比色法和分光光度法cha

比色法和分光光度法cha本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請自行刪除，謝謝！20.1概述20.1.1分（吸）光光度法及其特點比色法：利用有色溶液顏色的深度測定該溶液的濃度。目視比色法：用肉眼直接比較樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液的顏色深淺。分光光度法：用光電比色計或分光光度計測量溶液吸光度。分光光度法的特點：靈敏度高。10-3

－10-6mol/L。準(zhǔn)確度高。相對誤差2－5％。儀器設(shè)備簡單、操作簡便。應(yīng)用范圍廣。20.1.2吸收光譜光譜區(qū)的劃分微波遠紅外近紅外可見光近紫外真空紫外X-射線

-射線波長1000um10um100nm10nm紅620－750nm橙590－620nm黃570－590nm綠550－570nm青495－550nm藍450－495nm紫380－450nm190－400nm2.可見光吸收光譜光的互補色示意圖白光紅橙黃綠青青藍藍紫單色光：單一波長光復(fù)合光：復(fù)合波長光互補光：處于同一直線上的兩種光?；パa光按一定強度比例混合，即得白光。溶液顏色：互補光的顏色。吸光度：某波長的光通過含有紫外-可見光吸收的物質(zhì)溶液后，被吸收的光的比例。吸收光譜曲線：溶液對不同波長光的吸收強度，即以入射光波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)所做的一條曲線。最大吸收波長：物質(zhì)對該波長的光吸收最大，即吸收光譜曲線上的最大峰值。3.吸收光譜曲線透過率：某波長的光通過含有紫外-可見光吸收的物質(zhì)溶液后，沒有被吸收的光（即透過的光）的比例。四種川芎內(nèi)酯化合物的紫外吸收光譜圖1-洋川芎內(nèi)酯H；2-洋川芎內(nèi)酯I；3-瑟丹酸內(nèi)酯；4-藁本內(nèi)酯

物質(zhì)分子的運動狀態(tài)分子軌道中價電子的高速旋轉(zhuǎn)；原子在平衡位置的振動；分子自身的轉(zhuǎn)動。分子的能量價電子能級的能量＋振動能級的能量＋轉(zhuǎn)動能級的能量能級差與對應(yīng)的光譜價電子能級間能量差1-20eV，紫外-可見光的能量；振動能級間能量差0.05-1eV，紅外光的能量；轉(zhuǎn)動能級間能量差10-4-0.05eV，遠紅外光及微波的能量。4.物質(zhì)吸收光的本質(zhì)

吸收光譜與發(fā)射光譜分子吸收能量后受到激發(fā)，分子就從基態(tài)能級躍遷到激發(fā)態(tài)能級，因而產(chǎn)生吸收光譜。處于激發(fā)態(tài)的分子返回基態(tài)或能級較低的激發(fā)態(tài)，就會以光子的形式釋放能量，從而產(chǎn)生發(fā)射光譜。

紫外-可見吸收光譜分子中的價電子吸收特定波長的光（紫外-可見光）后，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。20.2光吸收定律朗伯（Lambert）定律：一束單色光通過吸光物質(zhì)的溶液后，光吸收程度（吸光度）與溶液液層厚度成正比。A為吸光度;I0為入射光強I為透過光強;T為透光度k’為比例常數(shù)b為液層厚度（光程長度）bI0

I即：

比耳（Beer）定律：一束單色光通過吸光物質(zhì)的溶液后，光的吸收程度與吸光物質(zhì)微粒（分子）的數(shù)目（濃度c）成正比。即：

朗伯-比耳定律：

當(dāng)b單位為cm，c的單位為mol/L時的吸光系數(shù)稱摩爾吸光系數(shù)

，其單位為cm-1

mol-1

L。的大小與吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射波長和溫度有關(guān)。朗伯-比耳定律的適用范圍：不僅適用于溶液，也適用于均勻的氣態(tài)吸光物質(zhì)和固態(tài)吸光物質(zhì)；它是各種吸光光度法定量分析的依據(jù)。思考：摩爾吸光系數(shù)如何測定？工作曲線（標(biāo)準(zhǔn)曲線）：測定信號的大小隨被測物濃度變化的曲線。要求這一曲線為直線，即測定信號與被測物濃度成正比。理想情況下工作曲線過原點；直線的線性范圍是有限的（高濃度端偏離）；通常要求兩個數(shù)量級以上的線性范圍；樣品中被測物濃度應(yīng)在工作曲線的線性范圍內(nèi)。偏離比耳定律：即工作曲線在高濃度端發(fā)生偏離。偏離比耳定律的原因：比爾定律本身的局限性。比爾定律假設(shè)了吸光分子之間無相互作用，事實上，高濃度時分子間相互作用不可忽略。入射光為非單色光時的偏離。儀器的分光元件（單色器）很難得到真正的單色光，而是波長范圍很窄的復(fù)合光帶，而比耳定律僅在入射光為單色光時才是正確的?；瘜W(xué)因素引起的偏離。其一是介質(zhì)不均勻（膠體、乳濁液、懸浮液）而產(chǎn)生折射、散射和反射，使透過光強減弱（A增大）。其二是吸光分子發(fā)生化學(xué)變化而改變濃度。20.3比色法和分光光度法及其儀器1.光度分析方法目視比色法：光電比色法：用光電比色計測定未知溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。光電比色計用濾光片得到較窄波長范圍的入射光；分（吸）光光度法：用分光光度計測定未知溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。分光光度計用棱鏡或光柵做分光元件得到單色入射光。2.分光光度計的基本部件光源單色器吸收池檢測系統(tǒng)結(jié)果顯示光源：在可見和近紅外區(qū)使用鎢燈或碘鎢燈，波長范圍320-2500nm；在紫外區(qū)使用氫燈或氘燈，波長范圍180-375nm。

使用穩(wěn)壓器保證光強穩(wěn)定。單色器：色散元件：將連續(xù)光譜分解為單色光的元件（如棱鏡、光柵）；單色器：由入射狹縫、準(zhǔn)直透鏡、色散元件、聚焦透鏡和出射狹縫構(gòu)成。玻璃吸收紫外光，所以玻璃棱鏡僅用于350-3200nm波長范圍，只能用于可見分光光度計；石英（185-4000nm）則可用于整個紫外-可見光區(qū)。光柵利用光的衍射與干涉作用，其優(yōu)點是適用波長范圍寬、色散均勻、分辨率高；但其缺點是各級光譜有重疊而產(chǎn)生相互干擾。吸收池（比色池、比色皿）：用無色透明、耐腐蝕的光學(xué)玻璃或石英制造。因玻璃吸收紫外光，所以玻璃吸收池只能用于可見光區(qū)。杯差：一對比色池對光吸收的差異，實驗前要先校杯差。檢測系統(tǒng)：光電轉(zhuǎn)換元件（硒光電池、光電二極管）。結(jié)果顯示部分：直接顯示出測定結(jié)果的數(shù)值（吸光度、透過率等）。20.4顯色反應(yīng)與顯色條件的選擇顯色反應(yīng)：將無色或吸光系數(shù)很小的被測物與顯色劑反應(yīng)，使之轉(zhuǎn)變成具有較強UV或Vis吸收的化合物后測定。顯色劑：能與被測物反應(yīng)，并使之顯（顏）色的試劑。無機顯色劑（硫氰酸鹽、鉬酸銨、雙氧水等）與被測物生成的有色物的穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性都不高，應(yīng)用較少。有機顯色劑（磺基水楊酸、二苯硫腙等）大多能與金屬離子形成穩(wěn)定的有色配（螯）合物。生色基團舉例：碳碳三鍵：

max=175nm，躍遷；碳碳雙鍵：

max=190nm，躍遷；苯：max=254，250，204nm，躍遷；羧基：max=204nm，n躍遷；生色基團：分子吸收紫外-可見光與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)；紫外-可見吸收光譜涉及的電子躍遷是：

n（非鍵軌道），n

和。對顯色反應(yīng)的要求：具有較高的靈敏度。摩爾吸光系數(shù)103－105；有較好的選擇性；生成的顯色物（多為螯合物）穩(wěn)定、組成恒定；產(chǎn)物顏色應(yīng)與被測物顏色有較大差異；顯色條件應(yīng)易于控制。萃取光度法：當(dāng)顯色劑與被測物（通常是金屬離子）生成的有色物在有機溶劑中有很好的溶解度時，可以讓水相中生成的有色物萃取到有機相，用有機相進行光度分析。顯色條件的選擇：顯色劑的用量。酸度。酸度可能會影響顯色劑濃度、顯色劑顏色、配合物組成和被測離子存在狀態(tài)。顯色溫度。顯色時間。溶劑種類。很多顯色配合物只在有機溶劑中穩(wěn)定。干擾的避免與消除。20.5分光光度法儀器測量誤差及消除測定波長的選擇：一般情況下選擇顯色配合物的最大吸收波長；為避免干擾，有時也選擇干擾小的非最大吸收波長。比色池的選擇：通常使用1cm比色池；根據(jù)樣品濃度和顯色配合物的靈敏度高低，可以選用其他厚度的比色池。目的是消除池壁、溶劑、反應(yīng)試劑等對入射光的反射和吸收所帶來的系統(tǒng)誤差；只有被測產(chǎn)物有吸收，其他反應(yīng)試劑均無吸收時，可用純?nèi)軇┳鰠⒈龋伙@色劑或其他試劑有顏色時，用試劑空白做參比；如果干擾物質(zhì)也生成類似顯色產(chǎn)物，也可按下法制備一個參比溶液：在顯色之前先將被測物掩蔽起來，只讓干擾物質(zhì)顯色，該空白溶液做參比便可消除干擾。參比溶液的選擇：20.6分光光度法的應(yīng)用1.應(yīng)用范圍既直接用于有色物測定，也通過顯色用于無色物分析；既用于常量分析（>1%），也用于微量分析（0.01-1%）;既用于無機離子分析，也用于有機物分析；既用于定量分析，也可用于定性分析（特征吸收光譜、功能基團特征吸收峰）；可用于其他領(lǐng)域的研究（如化學(xué)平衡）；目前環(huán)境等領(lǐng)域的很多標(biāo)準(zhǔn)分析方法仍然采用光度法。2.單組分測定通常在最大吸收波長下測定吸光度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。3.多組分的測定吸收光譜不重疊時，可在各自的最大吸收波長下分別測定。吸收光譜單向重疊，即組分1干擾組分2，而組分2不干擾組分1的測定，這時只能直接測定組分1含量，要測定組分2含量，必須先用組分1的標(biāo)準(zhǔn)溶液測定出組分1在組分2的測定波長下的摩爾吸光系數(shù)，并用已測定出的組分1的濃度，計算波長2下組分1的吸光度，并從波長2下組分1和2的總吸光度中扣除組分1的吸光度。吸光度雙向重疊。需解聯(lián)立方程。3.差示分光光度法分光光度法測定時，吸光度讀數(shù)通常要求在0.2-0.8范圍內(nèi)，誤差最小是A=0.434。當(dāng)測定濃度比較大的樣品時，由于吸光度讀數(shù)超出準(zhǔn)確讀數(shù)的范圍，會產(chǎn)生很大影響。差示分光光度法：用比樣品濃度略低的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比代替一般情況下的試劑空白參比，使測定吸光度數(shù)值在0.2-0.8范圍內(nèi)。4.配合物組成的測定摩爾比法：固定金屬離子濃度[M]，改變配體濃度[L]，在小于配合物組成比時，隨著[L]/[M]比值的最大，形成的配合物濃度最大，溶液的吸光度增加，達到配合物組成比之后，再增加[L]，即增加[L]/[M]比值，形成的配合物濃度已基本變，從吸光度A與[L]/[M]的關(guān)系曲線即可求得配合物的摩爾組成比。A[L]/[M]12120.7熒光分光光度法光致發(fā)光現(xiàn)象：某些物質(zhì)分子受到電磁輻射照射時，能發(fā)射出相同波長和更長波長的光。熒光是光致發(fā)光的一種。熒光現(xiàn)象：物質(zhì)吸收波長較短的光后，發(fā)出波長較長的光?？梢姡ǚ肿樱晒猓何镔|(zhì)吸收波長較短的紫外光后，發(fā)出波長較長的可見熒光。熒光分析法（熒光分光光度法）：利用分子熒光現(xiàn)象，測定熒光強度，從而測定熒光物質(zhì)或非熒光物質(zhì)（衍生化）。熒光分析法原理分子吸收光而被激發(fā)，使電子從基態(tài)上升至激發(fā)態(tài)，處于某一振動狀態(tài)；分子碰撞而失去振動能量，急劇降低至激發(fā)態(tài)中的最低振動能級；電子從激發(fā)態(tài)中的最低振動能級；躍遷回基態(tài)的各振動能級，并以光的形式釋放能量，此光即為熒光?；鶓B(tài)激發(fā)態(tài)無輻射躍遷熒光發(fā)射光譜熒光光譜能級躍遷圖能級吸收振動能級熒光分析法的特點：靈敏度高。比UV-Vis高約3個數(shù)量級。選擇性好。首先能發(fā)生熒光的物質(zhì)少，且發(fā)生熒光的物質(zhì)還必須吸收一定頻率的光（激發(fā)），即使不同物質(zhì)都吸收了特定頻率的光，不同物質(zhì)發(fā)出的熒光波長也不一定相同。方法簡便、快速。應(yīng)用范圍窄。這是因為能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)很有限。實例1：熒光分析法測定鄰-與間-羥基苯甲酸鄰-

與間-羥基苯甲酸均含有能發(fā)射熒光的苯環(huán)，但取代基的位置不同使它們具有不同的熒光性質(zhì)；堿性溶液中（pH12），二者在310nm附近紫外光的激發(fā)下均發(fā)生熒光，而在中性偏酸性溶液中（pH5.5）只有鄰-羥基苯甲酸發(fā)熒光；對-羥基苯甲酸在上述兩種條件下均不發(fā)生熒光，故不干擾測定。對于一個可能含有鄰-

、間-和對-羥基苯甲酸的樣品溶液，先在pH5.5測定鄰-羥基苯甲酸含量，然后在pH12測定鄰-與間-羥基苯甲酸總量，計算得到間-羥基苯甲酸含量。實例2：環(huán)糊精增敏4-羥基香豆素衍生熒光法測定肉制品中痕量亞硝酸鹽。在酸性溶液中，NO2-能與過量4-羥基香豆素形成低熒光衍生物—3-亞硝基-4-羥基香豆素，該產(chǎn)物經(jīng)Na2