diǎn)異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PQ組PMN百分比于第1天快速升高，第3天即達(dá)高峰，與NS組相比各個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均明顯增高（P<0.01）。AT組第1天PMN百分比增高，于PQ組無明顯差異（P>0.05），第3天達(dá)到最高值，第3、5、7天PMN百分比較PQ組明顯下降（P<0.01），但仍明顯高于NS組各時(shí)間點(diǎn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1）。

2.3動(dòng)脈血液中PaO2的變化

NS組動(dòng)脈血液中PaO2各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。PQ組動(dòng)脈血液中PaO2于第1天開始逐漸下降，于第7天下降至最低值，各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均明顯低于NS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。AT組PaO2各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均低于NS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。AT組與PQ組相比：第1天兩者異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），第3、5、7天AT組PaO2開始增高，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1）。

2.4大鼠肺組織HE染色光鏡觀察

NS組可見肺泡結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，分布均勻，肺泡腔內(nèi)無炎性細(xì)胞侵潤。PQ組第1、3天可見肺泡和肺間質(zhì)輕度充血水腫，肺泡間隔增厚并有中性粒細(xì)胞侵潤。第5、7天可見肺泡和肺間質(zhì)充血水腫明顯，部分肺泡萎陷，纖維母細(xì)胞增生。AT組與PQ相比，肺泡和肺間質(zhì)充血水腫等表現(xiàn)均有所減輕。見圖1。

2.5Westernblot法檢測SP-D在肺組織中的表達(dá)

NS組大鼠肺組織SP-D含量在各時(shí)間點(diǎn)均無明顯變化。PQ組肺組織SP-D含量持續(xù)下降，與NS組相比，各時(shí)間點(diǎn)SP-D含量均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。AT組大鼠肺組織SP-D含量第1、3天下降，較PQ組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），經(jīng)鹽酸氨溴索治療后，第5、7天肺組織SP-D含量增高，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。AT組較NS組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表2）。

3討論

百草枯中毒后可以引起肺組織缺氧、肺泡和肺間質(zhì)水腫及肺間質(zhì)纖維化，使PaO2的降低，并導(dǎo)致嚴(yán)重低氧血癥5，這一系列的病理生理過程稱為ALI6。鹽酸氨溴索是臨床上較為廣泛使用治療呼吸道疾病的藥物，主要適用于痰液分泌不正常及排痰功能不良的急、慢性肺部疾病患者，能抑制機(jī)體炎癥因子和炎癥介質(zhì)合成及釋放，控制中性粒細(xì)胞的反應(yīng)，使肺泡Ⅱ型細(xì)胞表面相關(guān)活性物質(zhì)合成、分泌增加，強(qiáng)化肺的主動(dòng)防御功能7。肺表面活性物質(zhì)指由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌的一種復(fù)雜的脂蛋白，其主要成分為二棕櫚酰卵磷脂和表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白（SP），分布于肺泡液體分子層表面，具有降低肺泡表面張力、維持大小肺泡容量的相對穩(wěn)定、阻止肺泡水腫等作用。SP包括親水性SP-A、SP-D和疏水性SP-B、SP-C，SP-D有先天主動(dòng)防御、抗菌、抗氧化功能8。經(jīng)鹽酸氨溴索處理的急性肺損傷大鼠SP-D在肺組織表達(dá)明顯增強(qiáng)9。在ALI患者中肺組織及肺泡灌洗液的SP-D含量減少，血漿SP-D水平升高，肺組織及肺泡灌洗液的SP-D含量越低；而血漿SP-D水平越高，肺損傷越重，患者預(yù)后愈欠佳。SP-D在ALI的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用，并可能是氨溴索保護(hù)肺組織的重要機(jī)制。

在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)鹽酸氨溴索可抑制百草枯中毒所致的WBC及PMN的升高，也明顯減輕了大鼠肺間質(zhì)中中性粒細(xì)胞浸潤，AT組與PQ組相比肺泡水腫、滲出明顯減輕，PaO2顯著升高，這證實(shí)氨溴索對百草枯中毒引起的炎癥反應(yīng)具有一定的抗炎作用，并減輕了ALI，保護(hù)了肺功能；此外，經(jīng)Western-blot方法檢測，AT組的SP-D含量較PQ組顯著升高，進(jìn)一步提示鹽酸氨溴索可通過促進(jìn)SP-D的合成與分泌來減輕百草枯所致的ALI。

此次研究表明氨溴索對百草枯中毒大鼠有著良好的治療作用，可以減輕全身及肺組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)，并通過促進(jìn)肺泡表面活性物質(zhì)的合成與分泌進(jìn)一步減輕ALI，保護(hù)肺功能，這與之前的張?jiān)吕虻?0的相關(guān)報(bào)道相一致。氨溴索在搶救百草枯中毒中的作用值得在臨床治療中進(jìn)一步研究和探討。Pfeifer等11研究表明鹽酸氨溴索在機(jī)體內(nèi)達(dá)到一定濃度后，就具有很強(qiáng)抗感染能力，但作用機(jī)制還不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

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