pH響應氟化嵌段聚合物的應用

引言1.1腫瘤治療概述癌癥，又稱惡性腫瘤，是由細胞惡性生長引發(fā)的疾病。由于其生長迅速、易擴散的特點，對人體的健康造成極大的威脅。癌癥對人體器官的結構和功能破壞巨大，患者死亡率較高，一直以來都是世界范圍內(nèi)醫(yī)療健康領域的難題，困擾著眾多癌癥患者及其家人。目前，手術治療、放射治療（放療）和化學治療（化療）是傳統(tǒng)治療癌癥主要方法。然而，這些治療手段早已無法滿足臨床癌癥患者的需求，因為它們一般都伴隨著較大的副作用，而治療效果又十分有限。因此，研究人員不斷探索新型的癌癥治療手段，旨在提升新方法對癌癥療效的同時，降低治療產(chǎn)生的毒副作用從而減少對患者在治療期間的生活質(zhì)量的影響REF_Ref5849\r\h[1]。近年來新興的光動力療法正是能滿足上述需求的眾多研究成果之一。光動力療法（PDT）是一種新興的癌癥治療手段，光敏劑（Ce6）被特定波長的激光照射后會引發(fā)一系列光化學反應，與環(huán)境中的氧氣共同作用，產(chǎn)生具有細胞毒性的活性氧（ROS），這種活性氧能使腫瘤細胞壞死或凋亡，同時引起機體產(chǎn)生強烈的免疫反應，從而起到治療癌癥的作用REF_Ref5882\r\h[2]。PDT相對傳統(tǒng)癌癥治療方法，僅有很小的副作用，其中一個原因是由于光敏劑被激光照射后產(chǎn)生的ROS存在時間十分短暫，擴散范圍有限，所以PDT產(chǎn)生的細胞毒性只會發(fā)生在激光照射的區(qū)域。這種治療手段相對傳統(tǒng)的化療、放療等手段，具有治療效果較好、不良反應較少，同時具有靶向性等優(yōu)點，已被廣泛運用在臨床腫瘤治療中REF_Ref5921\r\h[3]。影響PDT療效有三大要素，分別是光敏劑、光和分子氧，因此，掌握并調(diào)整光敏劑的劑量、激光的參數(shù)和腫瘤環(huán)境中的氧濃度，才能使PDT達到最佳的治療效果REF_Ref5970\r\h[4]。1.2腫瘤微環(huán)境（TME）在腫瘤的形成和發(fā)展離不開腫瘤細胞直接存在和生長的細胞環(huán)境——腫瘤微環(huán)境（TME）。TME不止含有腫瘤細胞，還有其他細胞如免疫細胞、組成血管的上皮細胞、成纖維細胞等，其中還含有各類大分子蛋白如糖蛋白、酶和一些細胞生長因子REF_Ref6026\r\h[5]。TME中各種組分互相影響，共同作用，最終形成了與身體正常細胞組織不同的環(huán)境特征，其中，缺氧、微酸和高壓是最為突出的特征REF_Ref31527\r\h[6]。大多實體腫瘤都有著缺氧的特征。由于腫瘤細胞大量消耗氧氣用于其無限的增殖，而腫瘤中的血管環(huán)境異常，導致TME中耗氧速率和供養(yǎng)速率嚴重失衡，形成缺氧的特點。缺氧的環(huán)境又有利于腫瘤細胞的生存、繁殖和轉移，同時降低免疫系統(tǒng)的能力，加大了癌癥的治愈難度REF_Ref6058\r\h[7]。同時，PDT是耗氧過程，需要大量氧氣參與治療，加快了腫瘤部位對氧氣的消耗，加重了TME中缺氧的程度，而這反過來又抑制了PDT的治療效果。微酸性是腫瘤組織的又一特征。腫瘤細胞相較正常細胞有其獨特的代謝方式，在其生長發(fā)育過程中產(chǎn)生大量乳酸、過量的質(zhì)子及二氧化碳，而這些代謝廢物又無法及時通過腫瘤中異常的血管排出，導致酸性代謝物集中在腫瘤組織部位，使TME持續(xù)處于酸性，與人體正常組織弱堿性環(huán)境有所區(qū)別REF_Ref6091\r\h[8]。酸性環(huán)境對于多數(shù)細胞來說都是有害的，但是對于腫瘤細胞來說，酸性環(huán)境能夠誘發(fā)細胞突變，加速腫瘤細胞的形成和擴散，組成酸性環(huán)境的成分之一乳酸的產(chǎn)生又能抑制身體的免疫應答；而與之相反的，酸性環(huán)境在某些方面又可能抑制腫瘤細胞增殖REF_Ref14019\r\h[9]。總而言之，酸性環(huán)境對腫瘤細胞的生長和增殖的影響是復雜多樣的。而研究人員可以利用腫瘤的酸性環(huán)境，設計響應微環(huán)境的靶向藥物，減少藥物在人體其他部位的釋放，降低副作用REF_Ref8460\r\h[10]。1.3聚合物在癌癥治療方面的應用聚合物納米材料已被應用到癌癥治療中。納米材料在PDT中起到重要的作用，可作為光敏劑的載體，其自組裝的疏水內(nèi)核能有效地將光敏劑等藥物包裹在內(nèi)，防止藥物在治療過程中分解和失活，從而提高光敏劑的穩(wěn)定性REF_Ref8505\r\h[11]。聚合物自組裝的疏水內(nèi)核中可搭載氧，通過血管運輸至腫瘤部位釋放REF_Ref8545\r\h[12]。含氟化合物較好的攜氧能力REF_Ref8594\r\h[13]，將氟嵌段引入聚合物，形成含氟嵌段聚合物。利用氟對氧氣的高溶解性和聚合物自主裝疏水內(nèi)核本身對氧氣的負載，使得這種聚合物能裝載大量氧氣，能有效緩解腫瘤部位的缺氧微環(huán)境，增強PDT療效REF_Ref8623\r\h[14]。同時，聚合物可針對腫瘤的酸性微環(huán)境作出響應，如一些納米材料在不同pH環(huán)境中表現(xiàn)出不同的理化性質(zhì)，如較低pH環(huán)境中納米材料穩(wěn)定性降低、粒徑增大，使其中負載的藥物可以針對腫瘤酸性微環(huán)境實現(xiàn)的可控釋放，提高治療的效果，降低副作用REF_Ref8649\r\h[15]。綜上所述，針對腫瘤的缺氧、酸性微環(huán)境，可以設計一種pH響應的含氟聚合物納米顆粒載體，對腫瘤組織微酸環(huán)境進行識別，并實現(xiàn)pH響應的氧氣或藥物釋放，降低藥物副作用。而聚合物中的氟嵌段能使得聚合物擁有更好的載氧性能，負載更多氧氣并響應釋放，以緩解TME中的缺氧問題，提高PDT或其他腫瘤治療方法的療效。1.4文章選題思路及研究方向相比傳統(tǒng)的癌癥治療方法，新興的PDT由于其具有非侵入性、局部性等特點，滿足了癌癥患者一些需求。但是，PDT在實際應用中的效果依然不盡人意，如腫瘤缺氧微環(huán)境會降低PDT的療效。因此，如何提高PDT的療效，如何避免因缺氧而降低PDT療效，如何降低藥物對人體的毒副作用，需要我們在研究中不斷地探索和創(chuàng)新。pH響應納米材料在腫瘤治療中具有控制釋放和增強藥物穩(wěn)定性等優(yōu)點REF_Ref8675\r\h[16]。氟化兩親性嵌段聚合物能夠在一定條件下形成具有自組裝的疏水內(nèi)核的納米顆粒，具有較高的載藥和載氧能力，有望在藥物的裝載運輸和定點釋放領域得到廣泛的運用。本研究通過對含氟嵌段聚合物PDP的載氧及釋放能力、活性氧ROS生成量以及光動力毒性等方面的研究，對PDP在治療腫瘤乏氧領域的應用進行探索，發(fā)現(xiàn)其具有較好的pH響應及光動力治療活性。2實驗原理圖1為本次研究的實驗原理示意圖。利用PDP兩親性自組裝形成了疏水內(nèi)核結構，由于其內(nèi)部含有氟化鏈，能將Ce6裝載到PDP的疏水核心中。同時，由于PEOFA嵌段內(nèi)含有氟，能夠大量地負載氧氣，釋放至腫瘤部位的微環(huán)境中，緩解其缺氧的問題。在對體外腫瘤細胞的實驗中，利用特定波長的激光照射腫瘤細胞，內(nèi)部裝載的Ce6產(chǎn)生并釋放活性氧（ROS），誘導腫瘤細胞死亡。pH響應氟化嵌段聚合物（PDP）具有明確的結構組成和較高的穩(wěn)定性，考察該材料體外的抗腫瘤活性，以研究其在增強腫瘤PDT療效方面的應用。圖1實驗原理圖3實驗內(nèi)容與方法3.1實驗相關試劑主要試劑有DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素、鏈霉素、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶、Hoechst33342染色液、DCFH-DA探針、pH響應氟化嵌段聚合物PDP（分子式如圖2）、二甲基亞砜（DMSO）、單線態(tài)氧熒光探針（SOSG）等。圖2pH響應氟化嵌段聚合物PDP3.2實驗相關儀器主要儀器有激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)、熒光分光光度計、YSI550A便攜式溶解氧儀、倒置顯微鏡等。3.3實驗細胞與材料實驗使用的細胞是人乳腺癌細胞（MCF-7）。MCF-7細胞培養(yǎng)在濕度飽和，CO2含量為5%的37℃恒溫培養(yǎng)箱，使用培養(yǎng)基為加入了少量青霉素、鏈霉素和10%體積胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。使用的材料為一種含氟嵌段的pH響應聚合物PDP，并將其裝載了Ce6構成載藥的納米粒子，研究了其在抗腫瘤活性方面的部分應用。3.4細胞的培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)過程主要包括更換培養(yǎng)液和細胞傳代。進入細胞培養(yǎng)室前需嚴格按照規(guī)范用洗手液洗手、戴手套、換上實驗室專用拖鞋并使用75%酒精對雙手消毒，從細胞培養(yǎng)箱中小心取出培養(yǎng)瓶，通過實驗室內(nèi)的顯微鏡，觀察細胞生長狀況和數(shù)量，以決定進行換液或傳代操作。在進行細胞換液或傳代前，為確保無菌環(huán)境，需對超凈臺進行30min紫外線照射殺菌消毒。在超凈臺中央點燃酒精燈，方便后續(xù)實驗對培養(yǎng)瓶口消毒，使用酒精棉球擦拭超凈臺。在細胞培養(yǎng)瓶瓶口部分噴少量75%酒精消毒后放入超凈臺，使培養(yǎng)瓶直立瓶口向上且盡量靠近酒精燈火焰，避免其被細菌污染。在需要進行實驗操作時，再將培養(yǎng)瓶瓶口靠近酒精燈火焰殺菌，輕輕擰開瓶蓋并按順序擺放。打開培養(yǎng)瓶后，棄去將瓶中的培養(yǎng)液，再用1mL的PBS溶液清洗細胞2至3次，以去除殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。若需進行換液操作，則只需加入3mL的DMEM，倒放并輕搖培養(yǎng)瓶使培養(yǎng)液覆蓋細胞層，再將培養(yǎng)瓶放回恒溫培養(yǎng)箱。若需進行傳代操作，則需加入1mL胰蛋白酶后蓋緊瓶蓋，使其覆蓋整個細胞層，放入恒溫箱消化，根據(jù)胰蛋白酶的濃度不同，消化時間一般在3到5分鐘之內(nèi)。在顯微鏡下觀察到大部分細胞呈現(xiàn)亮圓點時說明消化完成。用75%酒精消毒瓶口后放回超凈臺，倒出胰蛋白酶溶液，加入3mL的DMEM，用移液槍吹洗細胞表面，使細胞均勻分散至培養(yǎng)液中形成細胞懸液。最后按需求棄去1.5至2mL懸液，向培養(yǎng)瓶中加入DMEM至3mL，使其覆蓋整個細胞層后放回恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3.5PDP的載藥與pH響應釋放能力稱取500μgPDP，和過量Ce6固體先溶解于100μLDMSO中。待固體完全溶解在DMSO中后，滴入5mL蒸餾水中。為使溶液分散均勻，將溶液超聲15min。將MWCO=3500Da透析袋裁剪至合適大小，浸入無水乙醇中以90℃隔水加熱半小時。將超聲后的溶液轉移至處理后的透析袋中，使用4L生理鹽水中對溶液透析24h，以除去溶液中過量是游離Ce6，得到較純凈的PDP@Ce6納米顆粒。為了測評PDP在體外模擬腫瘤微酸環(huán)境中的藥物釋放能力，將上述制備的PDP@Ce6溶液稀釋至200μg/mL，取等量溶液分別加入兩個透析袋。分別在兩個5L燒杯中盛取新的4L生理鹽水，向一個燒杯中并加入HCl，調(diào)整其pH至5，測得另一個燒杯中pH為7.4，將透析袋分別放入其中透析。間隔一定時間進行取樣，用紫外-可見光譜法測量生理鹽水中吸光度的變化，根據(jù)實驗所得數(shù)據(jù)分析PDP在pH為5的酸性生理鹽水環(huán)境下的釋藥速率，并與其在中性生理鹽水中的釋藥速率進行對比。3.6PDP的載氧與釋放能力PDP有較好的攜氧能力，是因為材料中具有含氟嵌段。為避免YSI550A便攜式溶解氧儀測得的數(shù)據(jù)被溶液中的預溶解氧影響，預先向10mL蒸餾水中通入足量氮氣。再向已去除溶解氧的蒸餾水加入10mgPDP，同時，取等量等濃度的無氧PBS溶液和蒸餾水以形成對照，用橡膠塞塞緊瓶口。向容器中通入過量氧氣使溶液中氧氣含量達到飽和。停止通入氧氣后，依次向溶液中插入溶氧儀氧探針，測定30min內(nèi)各液體中的氧含量的變化。3.7PDP@Ce6體外活性氧生成能力利用SOSG熒光探針檢測PDP@Ce6納米顆粒在溶液中生成單線態(tài)活性氧的能力。將制得的取PDP@Ce6納米顆粒稀釋至1mg/mL，取3mL溶液置于石英比色皿中，在另一個比色皿中加入3mL等濃度的游離Ce6溶液。向比色皿中分別加入50μM熒光探針，使兩個比色皿在相同條件下用激光照射10min，激光波長為660nm，激光強度為0.5W/cm2。最后使用熒光分光光度計在525nm處測量熒光強度。3.8PDP@Ce6細胞內(nèi)ROS檢測使用激光共聚焦顯微鏡測評細胞內(nèi)ROS生成情況。在三個玻底培養(yǎng)皿中培養(yǎng)MCF-7細胞12h以上，確保細胞生長情況接近且正常。向兩個培養(yǎng)皿中分別加入1.5mL稀釋至4μg/mL的PDP@Ce6溶液，再將細胞放回原培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。然后，用無氧PBS洗滌細胞以去除PDP@Ce6和雜質(zhì)。再向三個培養(yǎng)皿分別中加入1.5mLDCFH-DA探針，放回原培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，使探針與細胞充分結合。用無氧PBS洗滌各皿中細胞2次以徹底除去雜質(zhì)。取一個加入了PDP@Ce6的培養(yǎng)皿置于激光照射環(huán)境下10min，激光波長為660nm，激光強度為0.5W/cm2，其他培養(yǎng)皿繼續(xù)在黑暗中培養(yǎng)。在觀察細胞中圖像前，用PBS洗滌細胞3次以去除雜質(zhì)，最后再加入1mLPBS使細胞保持濕潤狀態(tài)。使用激光共聚焦顯微鏡捕捉各皿細胞的熒光圖像。3.9PDP@Ce6細胞內(nèi)光動力毒性測試采用MTT法測試納米顆粒對細胞的毒性和對PDT的增強效果。分別制備25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL的PDP和PDP@Ce6納米顆粒溶液，搖勻備用。將等量細胞分別置于3個96孔板中，盡量保證各孔細胞濃度一致。向其中一板的各列中依次加入100μL不同濃度的PDP溶液，盡量保證同列的各孔中溶液體積相等。向另外兩板中以相同的方法加入PDP@Ce6溶液。將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h以上，使細胞與納米顆粒充分結合。將兩個加入了PDP@Ce6溶液的細胞分別置于激光照射下和黑暗環(huán)境下，形成激光組與非激光組。激光組細胞置于激光照射下10min，非激光組置于其他條件相同的黑暗環(huán)境下。處理后將細胞放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)20h。向各組細胞中加入10μL濃度為5mg/mL的MTT溶液后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。倒出上清液，此時細胞已基本貼壁。向每孔加入150μL的DMSO溶液，用酶標記測定細胞在570nm處的吸光度，并據(jù)此計算細胞存活率。4結果與討論4.1PDP載藥后pH響應釋放能力評價將裝載了Ce6的PDP@Ce6溶液置于不同pH值的環(huán)境中以測試材料在不同pH下的藥物釋放能力。將PDP@Ce6溶液分別置于模擬腫瘤內(nèi)微酸環(huán)境（pH=5）的生理鹽水和模擬人體正常細胞環(huán)境（pH=7.4）的生理鹽水中，利用紫外-可見光譜法測量材料在不同時間間隔內(nèi)吸光度的變化，并繪制PDP@Ce6藥物釋放曲線，得到實驗結果如圖3，根據(jù)圖3中特征峰的降低量作出圖4。由圖4可知，在pH=5的酸性環(huán)境下，24h后藥物釋放率已達到80%以上，與之相比同一時間間隔內(nèi)，pH=7.4環(huán)境中藥物釋放率低于20%。實驗結果表明材料在酸性環(huán)境下有較高的藥物釋放速率，說明材料具有一定的pH響應釋放能力。圖3透析后PDP@Ce6在不同pH溶液中吸光度變化，（A）溶液pH=5，（B）,溶液pH=7.4圖4透析后PDP@Ce6在pH=5和pH=7.4溶液中藥物釋放速率4.2PDP載氧能力評價氟化聚合物可以通過氧與氟之間的范德華相互作用溶解氧。為評價材料對氧氣的裝載能力，先通入氮氣除去蒸餾水中預溶解的氧氣，再加入PDP，向溶液中通入過量氧氣使PDP充分裝載氧氣，最后使用便攜式溶解氧儀測定溶液中氧濃度的變化，檢測后得到的結果如圖5。分析圖像可以看出，在相同的實驗條件下，PDP溶液在停止通入氧氣600s后的含氧量仍有21mg/mL，相比之下，PBS溶液和水中的含氧量在600s后均低于16mg/mL，可以對比得出PDP有著較高的載氧量。由于溶液中的氧氣不斷擴散至外界環(huán)境的同時溶氧儀電極對氧氣進行消耗，溶液中的氧氣含量逐漸降低，但是PDP溶液中含氧量隨時間降低的幅度較為平緩，顯示出較好的穩(wěn)定性。由此可知，PDP納米顆?？梢栽陂L時間儲存較多氧氣，在PDT中可作為可靠的氧氣載體，改善TME的缺氧環(huán)境。圖5停止通入氧氣600s后PDP溶液、H2O、PBS中氧含量對比4.3PDP的體外活性氧生成能力評價氧氣濃度的升高可以促進ROS的生成，ROS含量的升高可以加劇對細胞的損傷程度REF_Ref8731\r\h[17]。通過熒光強度檢測活性氧的生成，分析熒光強度的強弱可以評價溶液中物質(zhì)活性氧的生成能力，這是由于當SOSG活性氧熒光探針被氧化時，熒光強度會相應增強。如圖6所示，PDP納米顆粒被激光照射后，熒光強度明顯比游離的Ce6溶液強，而PBS溶液的熒光強度相對較低。由實驗數(shù)據(jù)分析可知，PDP納米顆粒溶液中產(chǎn)生了較多ROS，這是由于PDP溶解氧的能力較好，被激光照射后能有效地促進ROS的生成。因此，PDP納米顆粒的體外活性氧生成能力較好。圖6使用SOSG活性氧熒光探針測得的PDP、Ce6和H2O的熒光強度對比4.4PDP的細胞內(nèi)活性氧生成能力評價以DCFH-DA作為ROS生成指示劑，使用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）檢測MCF-7細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的情況。探針被ROS氧化后，轉化為DCF，在顯微鏡下能觀察到亮綠色熒光，生成的圖像如圖7。圖7中第一列圖像由上至下分別為加入PBS后細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS氧化SOSG探針發(fā)出的綠色熒光，細胞的細胞核被Hoechst33342染料染色后呈現(xiàn)的藍色熒光，和疊加兩種熒光圖像后得到的熒光圖像。第二列是加入PDP@Ce6后細胞一系列的熒光圖像，第三列是加入PDP@Ce6后再經(jīng)過激光照射的細胞熒光圖像。由圖像可知，經(jīng)PBS處理的細胞或未經(jīng)激光照射的PDP@Ce6納米顆粒處理的細胞只發(fā)出微弱的藍色熒光，說明此兩組細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS較少。而經(jīng)PDP@Ce6處理的同時進行激光照射的細胞在顯微鏡下可以觀察到明顯的亮綠色熒光，說明細胞內(nèi)產(chǎn)生了大量ROS。圖7細胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧CLSM圖像利用激光共聚焦顯微鏡進一步定量分析了熒光強度如圖8，結果與直接觀察到的熒光強度基本吻合，進一步驗證了觀察得到的實驗結果。由定量分析結果可知，PDP@Ce6+L組的熒光強度高達143，明顯高于PBS組和未經(jīng)激光照射的實驗組。說明納米顆粒在光照條件下具有較好的ROS生成能力。圖8定量分析各組熒光強度4.5PDP體外光動力效果評價通過MTT法檢測了不同濃度的PDP和PDP@Ce6（激光組和非激光組）對細胞的毒性。對于單獨PDP載體如圖9，當載體濃度達到600μg/mL時，細胞的存活率依然保持在70%以上，即單獨的PDP載體對細胞的傷害較小。圖9不同濃度PDP下細胞存活率相比之下，圖10中向體系內(nèi)加入PDP@Ce6顆粒并經(jīng)激光照射，細胞存活率下降幅度較大，在PDP@Ce6濃度僅為10μg/mL時，細胞存活率下降至50%左右。這是因為光照條件下PDP有效載氧并產(chǎn)生大量ROS，最終導致了細胞死亡。同時，非激光組的細胞存活率始終保持在80%以上，即無激光照射下，PDP@Ce6沒有表現(xiàn)出明顯的細胞毒性。二者對比可以發(fā)現(xiàn)在PDP@Ce6濃度高于2.5μg/mL時，激光照射組的細胞存活率出現(xiàn)顯著的降低趨勢，表現(xiàn)出明顯的細胞毒性。圖10PDP@Ce6在光照條件和非光照條件下培養(yǎng)的細胞存活率綜上所述，單獨的PDP和PDP@Ce6納米材料對細胞沒有較大的毒性，當有激光照射時，PDP@Ce6才會將負載氧轉變?yōu)镽OS，對腫瘤細胞造成損傷。5結論本次研究成功探究了PDP在抗腫瘤活性方面的應用。研究的聚合物PDP具有較高的載氧能力，聚合物形成的自組裝的疏水內(nèi)核能有效負載氧，在腫瘤部位釋放氧氣，從而緩解TME中的缺氧問題。PDP負載的藥物能夠在酸性條件下響應釋放，具備一定的pH響應性。經(jīng)體外實驗可以看出，PDP裝載Ce6后，可在激光照射下產(chǎn)生大量ROS，從而損傷腫瘤細胞，增強PDT的腫瘤治療效果。本項實驗展示了pH響應的氟化嵌段聚合物PDP在抗腫瘤活性方面的部分應用，氟化嵌段聚合物在增強PDT方面具有一定的可行性。嵌段聚合物納米材料在抗腫瘤方面的應用在未來有著十分廣闊的前景，值得研究者繼續(xù)深入地探究。

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