2025年高考一輪總復(fù)習(xí)課件 第十單元　第48課　基因工程的基本工具和操作程序

第48課基因工程的基本工具和操作程序·學(xué)業(yè)質(zhì)量水平要求·1.概述基因工程是在遺傳學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。2.闡明DNA重組技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。3.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測、鑒定等步驟。重組DNA技術(shù)的基本工具1．基因工程的概念(1)手段：按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性。(2)目的：創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。(3)水平：DNA分子水平。(4)基礎(chǔ)：生物化學(xué)、分子生物學(xué)和微生物學(xué)等學(xué)科。2．基因工程的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”(2)DNA連接酶——“分子縫合針”①作用：將限制酶切割下來的DNA片段拼接成新的DNA分子，恢復(fù)被限制酶切開的兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。②類型常用類型E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌T4噬菌體特點(diǎn)只縫合黏性末端縫合黏性末端和平末端(3)基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”①作用：將外源基因送入受體細(xì)胞中。②種類：質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒等。③條件a．具有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)，供外源DNA插入其中。b．能在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制。c．具有標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。3．DNA的粗提取與鑒定(1)實(shí)驗(yàn)原理DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對它們進(jìn)行提取。①DNA不溶于酒精。②DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2__mol/L的NaCl溶液。③在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色。(2)實(shí)驗(yàn)步驟1．DNA連接酶能將兩堿基間的氫鍵連接起來。(×)2．E.coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端。(×)3．限制酶也可以識別和切割RNA。(×)4．質(zhì)粒是小型環(huán)狀DNA分子，是基因工程中常用的載體。(√)5．外源DNA必須位于重組質(zhì)粒的啟動子和終止子之間才能進(jìn)行復(fù)制。(×)6．切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列。(×)7．DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事。(×)1．(選擇性必修3P71旁欄思考改編)限制酶來源于原核生物，不能切割自己的DNA分子的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。2．(選擇性必修3P72旁欄思考改編)DNA連接酶和DNA聚合酶的作用區(qū)別是DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶是將單個脫氧核苷酸依次連接到DNA單鏈的末端。考向1|基因工程中工具酶的應(yīng)用1．(2024·江蘇淮安統(tǒng)考)基因工程中需使用多種工具酶，幾種限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列說法正確的是()A．限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的末端，可以通過E.coliDNA連接酶相互連接B．DNA連接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯鍵的形成C．限制酶EcoRⅠ進(jìn)行一次切割，會切斷2個磷酸二酯鍵，形成1個游離的5′-末端D．若兩種限制酶的識別序列相同，則形成的末端一定能通過DNA連接酶相互連接B解析：限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coliDNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA連接酶可連接黏性末端和平末端，但連接平末端的效率較低，A錯誤。DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵；DNA聚合酶將單個脫氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯鍵；RNA聚合酶將單個核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯鍵，B正確。一個限制酶切割一次，使DNA雙鏈斷開，會有2個磷酸二酯鍵斷裂，形成2個游離的5′-末端，C錯誤。若兩種限制酶的識別序列相同，但由于識別的位點(diǎn)不同，切割形成的末端不同，則不能通過DNA連接酶相互連接，D錯誤。與DNA有關(guān)的酶的比較名稱作用部位作用底物作用結(jié)果限制酶磷酸二酯鍵DNA將鏈狀DNA切成兩個片段，將環(huán)狀DNA切成一個片段DNA連接酶磷酸二酯鍵DNA片段將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯鍵脫氧核苷酸將單個脫氧核苷酸依次連接到DNA單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵DNA將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵DNA將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈RNA聚合酶磷酸二酯鍵核糖核苷酸將單個核糖核苷酸依次連接到RNA單鏈末端2．(2024·重慶聯(lián)考)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是()A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接C解析：酶3切割后得到的是平末端，應(yīng)該用T4DNA連接酶連接，A錯誤；質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接，B錯誤；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達(dá)載體的構(gòu)建方案最合理且高效，C正確；若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達(dá)載體缺少標(biāo)記基因，無法進(jìn)行后續(xù)的篩選，D錯誤。限制酶的選擇(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類①應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。②不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn))。(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，以確保產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端。②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)。如圖乙中限制酶SmaⅠ會破壞標(biāo)記基因?？枷?|基因工程中載體的應(yīng)用3．作為基因工程的運(yùn)輸工具——運(yùn)載體，必須具備的條件及理由是()A．具有多個限制酶切點(diǎn)，以便于目的基因的表達(dá)B．具有某些標(biāo)記基因，以使目的基因能夠與其結(jié)合C．能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地保存下來并大量復(fù)制，以便目的基因能夠穩(wěn)定的存在和擴(kuò)大數(shù)量D．對宿主細(xì)胞無傷害，以便于重組DNA的鑒定和選擇C解析：質(zhì)粒等運(yùn)載體應(yīng)具有多個限制酶切點(diǎn)，以便于目的基因的插入，A錯誤；質(zhì)粒等運(yùn)載體應(yīng)具有某些標(biāo)記基因，以便篩選含有目的基因的受體細(xì)胞，B錯誤；質(zhì)粒等運(yùn)載體應(yīng)能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地保存下來并大量復(fù)制，以便目的基因能夠穩(wěn)定的存在和擴(kuò)大數(shù)量，C正確；質(zhì)粒等運(yùn)載體必須具有某些標(biāo)記基因，以便于重組DNA的鑒定和選擇，D錯誤。4．(2024·陜西渭南模擬)質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體，它存在于許多細(xì)菌體內(nèi)。質(zhì)粒上的標(biāo)記基因如圖所示，通過標(biāo)記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉(zhuǎn)移成功。外源基因插入的位置不同，細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長情況不同，下圖表示外源基因插入位置(插入點(diǎn)有a、b、c)，請根據(jù)表中提供細(xì)菌的生長情況，推測①②③三種重組后細(xì)菌的外源基因插入點(diǎn)，正確的一組是()分類細(xì)菌在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長情況細(xì)菌在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生長情況①能生長能生長②能生長不能生長③不能生長能生長A．①是c；②是b；③是aB．①是a和b；②是a；③是bC．①是a和b；②是b；③是aD．①是c；②是a；③是bA解析：第①組：細(xì)胞能在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長，說明抗氨芐青霉素基因沒有被破壞；細(xì)菌能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上的生長，說明抗四環(huán)素基因沒有被破壞，由此可知，外源基因插入的位置不是a、b，而是c。第②組：細(xì)胞能在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長，說明抗氨芐青霉素基因沒有被破壞；細(xì)菌不能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生長，說明抗四環(huán)素基因被破壞，由此可知，外源基因插入位置是b。第③組：細(xì)胞不能在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長，能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生長，說明抗氨芐青霉素基因被破壞，抗四環(huán)素基因沒有被破壞，由此可知，外源基因插入的位置是a。故選A。細(xì)胞膜上的載體(蛋白)與基因工程中的載體的兩個“不同”(1)化學(xué)本質(zhì)不同①細(xì)胞膜上的載體的化學(xué)成分是蛋白質(zhì)。②基因工程中的載體可能是物質(zhì)，如質(zhì)粒(DNA)，也可能是生物，如噬菌體、動植物病毒等。(2)功能不同①細(xì)胞膜上的載體的功能是協(xié)助細(xì)胞膜控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。②基因工程中的載體是一種“分子運(yùn)輸車”，把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞?？枷?|DNA的粗提取與鑒定5．(2023·廣東卷)“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的基本過程是裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是()A．裂解：使細(xì)胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)B．分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等C．沉淀：可反復(fù)多次以提高DNA的純度D．鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色D解析：裂解是加蒸餾水讓細(xì)胞吸水漲破，釋放出DNA等物質(zhì)，A正確；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，其能溶于2mol/L的NaCl溶液，將溶液過濾，即可將混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等與DNA分離，B正確；DNA不溶于酒精，而某些蛋白質(zhì)溶于酒精，可以反復(fù)多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA純度，C正確；將DNA溶解于NaCl溶液中，加入二苯胺試劑后沸水浴5min，待冷卻后，溶液呈現(xiàn)藍(lán)色，D錯誤。6．下圖為雞血細(xì)胞中DNA的粗提取和鑒定實(shí)驗(yàn)過程中的部分操作示意圖，請據(jù)圖分析，下列相關(guān)敘述中，正確的是()A．該實(shí)驗(yàn)的正確操作順序是③→①→②→④→⑤B．用同樣方法從等體積豬血和雞血中提取的DNA量相近C．⑤表示要鑒定步驟①中所得到的白色絲狀物主要成分為DNA，可使用二苯胺試劑來鑒定，沸水浴冷卻后，出現(xiàn)藍(lán)色的試管組別是對照組D．步驟①的目的是初步分離DNA與蛋白質(zhì)，析出并獲得DNA；步驟④中在2mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度較大D解析：DNA的粗提取和鑒定步驟是加入蒸餾水，破碎細(xì)胞→過濾，獲取含DNA的濾液→去除濾液中雜質(zhì)→DNA的析出→鑒定，因此題圖中正確的實(shí)驗(yàn)操作順序是③→②→①→④→⑤，A錯誤；豬血成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核，提取不到DNA，用同樣方法從等體積豬血和雞血中提取的DNA量不相同，B錯誤；⑤表示要鑒定步驟①中所得到的白色絲狀物主要成分為DNA，可使用二苯胺試劑來鑒定，沸水浴冷卻后，出現(xiàn)藍(lán)色的試管組別是實(shí)驗(yàn)組，出現(xiàn)藍(lán)色則證明該絲狀物的主要成分是DNA，C錯誤；步驟①的目的是析出并獲得DNA，步驟④中在2mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度較大，D正確。基因工程的基本操作程序1．目的基因的篩選與獲取(1)目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。(2)篩選合適的目的基因①從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。②利用序列數(shù)據(jù)庫和序列比對工具進(jìn)行篩選。(3)目的基因的獲?、偃斯ず铣赡康幕?。②常用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因。③構(gòu)建基因文庫獲取目的基因(4)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因①原理：DNA復(fù)制。②條件：DNA模板、2種引物、耐高溫的DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸。③擴(kuò)增過程過程說明圖解變性溫度超過90℃時，雙鏈DNA解聚為單鏈復(fù)性溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合延伸溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈④PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的比較⑤PCR中引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意的問題a．設(shè)計(jì)引物的依據(jù)：目的基因兩端的核苷酸序列。b．引物設(shè)計(jì)時既要考慮目的基因序列，又要考慮載體序列，原因：為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的5′-端加上限制酶的酶切位點(diǎn)。c．使用的一對引物的序列不相同，因?yàn)槟康幕騼啥司哂胁煌暮塑账嵝蛄小．引物設(shè)計(jì)的要求(或引物失效的原因)：每種引物內(nèi)部不能發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對；兩種引物之間不能在局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對。e．每種引物內(nèi)部不能發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對的原因：防止引物自身折疊。f．兩種引物之間不能在局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對的原因：防止引物之間配對，導(dǎo)致引物不能同模板鏈結(jié)合。g．兩種引物都結(jié)合在DNA模板鏈的3′-端；脫氧核苷酸連接在引物的3′-端進(jìn)行延伸。2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。(2)基因表達(dá)載體的組成及作用3．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(1)轉(zhuǎn)化的含義：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。(2)轉(zhuǎn)化的方法類型常用方法常用受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法體細(xì)胞將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→侵染植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上→表達(dá)動物顯微注射法受精卵將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→胚胎移植→獲得具有新性狀的動物微生物Ca2+轉(zhuǎn)化法原核細(xì)胞Ca2+處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞(細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài))→重組表達(dá)載體(DNA分子)與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子(3)篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞①原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如上圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。②被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含質(zhì)粒的細(xì)菌。③篩選方法：將細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含質(zhì)粒的細(xì)菌，如上圖1、2、3、4、5菌落。再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如上圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如上圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。4．目的基因的檢測與鑒定(1)分子水平檢測檢測方法檢測目的判斷標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增和電泳鑒定目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否出現(xiàn)相應(yīng)的電泳條帶或是否出現(xiàn)雜交帶目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA抗原—抗體雜交技術(shù)目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)是否出現(xiàn)雜交帶(2)個體水平鑒定例如：通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度。5．DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(1)實(shí)驗(yàn)原理①PCR原理：利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。②電泳：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。③PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。(2)實(shí)驗(yàn)步驟(3)DNA的電泳鑒定(4)成功擴(kuò)增出DNA片段的判斷依據(jù)是可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶。1．基因表達(dá)載體中含有啟動子和密碼子。(×)2．檢測目的基因是否成功表達(dá)可用抗原—抗體雜交技術(shù)。(√)3．將重組表達(dá)載體導(dǎo)入動物受精卵常用基因槍法。(×)4．用PCR方法擴(kuò)增目的基因時需要設(shè)計(jì)兩種引物。(√)5．用PCR方法擴(kuò)增目的基因時不必知道基因的全部序列。(√)6．抗蟲基因即使成功地插入植物細(xì)胞染色體DNA上也未必能正常表達(dá)。(√)7．從大腸桿菌細(xì)胞中獲得了人胰島素基因的mRNA，說明目的基因完成了表達(dá)。(×)1．(選擇性必修3P78圖3-5延伸)自然界中的DNA復(fù)制和PCR都需要引物的原因是在DNA合成時，DNA聚合酶只能從已有的脫氧核苷酸鏈的3′-端開始連接脫氧核苷酸，從5′-端到3′-端延伸子鏈。2．(選擇性必修3P79旁欄思考)用PCR不可以擴(kuò)增mRNA的原因是PCR是用DNA雙鏈做模板，不能直接用單鏈RNA進(jìn)行PCR，必須把mRNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA之后再進(jìn)行PCR?？枷?|PCR技術(shù)與應(yīng)用分析1．(2024·黑龍江大慶統(tǒng)考)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似，過程如圖所示。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。下列敘述錯誤的是()A．引物A、B的堿基不能進(jìn)行互補(bǔ)配對B．復(fù)性的目的是讓引物與單鏈DNA相結(jié)合C．延伸時，DNA聚合酶從引物的3′-端連接脫氧核苷酸D．第二輪循環(huán)后，同時含有引物A、B的DNA占100%D解析：如果引物A和引物B發(fā)生堿基互補(bǔ)配對則不能與相應(yīng)模板鏈結(jié)合，無法完成子鏈的延伸，故引物A、B的堿基不能進(jìn)行互補(bǔ)配對，A正確；復(fù)性的目的是讓引物通過堿基互補(bǔ)配對與單鏈DNA結(jié)合，B正確；延伸時，在DNA聚合酶的作用下，將4種脫氧核苷酸加到引物的3′-端，C正確；DNA復(fù)制為半保留復(fù)制，第二輪循環(huán)即DNA復(fù)制2次，共形成22＝4個DNA分子，其中含有最初模板鏈的2個DNA分子含有引物A或引物B，其余2個DNA分子均含有引物A和引物B，所以第二輪循環(huán)產(chǎn)物中同時含有引物A和引物B的DNA片段占50%，D錯誤。2．下圖表示PCR過程中某個階段反應(yīng)體系的情況，①②③④表示相關(guān)物質(zhì)，L、R表示方向。下列敘述正確的是()A．②鏈從L到R的方向?yàn)?′→5′，①②鏈均可作為子鏈合成的模板B．PCR過程需要通過解旋酶斷開氫鍵，且為邊解旋邊復(fù)制C．以1個DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)需消耗8個引物③D．物質(zhì)③的5′-端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得該序列的雙鏈產(chǎn)物D解析：根據(jù)DNA分子中兩條鏈的反向平行關(guān)系可判斷，②鏈從L到R的方向?yàn)?′→3′，題圖中①②鏈均可作為子鏈合成的模板，A錯誤；PCR過程需要通過高溫處理使雙鏈中氫鍵斷裂成為單鏈，再通過降溫使子鏈和引物之間形成雙鏈結(jié)構(gòu)，而后調(diào)節(jié)溫度使子鏈沿著引物的3′-端延伸，B錯誤；以1個DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子數(shù)目為23＝8個，則需消耗引物③的數(shù)目為(8×2－2)÷2＝7個，C錯誤；物質(zhì)③的5′-端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得以該序列為模板合成的雙鏈DNA產(chǎn)物，D正確。PCR過程的兩點(diǎn)提醒(1)復(fù)性不一定均為引物與DNA模板結(jié)合。復(fù)性時，引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，也存在DNA解開的兩條鏈的結(jié)合。(2)PCR反應(yīng)的結(jié)果不都是所需的DNA片段。因?yàn)榈谝淮窝h(huán)得到的DNA片段只有一種引物，比所需的DNA片段要長，從第三次循環(huán)才出現(xiàn)所需的DNA片段，這樣的片段存在兩種引物?？枷?|目的基因的獲取及表達(dá)載體的構(gòu)建3．(2023·廣東卷)種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。研究者對野生型擬南芥(2n＝10)進(jìn)行誘變，篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測序，發(fā)現(xiàn)野生型DAI基因發(fā)生一個堿基G到A的替換，突變后的基因?yàn)殡[性基因，據(jù)此推測突變體的表型與其有關(guān)，開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)?；卮鹣铝袉栴}：(1)擬采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DAI基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由該突變造成，則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與____________植株的種子大小相近。(2)用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DAI基因，用限制性內(nèi)切核酸酶對PCR產(chǎn)物和__________進(jìn)行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DAI基因可以正常表達(dá)，其上下游序列需具備________________。(3)轉(zhuǎn)化后，T-DNA(其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時不發(fā)生交換)可在基因組單一位點(diǎn)插入也可以同時插入多個位點(diǎn)。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下，選出單一位點(diǎn)插入的植株，并進(jìn)一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株(如圖甲)，用于后續(xù)驗(yàn)證突變基因與表型的關(guān)系。①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T1代植株并自交，將T1代種子播種在選擇培養(yǎng)基上，能夠萌發(fā)并生長的陽性個體即表示其基因組中插入了__________________________。②T1代陽性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，選擇陽性率約______%的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。③將②中選出的T2代陽性植株________(填“自交”“與野生型雜交”或“與突變體雜交”)所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，陽性率達(dá)到________%的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。為便于在后續(xù)研究中檢測該突變，研究者利用PCR擴(kuò)增野生型和突變型基因片段，再使用限制性內(nèi)切核酸酶X切割產(chǎn)物。通過核酸電泳即可進(jìn)行突變檢測，相關(guān)信息如圖乙，在電泳圖中將酶切結(jié)果對應(yīng)位置的條帶涂黑。解析：(1)突變后的基因?yàn)殡[性基因，所以將DAI基因?qū)胪蛔凅w植株后，若突變體表型確由該突變造成，則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小與野生型植株的種子大小相近。(2)用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DAI基因，用同種限制性內(nèi)切核酸酶對PCR產(chǎn)物和載體進(jìn)行切割、用DNA連接酶將兩者連接；為確保插入的DAI基因可以正常表達(dá)，其上下游序列需具備啟動子和終止子。(3)①因?yàn)檫x擇的是單一位點(diǎn)插入的植株，所以能在卡那霉素選擇培養(yǎng)基上生長的陽性個體的基因組中插入了卡那霉素抗性基因和DAI基因。②假設(shè)控制種子大小這一性狀的基因用A/a表示，T1代陽性植株是單一位點(diǎn)插入的植株，類似于顯性雜合子(Aa)，所以自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，應(yīng)該選擇基因型為A_的植株，即選擇陽性率為75%的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。③步驟②中選出的T2代陽性植株中既有純合子(AA)又有雜合子(Aa)，所以需要進(jìn)行自交，所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，陽性率達(dá)到100%的培養(yǎng)基中的幼苗即為純合子，是目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。由圖乙可知，限制性內(nèi)切核酸酶X可以將突變基因切割為50bp和100bp兩個片段，而野生型基因無限制酶X的切割位點(diǎn)，故電泳圖具體酶切結(jié)果見答案。答案：(1)野生型(2)載體啟動子和終止子(3)①DAI基因和卡那霉素抗性基因②75③自交100(1)基因工程中的基因表達(dá)載體≠載體：基因表達(dá)載體與載體相比增加了目的基因。(2)目的基因插入位點(diǎn)不是隨意的：基因表達(dá)載體需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入啟動子和終止子之間的部位，若目的基因插入啟動子部位，啟動子將失去原功能。(3)切割目的基因和載體并非只能用同一種限制酶。如果兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來。考向3|將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞及目的基因的檢測與鑒定4．(2024·遼寧沈陽模擬)生長素參與植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)，生長素運(yùn)輸?shù)鞍?PINI)對IAA的極性運(yùn)輸具有重要作用。為研究35S啟動子(一種來自病毒的強(qiáng)啟動子)能否引起下游基因的過量表達(dá)，研究人員將35S啟動子與PINI基因轉(zhuǎn)入擬南芥，觀察PINI過量表達(dá)對植物的影響。(1)獲取PINI基因的mRNA后，通過RT-PCR擴(kuò)增獲取PINI基因(DNA)時所需要的酶是________________。每次PCR循環(huán)分為3步，其中所需溫度最低的一步稱為________________。(2)PINI基因不能直接導(dǎo)入受體細(xì)胞，需要構(gòu)建PINI表達(dá)載體。構(gòu)建PINI表達(dá)載體的目的是____________________________________________________________。(3)為將PINI基因以正確方向插入質(zhì)粒需要雙酶切。在設(shè)計(jì)引物時，需在引物的5′-端加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。已知PINI基因的1鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈，據(jù)下圖分析，引物1和引物2的酶切位點(diǎn)分別為____________________，理由是_________________________________。(4)提取轉(zhuǎn)基因擬南芥的DNA，用相應(yīng)引物擴(kuò)增出35S啟動子和PINI基因。為檢測目的基因是否導(dǎo)入擬南芥，應(yīng)電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中的________________，不檢測另一種的原因是__________________________________________________。也可在個體水平上進(jìn)行檢測，方法是_____________________________________________________。解析：(1)由PINI基因的mRNA作為模板，來合成PINI基因(DNA)，是逆轉(zhuǎn)錄過程，然后進(jìn)行PCR，故需要逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶。PCR循環(huán)包括變性(90℃以上)、復(fù)性(50℃左右)、延伸(72℃左右)三步，溫度最低的是復(fù)性。(2)構(gòu)建PINI表達(dá)載體，使PINI基因隨表達(dá)載體在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并遺傳給下一代；表達(dá)載體中有啟動子和終止子，利于PINI基因在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。(3)已知PINI基因的1鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈，DNA模板鏈轉(zhuǎn)錄方向是從3′-端向5′-端，RNA鏈的合成方向是從5′-端向3′-端，根據(jù)題圖2中質(zhì)粒的35S啟動子的轉(zhuǎn)錄方向，PINI基因的引物2端應(yīng)接入35S啟動子的后面，位于PINI基因的上游，引物1端接入終止子端，位于PINI基因的下游，所以引物2的酶切位點(diǎn)是EcoRⅠ、引物1的酶切位點(diǎn)是PstⅠ，不能用XhoⅠ進(jìn)行酶切，XhoⅠ會將PINI基因切斷。(4)檢測目的基因是否導(dǎo)入擬南芥，應(yīng)電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中的35S啟動子，不能檢測PINI基因。因?yàn)閿M南芥細(xì)胞中原本存在PINI基因，檢測PINI基因無法確定外源PINI基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞。也可在個體水平上進(jìn)行檢測，由于基因表達(dá)載體中含有抗除草劑基因，方法是對轉(zhuǎn)基因擬南芥噴灑適宜濃度的除草劑，觀察能否存活，能存活的是轉(zhuǎn)基因成功的擬南芥。答案：(1)逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶復(fù)性(2)利于PINI基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并遺傳給下一代；利于PINI基因在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用(3)PstⅠ、EcoRⅠ(順序不可顛倒)PINI基因中含有XhoⅠ，引物上的酶切位點(diǎn)不能為XhoⅠ，1鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈，該鏈在啟動子后的方向應(yīng)為3′→5′，因此，引物應(yīng)2應(yīng)位于PINI基因的上游，其上應(yīng)構(gòu)建EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)；引物1應(yīng)位于PINI基因的下游，其上應(yīng)構(gòu)建PstⅠ的酶切位點(diǎn)(4)35S啟動子擬南芥細(xì)胞中原本存在PINI基因，檢測PINI基因無法確定外源PINI基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞對轉(zhuǎn)基因擬南芥噴灑適宜濃度的除草劑，觀察能否存活課時質(zhì)量評價(四十八)(建議用時：40分鐘)一、選擇題1．(2024·海南海口模擬)限制酶、DNA連接酶等的發(fā)現(xiàn)為DNA分子的切割、連接及基因表達(dá)載體的構(gòu)建創(chuàng)造了條件。下列關(guān)于重組DNA技術(shù)基本工具的敘述，正確的是()A．限制酶在原核細(xì)胞內(nèi)的主要作用是切割修剪自身的DNAB．噬菌體、動植物病毒均可作為載體將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞C．用作載體的質(zhì)粒DNA分子上可以不含有限制酶切割位點(diǎn)D．DNA連接酶可連接DNA分子兩條鏈中堿基對之間的氫鍵B解析：限制酶主要從原核生物中分離純化而來，其在原核細(xì)胞中的主要作用是切割外源DNA使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的，A錯誤；將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，常需要將目的基因與運(yùn)載體結(jié)合構(gòu)建基因表達(dá)載體，常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒等，B正確；用作載體的質(zhì)粒上應(yīng)有限制酶的切割位點(diǎn)，這是質(zhì)粒作為運(yùn)載體的條件之一，C錯誤；DNA連接酶連接的是磷酸二酯鍵，D錯誤。2．(2024·福建廈門模擬)下表為四種限制酶所識別的核苷酸序列及相應(yīng)的切割位置(箭頭所指)，下列敘述正確的是()限制酶種類序列及切點(diǎn)限制酶種類序列及切點(diǎn)①EcoRⅠ③BglⅡ②BamHⅠ④NotⅠA．①②③④可催化磷酸二酯鍵和氫鍵斷裂，形成黏性末端B．①切出的DNA片段，只有用E.coliDNA連接酶才能連接起來C．②③切出的末端連接后形成的片段，不能再被②或③識別切割D．構(gòu)建基因表達(dá)載體時，用②③進(jìn)行雙酶切，可防止目的基因與載體的反向連接C解析：①②③④均為限制酶，可催化磷酸二酯鍵的斷裂，不能催化氫鍵的斷裂，且均形成黏性末端，A錯誤；①切出的DNA片段，帶有黏性末端，用E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶均能連接起來，B錯誤；②③切出的黏性末端相同，用DNA連接酶連接后形成的片段的堿基序列為—GGATCT—，因而不能再被②或③識別切割，C正確；構(gòu)建基因表達(dá)載體時，用②③進(jìn)行雙酶切，不能防止目的基因與載體的反向連接，因?yàn)檫@兩種限制酶切出的黏性末端是相同的，D錯誤。3．(2024·江蘇南通模擬)南通某中學(xué)學(xué)生以新鮮花菜為實(shí)驗(yàn)材料開展了DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)，部分過程如下圖。相關(guān)敘述錯誤的是()A．過程①中的研磨液具有瓦解細(xì)胞膜、使蛋白質(zhì)變性的作用B．過程②中應(yīng)用墊有紗布的漏斗進(jìn)行過濾，取其濾液C．過程③依據(jù)的原理是蛋白質(zhì)等雜質(zhì)能溶于酒精，而DNA不溶D．過程④沸水浴后，試管a、b中溶液顏色分別為無色、藍(lán)色A解析：過程①中的研磨液的成分是洗滌劑和NaCl，洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜，NaCl能夠溶解DNA，沒有使蛋白質(zhì)變性的作用，A錯誤；步驟②應(yīng)用墊有紗布的漏斗過濾后取濾液，B正確；過程③依據(jù)的原理是蛋白質(zhì)等雜質(zhì)能溶于酒精，而DNA不溶，利用這一原理能初步分離DNA與蛋白質(zhì)，C正確；在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍(lán)色，試管a中無DNA，試管b中含有DNA，過程④沸水浴后，試管a、b中溶液顏色分別為無色、藍(lán)色，D正確。4．(2024·浙江臺州模擬)某校學(xué)習(xí)小組進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，甲、乙、丙三名同學(xué)分別以酵母菌為材料，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各取20μL產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，得到的結(jié)果如下圖。下列敘述錯誤的是()A．凝膠a端靠近電泳槽的負(fù)極接線柱B．甲同學(xué)設(shè)置的PCR循環(huán)次數(shù)可能比乙同學(xué)多C．丙同學(xué)所用的引物可能與甲、乙同學(xué)的不一樣D．丙同學(xué)擴(kuò)增得到的片段比甲、乙同學(xué)的要大D解析：在a端點(diǎn)樣孔，DNA分子帶負(fù)電荷，在電場的作用下會向正極移動，故凝膠a端靠近電泳槽的負(fù)極接線柱，A正確；甲同學(xué)的電泳條帶比乙同學(xué)條帶寬，說明甲同學(xué)擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物多于乙同學(xué)，故甲同學(xué)設(shè)置的PCR循環(huán)次數(shù)可能比乙同學(xué)多，B正確；由題圖可知，丙同學(xué)擴(kuò)增出來的產(chǎn)物與甲、乙同學(xué)產(chǎn)物不同，DNA片段長度不同，即丙同學(xué)所用的引物可能與甲、乙同學(xué)的不一樣，C正確；丙同學(xué)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶距離點(diǎn)樣孔更遠(yuǎn)，說明丙同學(xué)擴(kuò)增的DNA分子更小，遷移速率更快，D錯誤。5．(2024·北京海淀模擬)科研人員從四川臥龍自然保護(hù)區(qū)采集到的大熊貓糞便中提取DNA，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA來區(qū)分不同大熊貓個體，進(jìn)而統(tǒng)計(jì)大熊貓種群密度。下列敘述不正確的是()A．野生大熊貓種群密度調(diào)查不適合用標(biāo)記重捕法B．PCR擴(kuò)增的序列應(yīng)在大熊貓的不同個體間存在差異C．大熊貓糞便中的脫落細(xì)胞可為PCR提供模板DNAD．不同糞便樣本的PCR擴(kuò)增結(jié)果一定存在明顯差異D解析：題意顯示，野生大熊貓數(shù)量較少，且其體型較大，調(diào)查分布范圍小、數(shù)量少、個體較大的種群的密度時，可采用逐個計(jì)數(shù)法，不適合用標(biāo)記重捕法，A正確；由于DNA分子具有特異性，因而可推測，PCR擴(kuò)增的序列應(yīng)在大熊貓的不同個體間存在差異，B正確；大熊貓糞便中的脫落細(xì)胞可為PCR提供模板DNA，進(jìn)而可通過PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA來區(qū)分不同大熊貓個體，據(jù)此統(tǒng)計(jì)大熊貓種群密度，C正確；由于大熊貓個體數(shù)量過少，即遺傳多樣性較低，因此，不同糞便樣本的PCR擴(kuò)增結(jié)果未必一定存在明顯差異，D錯誤。6．(2024·廣東深圳期末)研究者欲將X基因?qū)氲酱竽c桿菌的質(zhì)粒中保存。該質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因(表達(dá)產(chǎn)物可以分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，使菌落呈藍(lán)色；否則菌落為白色)，其結(jié)構(gòu)如下圖所示。下列敘述錯誤的是()A．電泳時，X基因和重組質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠中的遷移速率不同B．導(dǎo)入重組質(zhì)粒前通常需用適宜濃度的Ca2+溶液處理大腸桿菌C．應(yīng)在添加了氨芐青霉素和X-gal的培養(yǎng)基上篩選大腸桿菌D．成功導(dǎo)入X基因的細(xì)菌在含X-gal的培養(yǎng)基上的菌落呈藍(lán)色D解析：電泳是指帶電離子在電場的作用下，發(fā)生遷移的過程；在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率最終取決于分子的大小，X基因和重組質(zhì)粒分子質(zhì)量不同，所以遷移速率不同，A正確；將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌前，一般先用Ca2+處理大腸桿菌，使細(xì)胞處于一種容易吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，B正確；由于重組質(zhì)粒上含有氨芐青霉素抗性基因(AmpR)和LacZ基因，所以導(dǎo)入并表達(dá)成功后的大腸桿菌會出現(xiàn)對氨芐青霉素有抗性且菌落中出現(xiàn)特定顏色，所以用添加了氨芐青霉素和X-gal的培養(yǎng)基篩選大腸桿菌，C正確；導(dǎo)入X基因會使LacZ基因被破壞，使其不能產(chǎn)生正常的表達(dá)產(chǎn)物，所以在含X-gal的培養(yǎng)基上的菌落呈白色，D錯誤。7．(2024·廣東珠海模擬)下圖為利用大腸桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)HPV疫苗的過程，質(zhì)粒中l(wèi)acZ基因可以編碼產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，可以分解物質(zhì)X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，從而使菌落呈藍(lán)色，否則呈白色。下列有關(guān)敘述錯誤的是()A．構(gòu)建重組質(zhì)粒時不選EcoRⅠ以免破壞目的基因B．作為受體的大腸桿菌不應(yīng)含氨芐青霉素抗性基因，以便于篩選C．篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在培養(yǎng)基中加入X-gal和青霉素D．在選擇培養(yǎng)基上篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)挑選藍(lán)色菌落D解析：目的基因內(nèi)部含有EcoRⅠ識別位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒時不選EcoRⅠ以免破壞目的基因，A正確。作為受體的大腸桿菌不應(yīng)含氨芐青霉素抗性基因，質(zhì)粒上的氨芐青霉素抗性基為標(biāo)記基因，含重組質(zhì)粒的大腸桿菌才可以在含青霉素的培養(yǎng)基上生存，沒有導(dǎo)入任何外源DNA的大腸桿菌不能在含青霉素的培養(yǎng)基上生存，進(jìn)而可篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，B正確。篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在培養(yǎng)基中加入X-gal和青霉素，質(zhì)粒中l(wèi)acZ基因可使細(xì)菌利用培養(yǎng)基中的物質(zhì)X-gal，從而使菌落呈藍(lán)色，若無該基因，則菌落呈白色，由題意可知，需將目的基因插到lacZ基因的內(nèi)部，導(dǎo)致lacZ基因被破壞，因此含重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落呈白色；若大腸桿菌菌落呈藍(lán)色，說明導(dǎo)入的是不含目的基因的空白質(zhì)粒；沒有導(dǎo)入任何外源DNA的大腸桿菌不能在該培養(yǎng)基上生存，進(jìn)而篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，C正確。由題意可知，需將目的基因插到lacZ基因的內(nèi)部，導(dǎo)致lacZ基因被破壞，因此含重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落呈白色，故應(yīng)挑選白色菌落，D錯誤。二、非選擇題8．(2024·江西宜春模擬)PHB2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列(簡稱phb2基因)，利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白?；卮鹣铝袉栴}：(1)為獲取phb2基因，提取該動物肝臟組織的RNA，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過程得到cDNA，將其作為PCR反應(yīng)的模板，并設(shè)計(jì)一對特異性引物來擴(kuò)增目的基因。下圖為所用載體圖譜示意圖，質(zhì)粒DNA含有啟動子，啟動子的作用是________________________________________。注：箭頭表示切割位點(diǎn)。(2)構(gòu)建基因表達(dá)載體需要用到限制酶和DNA連接酶，其中，DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是__________。圖1中限制酶的識別序列及切割位點(diǎn)見表，為使phb2基因(該基因序列不含圖中限制酶的識別序列)與載體正確連接，在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入________和________兩種不同限制酶的識別序列。經(jīng)過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時，可選用__________(填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”)。(3)轉(zhuǎn)化前需用________處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于________，以提高轉(zhuǎn)化效率。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含__________的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。解析：(1)啟動子是RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列，多數(shù)位于結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游，能驅(qū)動目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。(2)DNA是雙螺旋結(jié)構(gòu)，每條鏈相鄰脫氧核苷酸之間是通過磷酸二酯鍵連接的，DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵。目的基因應(yīng)導(dǎo)入啟動子和終止子之間，分析題圖可知，啟動子和終止子之間存在三種限制酶切點(diǎn)，但是由于KpnⅠ在質(zhì)粒上不止一個酶切位點(diǎn)，所以應(yīng)該選擇在目的基因兩端分別引入EcoRⅠ和PvitⅡ兩種不同限制酶的識別序列。根據(jù)PvitⅡ的酶切序列，切割后形成平末端，所以構(gòu)建基因表達(dá)載體時，應(yīng)該用T4DNA連接酶連接質(zhì)粒和目的基因，而E.coliDNA連接酶只能連接黏性末端。(3)自然條件下，細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率很低，科學(xué)家常使用CaCl2溶液(或Ca2+)處理大腸桿菌細(xì)胞，使其成為感受態(tài)(一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài))細(xì)胞，有利于目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞，提高轉(zhuǎn)化效率。重組質(zhì)粒中存在氨芐青霉素抗性基因，所以可將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以篩選出轉(zhuǎn)化成功的質(zhì)粒。答案：(1)RNA聚合酶識別結(jié)合的位點(diǎn)，驅(qū)動目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA(2)磷酸二酯鍵PvitⅡEcoRⅠT4DNA連接酶(3)CaCl2(或Ca2+)感受態(tài)氨芐青霉素9．(2024·山東棗莊模擬)人的血清蛋白(HSA)具有重要的醫(yī)用價值，研究人員欲用乳腺生物反應(yīng)器來大量生產(chǎn)HSA。下圖所示為HSA基因片段和人工構(gòu)建的大腸桿菌質(zhì)粒pBR322，圖中AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，NeoR表示新霉素抗性基因，箭頭表示切割形成末端完全不同的4種限制酶的切割位點(diǎn)。請據(jù)圖回答問題：(1)人工構(gòu)建pBR322質(zhì)粒除了含特定限制酶切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)外，還必須有__________(答出兩點(diǎn))等。(2)若選用牛作為受體動物，可將人血清蛋白基因與______________________等調(diào)控組件重組在一起，通過__________方法將目的基因?qū)肱５氖芫阎校缓笫蛊浒l(fā)育成轉(zhuǎn)基因牛，可從其乳汁中獲取人血清蛋白。(3)據(jù)圖分析，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時，選擇__________作為切割質(zhì)粒和目的基因的限制酶可提高目的基因和載體的正確連接效率，其原因是_______________________________。(4)為了排除普通受體細(xì)胞(未導(dǎo)入質(zhì)粒)、空質(zhì)粒受體細(xì)胞(導(dǎo)入pBR322質(zhì)粒而非重組質(zhì)粒)的干擾，目的基因?qū)牒螅M(jìn)行了進(jìn)一步篩選：制備甲、乙兩種培養(yǎng)基，甲培養(yǎng)基含新霉素，乙培養(yǎng)基含新霉素和氨芐青霉素，含重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞在甲培養(yǎng)基上________(填“能”或“不能”)生存，在乙培養(yǎng)基上__________(填“能”或“不能”)生存。(5)據(jù)下圖分析，利用PCR技術(shù)獲取HSA基因時，應(yīng)選擇甲、乙、丙、丁四種引物中的__________，需擴(kuò)增__________次后才可得到所需的HSA目的基因。解析：(1)基因工程的關(guān)鍵步驟是構(gòu)建基因表達(dá)載體，基因表達(dá)載體主要由啟動子、目的基因、標(biāo)記基因和終止子組成，因此人工構(gòu)建pBR322質(zhì)粒除了含特定限制酶切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)外，還必須有啟動子、終止子等。(2)因?yàn)槿橄俚鞍谆蛑荒茉谌橄偌?xì)胞中表達(dá)，故要從奶牛的乳汁中獲得人血清蛋白，選用牛作為受體動物，則在構(gòu)建基因的表達(dá)載體時，要將人血清蛋白基因與乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控組件重組在一起。根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣，將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞最有效的方法是顯微注射法。(3)據(jù)題圖可知，BamHⅠ會破壞目的基因，TthⅢ1會切割質(zhì)粒中的復(fù)制原點(diǎn)，而EcoRⅠ和PstⅠ這兩種酶能切割質(zhì)粒和目的基因，不破壞抗性基因和復(fù)制原點(diǎn)等，且能得到不同的黏性末端，避免質(zhì)粒和目的基因的自連及反接，因此在構(gòu)建基因表達(dá)載體時，選擇EcoRⅠ和PstⅠ作為切割質(zhì)粒和目的基因的限制酶可提高目的基因和載體的正確連接效率。(4)分析題圖可知，PstⅠ破壞了氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，構(gòu)建的重組質(zhì)粒無氨芐青霉素抗性基因，但具有新霉素抗性基因。甲培養(yǎng)基中含有新霉素，因此，含重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞能在甲培養(yǎng)基上生存；乙培養(yǎng)基中含有新霉素和氨芐青霉素，能殺死含有目的基因的受體細(xì)胞，故其不能在乙培養(yǎng)基中生存。(5)進(jìn)行PCR時，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3′-端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5′-端到3′-端，因此據(jù)圖分析，利用PCR技術(shù)