DB21T 2327-2014 豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法

ICS11.220B41DB21DB21/T2327—2014豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法MethodofrealtimefluozescentPCRforthedetectionofporcinecircovirustype2遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2327—2014本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提出。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省畜牧獸醫(yī)局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：于學(xué)武、顧貴波、趙曉彤、崔基賢、陳瑤、魏澍、馬建山、王竹、申貫?zāi)?、趙鳳菊、李璐、李曉楠、于丹、王海豐1DB21/T2327—2014本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬圓環(huán)病毒2型（porcinecircovirustype2，PCV2）實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于PCV2的診斷、監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查，適用于豬臟器、血液、排泄物和細(xì)胞培養(yǎng)物中PCV2核酸的檢測。本標(biāo)準(zhǔn)中的試驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全Ⅱ級(jí)（BSL-2）以上的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范3縮略語下列縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。PCV2：豬圓環(huán)病毒2型（porcinecircovirustype2）HSTaq酶：熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶（HSTaqDNApolymerase）Ct值：達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)（cyclethreshold）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）實(shí)時(shí)熒光PCR：熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（realtimefluozescentquantitativepolymerasechainreaction）PBS：磷酸緩沖液（phosphatebuffersolution）4原理根據(jù)PCV2基因特定序列的保守片段，合成一對(duì)特異性引物和一條特異性探針。熒光探針的5’端標(biāo)記FAM熒光素，3’端標(biāo)記TAMRA熒光素，3’端的淬滅基團(tuán)在近距離內(nèi)能吸收5’端報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)。但在擴(kuò)增時(shí)，由于Taq酶的5’→3’的外切活性，在延伸到熒光探針時(shí)，將探針切斷，兩基團(tuán)分離，淬滅作用消失，熒光信號(hào)產(chǎn)生。因此，可通過檢測熒光信號(hào)對(duì)核酸進(jìn)行檢測。5儀器和器材5.1儀器主要儀器有分析天平、高速離心機(jī)、熒光PCR擴(kuò)增儀、-70℃冰箱、-20℃冰箱、水浴鍋、可調(diào)移液器（最大量程為2μL，20μL，200μL，1000μL）。2DB21/T2327—20145.2器材主要器材有組織勻漿器或研缽、眼科剪、眼科鑷、10mL一次性注射器、1.5mL滅菌離心管、PCR八聯(lián)排管或96孔板、吸頭（10μL，200μL，1000μL）、滅菌雙蒸水、稱量紙。6試劑和材料6.1DNAzol?Reagent：DNA抽提試劑，外觀為淡綠色，于4～8℃保存。6.2PremixExTaqTM（ProbeqPCR）：TaqMan探針法進(jìn)行RealtimePCR反應(yīng)的專用試劑，為PCRBuffer、dNTP、RNaseH和HSTaq酶的預(yù)混液，于-20℃長期保存，融化后于4～8℃保存。6.3PBS：磷酸鹽緩沖液（0.02mol/LpH7.2）。6.4無水乙醇：-20℃預(yù)冷。6.575%乙醇：用無水乙醇和滅菌雙蒸水配制，-20℃預(yù)冷。6.6陰性對(duì)照：滅菌雙蒸水。6.7陽性對(duì)照：PCV2細(xì)胞培養(yǎng)物。注：本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑，除特殊標(biāo)注外，均為分析純。7操作步驟7.1樣品的采集、前處理、存放和運(yùn)送7.1.1采樣注意事項(xiàng)采樣及樣品前處理過程中應(yīng)戴一次性手套，樣本間不得交叉污染。7.1.2采樣工具藥匙、15mL離心管和1.5mL離心管經(jīng)121(±2）℃高壓滅菌15min；剪刀、鑷子經(jīng)160℃干熱滅菌2h。7.1.3內(nèi)臟樣品的采集與前處理采取病死或剖殺豬主要臟器（淋巴結(jié)、脾臟、肺臟、腎臟和肝臟）裝入滅菌15mL離心管中，編號(hào)，送實(shí)驗(yàn)室。取100mg左右待檢樣品，按1:5倍體積加入PBS，于研缽或組織勻漿器中充分研磨，1000g離心15min，取上清液，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號(hào)備用。7.1.4血液樣品的采集與處理用無菌注射器采集血液，注入含1/104%EDTA溶液的無菌容器中，充分混勻，編號(hào)備用。7.1.5糞便的采集與前處理3DB21/T2327—2014用藥匙采取豬新鮮糞便，裝入15mL滅菌離心管中，按1：5倍體積加入PBS，混勻，1000g離心15min，取上清液，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號(hào)備用。7.1.6細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號(hào)備用。7.1.7存放與運(yùn)送采集或處理的樣品在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；若需長期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過3次）。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在6~8h之內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。按照《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進(jìn)行樣品的生物安全標(biāo)識(shí)。7.2實(shí)時(shí)熒光PCR檢測7.2.1DNA提取在核酸提取室進(jìn)行。7.2.1.1取n個(gè)滅菌的1.5mL離心管，其中n為待檢樣品數(shù)+陽性對(duì)照+陰性對(duì)照，對(duì)每個(gè)離心管進(jìn)行編號(hào)。7.2.1.2每管加入800μLDNAzol，分別加入被檢樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照各200μL，顛倒10次混勻，室溫靜置5min；4℃10000g離心10min。7.2.1.3取900μL上清，置新的1.5mL滅菌離心管中，加入500μL無水乙醇，混勻，室溫放置3min；4℃10000g離心5min。7.2.1.4棄上清，沿管壁緩緩加入1mL75%乙醇，混勻，4℃10000g離心5min。反復(fù)洗滌兩次后，將離心管倒扣于吸水紙上，自然晾干（以無乙醇味為準(zhǔn)）。7.2.1.5用20μL滅菌雙蒸水溶解沉淀，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.2擴(kuò)增體系的配制在配液區(qū)進(jìn)行。設(shè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)數(shù)為n，其中n為待檢樣品數(shù)+陽性管數(shù)+陰性管數(shù)，每個(gè)樣本檢測反應(yīng)體系配制見表1，向每個(gè)熒光PCR管或孔中分裝23μL的反應(yīng)體系。4DB21/T2327—2014表1每個(gè)樣品反應(yīng)體系配制表體系組分用量終濃度備注PremixExTaq（ProbeqPCR2×)12.5μL上游引物F0.75μL0.6μmol/L下游引物R0.75μL0.6μmol/L熒光探針溶液0.5μL0.2μmol/LROXReferenceDye（50×)0.5μL僅使用在ABI、Stratagene等滅菌雙蒸水8.5μL/8μL 總量23μL—7.2.3加樣在樣本處理區(qū)進(jìn)行。在各設(shè)定的熒光PCR管中加入7.2.1中制備的2μLDNA溶液。蓋緊管蓋，除氣泡、離心。7.2.4熒光PCR擴(kuò)增檢測在擴(kuò)增室進(jìn)行。7.2.4.1將7.2.3中離心后的PCR管放入熒光PCR擴(kuò)增儀內(nèi)，注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，記錄樣品擺放次序。7.2.4.2反應(yīng)條件設(shè)置：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)收集設(shè)置在每次循環(huán)的退火延伸時(shí)進(jìn)行。8結(jié)果判定8.1閾值設(shè)定試驗(yàn)檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值直接讀取檢測結(jié)果，Ct值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。8.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)8.2.1陰性對(duì)照無Ct值，且無典型擴(kuò)增曲線。8.2.2陽性對(duì)照Ct值應(yīng)<30.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。否則，此次試驗(yàn)視為無效。8.3結(jié)果描述及判定8.3.1陰性無Ct值并且無典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中無PCV2核酸。5DB21/T2327—20148.3.2陽性Ct值≦35.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中存在PCV2核酸。8.3.3可疑Ct值>35.0，且出現(xiàn)擴(kuò)增曲線的樣本判定為可疑?？梢蓸颖具M(jìn)行雙孔重復(fù)試驗(yàn)，若任一孔或兩孔重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Ct值≦35.0并出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線者為陽性，否則為陰性。6DB21/T2327—2014（規(guī)范性附錄）A.10.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制A.1.10.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H20）71.64g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.1.20.2