脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)及其作用機(jī)制探討

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)及其作用機(jī)制探討大面積深度燒傷以及慢性難愈性創(chuàng)面修復(fù)一直是臨床治療的難點。隨著干細(xì)胞研究的開展和深入，體內(nèi)外實驗證明位于皮下脂肪組織內(nèi)的脂肪干細(xì)胞[1]（adipose-derivedstemcells,ADSCs）可以有效促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合。皮膚創(chuàng)面愈合[2]是一個復(fù)雜的多因素過程，涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、再上皮化、血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)沉積以及重塑等多方面。在創(chuàng)傷條件下，傷口滲液和其中的炎性因子以及有絲分裂原等趨化因子促進(jìn)ADSCs增殖，向傷口遷移[3]。實驗證明，ADSCs在體、內(nèi)外均可以向皮膚表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分化，分泌多種生物活性分子限制炎癥和凋亡、促進(jìn)血管形成、促進(jìn)創(chuàng)周組織細(xì)胞，參與損傷修復(fù)等，最終實現(xiàn)促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。1脂肪干細(xì)胞的生物學(xué)特性以及低免疫原性ADSCs是成體間充質(zhì)干細(xì)胞的一種，廣泛分布于不同物種，如人、鼠、豬、犬及兔等不同部位的脂肪組織中。其數(shù)量巨大，1g脂肪組織可以產(chǎn)生大約5×103脂肪干細(xì)胞，大約是1g骨髓中獲取干細(xì)胞數(shù)量的500倍；取材安全簡便，在局麻下即可獲取大量細(xì)胞，體外擴(kuò)增和自我更新能力很強(qiáng)；可以向多種細(xì)胞系分化：脂肪、骨、軟骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、內(nèi)皮、肝細(xì)胞、造血細(xì)胞以及神經(jīng)元細(xì)胞[4-5]，ADSCs是真正意義上的具有多向分化潛能的干細(xì)胞。ADSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞這一類細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記[6]，表達(dá)大量的粘附分子：ADSCs持續(xù)性表達(dá)CD9、整合素β1(CD29)和α4(CD49d)、細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1，即CD54)、CD105、血管細(xì)胞粘附分子(VCAM，即CD106)和活化淋巴細(xì)胞粘附分子(ALCAM，即CD166)，表達(dá)Ⅰ類組織相容性蛋白HLA-ABC。ADSCs不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志CD14、CD34或CD45，不表達(dá)Ⅱ類組織相容性抗原HLA-DR及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31，不表達(dá)共刺激因子B7-1（CD80）、B7-2（CD86）和CD40。ADSCs表面標(biāo)記物會隨著培養(yǎng)時間的延長而有所改變。早期原代培養(yǎng)的ADSCs(也稱為stromalvascularfraction,SVF)中存在造血干細(xì)胞以及內(nèi)皮祖細(xì)胞的標(biāo)志分子，如：CD11a、CD14、CD45、CD86、HLA-DR。自第2代以后，ADSCs均勻一致地表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特有標(biāo)記：CD13、CD29、CD44、CD73、CD90，這可能與原代培養(yǎng)的ADSCs含有多種細(xì)胞成分有關(guān)[7-8]。人ADSCs不表達(dá)MHC2Ⅱ類分子和B7-1（CD80）、B7-2（CD86）和CD40等共刺激分子，這些分子是效應(yīng)性T細(xì)胞激活所必需的，共刺激分子的缺乏，使得T細(xì)胞活化的第二信號喪失，導(dǎo)致Th細(xì)胞的無反應(yīng)性而促成免疫耐受，表現(xiàn)出低免疫原性。2ADSCs向表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞分化，促進(jìn)創(chuàng)面皮膚再上皮化脂肪干細(xì)胞具有定向分化為組織修復(fù)所需要的終末分化細(xì)胞的能力，為組織修復(fù)以及構(gòu)建組織工程皮膚提供充足的細(xì)胞來源。在體外將ADSCs定向誘導(dǎo)分化為表皮細(xì)胞的方法較多。雷永紅等[9]采用皮膚勻漿液處理ADSCs，單獨培養(yǎng)或與熱休克損傷的HEKa細(xì)胞共培養(yǎng)，誘導(dǎo)rADSCs向表皮細(xì)胞定向分化表達(dá)CK10、CK14、CK19，其誘導(dǎo)分化效率高于單純使用表皮生長因子EGF。王先成等[10]利用EGF以及維甲酸等成分誘導(dǎo)ADSCs分化，10天后細(xì)胞出現(xiàn)鋪路石改變，細(xì)胞表達(dá)CK19。這與Brzoska等[11]的實驗相一致，ADSCs在全反式維甲酸誘導(dǎo)作用下向上皮細(xì)胞分化，表達(dá)上皮細(xì)胞早期的表面標(biāo)記-角蛋白CK18，不再表達(dá)波形蛋白（vimentin）等間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志。Ebrahimian[12]則是將ADSCs在角質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，發(fā)現(xiàn)ADSCs向角質(zhì)形成細(xì)胞分化，表達(dá)K5和K14。干細(xì)胞在局部微環(huán)境的影響下定向誘導(dǎo)分化為創(chuàng)傷部位的靶細(xì)胞，該現(xiàn)象稱為局部專一分化（site-specificdifferentiation）[13]。在體實驗[14-15]以真皮基質(zhì)或者蠶絲蛋白-殼聚糖支架（SFCS）作為載體，將GFP標(biāo)記人ADSCs與之形成的復(fù)合物移植到裸鼠背部，移植后2周發(fā)現(xiàn)GFP-ADSCs分化為成纖維細(xì)胞，表達(dá)熱休克蛋白HSP47；移植后4周GFP-ADSCs分化成表皮細(xì)胞，表達(dá)CK19。Nie等[16-18]利用脫細(xì)胞真皮支架作為載體或者采用創(chuàng)周皮內(nèi)注射的方式將ADSCs應(yīng)用于創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)ADSCs分化為表皮細(xì)胞，表達(dá)pan角蛋白、CK5和CK14。3向血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分化，分泌促進(jìn)血管生成因子Cao等[18]利用體外實驗，將ADSCs在體外與VEGF共培養(yǎng)時可以表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞ECs標(biāo)志。雷永紅[19]應(yīng)用30%大鼠血管勻漿液誘導(dǎo)大鼠ADSCs3天，細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，表達(dá)CD34和血管性假血友病因子vWF。楊平等[20]應(yīng)用TGF-β1、PDGF-BB體外誘導(dǎo)ADSCs，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的血管平滑肌細(xì)胞VSMCs特性，表達(dá)血管平滑肌蛋白α-SMA、SM-MHC以及Calponin。體內(nèi)實驗將ADSCs直接或者以支架為載體應(yīng)用到皮膚創(chuàng)面后，發(fā)現(xiàn)GFP-ADSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，表達(dá)SMA、vWF[14-15]或者CD31[16-17]。分泌血管原性生成因子如VEGF、HGF、FGF2、TGFβ3，促進(jìn)肉芽組織生長和新生血管形成，增加血管密度，增加隨意皮瓣的血流供應(yīng)[21]，提高全厚皮膚移植的成活率[22]，促進(jìn)生理性和病理性創(chuàng)面愈合。4旁分泌作用，增強(qiáng)組織修復(fù)單獨使用ADSC分泌的細(xì)胞因子即條件培養(yǎng)液ADSC-CM有助于調(diào)節(jié)局部細(xì)胞對創(chuàng)傷的反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。皮膚損傷波及到脂肪組織時，會釋放FGF-2，激活JNK通路，促進(jìn)ADSCs增殖和分泌，促進(jìn)血管形成以及促進(jìn)細(xì)胞分裂，促進(jìn)組織再生，減輕組織纖維化[23]。ADSCs[24-25]可以分泌大量促進(jìn)血管生成和抗凋亡的細(xì)胞因子：VEGF，粒系/巨噬細(xì)胞系集落刺激因子M-CSF，基質(zhì)來源因子SDF-1α，HGF，IGF-1，KGF以及FGF-2。ADSCs分泌產(chǎn)生KGF不受輻射的影響[12]。外源性的細(xì)胞因子對ADSCs的分泌功能具有一定的促進(jìn)作用。TNF-α促進(jìn)ADSCs分泌的IL-6和IL-8，在體內(nèi)皮膚傷口模型加速傷口愈合、血管形成、增殖、免疫細(xì)胞浸潤中起主要作用[26]。胰島素[27-28]后的ADSCs-CM含有更高水平的VEGF和HGF，有效促進(jìn)人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移并抑制其凋亡，有利于組織血管化。動物創(chuàng)傷模型顯示，ADSCs-CM中的TGF-β1[29]通過增加透明質(zhì)酸酶HAS-1以及HAS-2表達(dá)，促進(jìn)透明質(zhì)酸合成；ADSCs-CM還可以上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原、纖連蛋白的mRNA水平，下調(diào)MMP-9的mRNA水平，增強(qiáng)HDF分泌Ⅰ型膠原，刺激膠原合成和成纖維細(xì)胞遷移，在體內(nèi)促進(jìn)傷口愈合。局部注射ADSCs到糖尿病缺血模型創(chuàng)面[30]，提高血漿和組織中VEGF的含量，明顯縮小創(chuàng)面面積，局部新生血管增加，加快愈合速度，改善創(chuàng)面愈合后質(zhì)量。Valerie等[31]利用ADSCs、自體角質(zhì)形成細(xì)胞以及自體成纖維細(xì)胞或者新生兒包皮成纖維細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚，呈現(xiàn)表皮、真皮以及皮下組織三層結(jié)構(gòu)，不需要任何合成的或者外源的支架材料，且這種三層結(jié)構(gòu)的皮膚替代物可以分泌TGF-β、VEGF、KGF和bFGF，具有創(chuàng)傷修復(fù)更強(qiáng)的潛力。5促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移作用ADSCs可以通過細(xì)胞接觸或者旁分泌作用促進(jìn)臨近組織細(xì)胞的增殖和遷移，有效提高創(chuàng)面的愈合速度。Kim等[32]發(fā)現(xiàn)ADSCs通過共培養(yǎng)、transwell培養(yǎng)方式均可以促進(jìn)人真皮成纖維細(xì)胞（HDF）增殖以及遷移；ADSCs經(jīng)TGF-β1[33]處理后對皮膚成纖維細(xì)胞的遷移作用增強(qiáng)；胰島素[28]則具有促進(jìn)ADSCs對血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移作用，增加新生血管形成；鼠源ADSCs與細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)后促進(jìn)人表皮角質(zhì)細(xì)胞（HEKa）分裂增殖和遷移[34]。6低氧增強(qiáng)ADSCs的創(chuàng)面修復(fù)作用在影響ADSCs功能的眾多因素中，周圍環(huán)境中的氧氣濃度特別是低氧環(huán)境發(fā)揮了重要作用。缺氧[35]通過活化ADSCs細(xì)胞膜的受體酪氨酸激酶，接著磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）以及Akt信號通路成員，缺氧誘導(dǎo)因子1a（HIF-1a）明顯增加，ADSCs分泌更多抗凋亡和促進(jìn)血管生成的生物活性物質(zhì)：胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（IGFBP-1）、IGFBP-2、M-CSF、M-CSFR、血小板來源生長因子PDGFR-beta、VEGF、bFGF、HGF、IGF、瘦素leptin、血管生成素-2、Bcl2、BclxL，促進(jìn)細(xì)胞生長，減少細(xì)胞凋亡。其中VEGF的轉(zhuǎn)錄是誘發(fā)血管生成級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。在20%、5%、1%氧濃度下，ADSCs分泌的VEGF的表達(dá)進(jìn)行性增高。ADSCs具有向SDF-1遷移的能力，低氧可以上調(diào)ADSCs表面的SDF-1受體趨化因子受體CXCR4的表達(dá)，促進(jìn)ADSCs的遷移；低氧還促進(jìn)ADSCs的增殖，發(fā)揮再生潛力[36]。在低氧環(huán)境下培養(yǎng)的ADSC條件培養(yǎng)液hypoCM與正常氧濃度下的norCM相比較，VEGF和bFGF的mRNA和蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)膠原合成和真皮成纖維細(xì)胞遷移，加速創(chuàng)面愈合[37-38]。低氧環(huán)境下的ADSC-CM促進(jìn)毛囊毛乳頭細(xì)胞以及表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)毛發(fā)進(jìn)入生長期，促進(jìn)毛發(fā)再生[39]。7安全、無致瘤性ADSCs[40-41]在實驗室中經(jīng)過長期傳代或凍存仍然保持干細(xì)胞特征，增殖分化能力無改變，仍可以保留其免疫原性，無明顯的免疫學(xué)特性改變和分化傾向。陳光平等[42]研究證實ADSCs在體外進(jìn)行增殖分化過程中，其端粒酶活性以及染色體核型未發(fā)生異常變化。ADSCs應(yīng)用于皮膚傷口，局限于損傷局部，沒有向全身擴(kuò)散，不會影響機(jī)體遠(yuǎn)位腫瘤的擴(kuò)大和惡化[43]。向免疫缺陷小鼠靜脈內(nèi)注射2.5×108細(xì)胞/kg體重，小鼠存活且無副作用。向Balb/c-nu裸鼠靜脈內(nèi)注射2.0×108細(xì)胞/kg體重，觀察26周無腫瘤發(fā)生。在人體臨床試驗，向8名脊髓損傷超過12個月的男性患者單次注射4.0×108細(xì)胞，隨訪3個月無嚴(yán)重副作用發(fā)生。全身應(yīng)用ADSCs顯然是安全的，不會誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[44]。綜上所述，ADSCs具有多向分化潛能，促進(jìn)新生血管形成，加速創(chuàng)面愈合。相對于骨髓干細(xì)胞，ADSCs來源于低氧環(huán)境，有助于耐受細(xì)胞移植后短暫的營養(yǎng)匱乏期[45]。治療所用的ADSCs來自患者自身的脂肪，因此，有望在不引起任何免疫排斥的情況下修復(fù)受損組織。ADSCs來源充足，易于分離，安全無致瘤性，是用于自體干細(xì)胞移植治療的最佳細(xì)胞來源。8問題與展望既往ADSCs促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合的相關(guān)實驗研究均采用的是同種異體或者異種ADSCs經(jīng)過體外誘導(dǎo)或者純化后,直接應(yīng)用或者以各種支架為載體移植到創(chuàng)面，來觀察ADSCs的治療作用；創(chuàng)面模型均采用的是皮膚切除模型。目前,尚無將ADSCs應(yīng)用到燒傷創(chuàng)面的相關(guān)實驗報道,但是燒傷創(chuàng)面有別于皮膚切除，有著其獨特的病理過程，燒傷創(chuàng)面的微環(huán)境與ADSCs的相互影響規(guī)律是什么？干細(xì)胞用于燒傷創(chuàng)面治療的時機(jī)？轉(zhuǎn)歸如何？燒傷后，位于燒傷創(chuàng)面基底的脂肪組織中的大量的ADSCs，是否被啟動參與到燒傷創(chuàng)面的修復(fù)中？相信隨著ADSCs的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究的不斷深入，ADSCs必將成為皮膚創(chuàng)傷特別是燒傷創(chuàng)面修復(fù)的最佳細(xì)胞來源。[參考文獻(xiàn)][1]ZukPA,ZhuM,AshjianP,etal.Humanadiposetissueisasourceofmultipotentstemcells[J].MolBiolCell,2002,13(12):4279-4295.[2]GurtnerGC,WernerS,BarrandonY,etal.Woundrepairandregeneration[J].Nature,2008,453:314-21.[3]ScherzedA,HackenbergS,FroelichK,etal.Theeffectofwoundfluidonadipose-derivedstemcellsinvitro:astudyinhumancellmaterials[J].TissueEngPartCMethods,2011,17(8):809-817.[4]GimbleJM,KatzAJ,BunnelBA.Adipose-derivedstemcellsforregenerativemedicine[J].CircRes,2007,100(9):1249-1260.[5]FraserJK,WulurI,AlfonsoZ,etal.Fattissue:anunderappreciatedsourceofstemcellsforbiotechnology[J].TrendsBiotechnol,2006,24:150-154.[6]GronthosS,FranklinDM,LeddyHA,etal.Surfaceproteincharacterizationofhumanadiposetissue-derivedstromalcells[J].JCellPhysiol,2001,189(1):54-63.[7]McIntoshK,ZvonicS,GarrettS,etal.TheImmunogenicityofHumanAdiposeDerivedCells:TemporalChangesInVitro[J].StemCells,2006,24:1246-1253.[8]MitchellJB,McintoshK,ZvonicS,etal.ImmunogenicityofHumanAdipose-DerivedCells:TemporalChangesInStromal-AssociatedandStemCell-AssociatedMarkers[J].StemCells,2006,24:376-385.[9]雷永紅,付小兵,盛志勇,等.誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向表皮細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)分化研究[J].中華整形外科雜志,2007,3(23):151-153.[10]王先成,喬群,管利東,等.人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特征及向體外類角質(zhì)細(xì)胞的分化[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2007,11(37):7333-7336.[11]BrzoskaM,GeigerH,GauerS,etal.Epithelialdifferentiationofhumanadiposetissue-derivedadultstemcells[J].BiochemBiophysResCommun,2005,330:142-150.[12]EbrahimianTG,PouzouletF,SquibanC,etal.Celltherapybasedonadiposetissue-derivedstromalcellspromotesphysiologicalandpathologicalwoundhealing[J].ArteriosclerThrombVascBiol,2009,29(4):503-510.[13]LiechtyKW,MackenzieTC,ShaabanAF,etal.Humanmesenchymalstemcellsengraftanddemonstratesite-specificdifferentiationafterinuterotransplantationinsheep[J].NatMed,2000,6:1282-1286.[14]AltmanAM,MatthiasN,YanY,etal.Dermalmatrixasacarrierforinvivodeliveryofhumanadipose-derivedstemcells[J].Biomaterials,2008,29(10):1431-1442.[15]AltmanAM,YanY,MatthiasN,etal.IFATScollection:Humanadipose-derivedstemcellsseededonasilkfibroin-chitosanscaffoldenhancewoundrepairinamurinesofttissueinjurymodel[J].StemCells,2009,27(1):250-258.[16]NieC,YangD,MorrisSF.Localdeliveryofadipose-derivedstemcellsviaacellulardermalmatrixasascaffold:anewpromisingstrategytoacceleratewoundhealing[J].MedHypotheses,2009,72(6):679-682.[17]NieC,YangD,XuJ,etal.Locallyadministeredadipose-derivedstemcellsacceleratewoundhealingthroughdifferentiationandvasculogenesis[J].CellTransplant,2011,20(2):205-216.[18]CaoY,SunZ,LiaoLM,etal.Humanadiposetissue-derivedstemcellsdifferentiateintoendothelialcellsinvitroandimprovepostnatalneovascularizationinvivo[J].BiochemBiophysResCommun,2005,332:370-379.[19]雷永紅，付小兵,盛志勇,等.誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的實驗研究[J].中華外科雜志,2010,48(14):1106-1110.[20]楊平,尹爍,崔磊,等.脂肪干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)的實驗研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志,2008,22(4):481-486.[21]LuF,MizunoH,UysalCA,etal.Improvedviabilityofrandompatternskinflapsthroughtheuseofadipose-derivedstemcells[J].PlastReconstrSurg,2008,121(1):50-58.[22]ZoqrafouA,TsiqrisC,PapadopoulosO,etal.Improvementofskin-graftsurvivalafterautologoustransplantationofadipose-derivedstemcellsinrats[J].JPlastReconstrAesthetSurg,2011,64(12):1647-1656.[23]SaqaH,EtoH,ShiqeuraT,etal.IFATSCollection:Fibroblastgrowthfactor-2-inducedhepatocytegrowthfactorsecretionbyadipose-derivedstromalcellsinhib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