微生物檢測-第四章菌落總數(shù)的測定課件

衛(wèi)生細菌學(xué)檢驗第四章菌落總數(shù)的測定第一節(jié)菌落總數(shù)(Totalcolonycount)的

概念和測定意義一、概念

1.菌落總數(shù)是指樣品經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1mL或1g檢樣中所含的細菌菌落總數(shù)。結(jié)果常用CFU(colonyformingunits,CFU)來表示。有時被稱為雜菌數(shù)或需氧菌數(shù)菌落總數(shù)的多少直接反映著食品、藥品和水的衛(wèi)生質(zhì)量。如果食品中的菌落總數(shù)多于10萬，就足以引起細菌性食物中毒；如果人的感官能察覺食品發(fā)生變質(zhì)時，細菌數(shù)已達到106-107CFU/g（mL或cm2）。2.細菌總數(shù)指一定數(shù)量或面積的食物樣品，經(jīng)過適當(dāng)處理后，在顯微鏡下對細菌進行直接計數(shù)。通常以1mL或1g檢樣中的細菌總數(shù)來表示。包括活菌、死菌。也稱細菌直接顯微鏡數(shù)。二、測定意義主要是作為判定樣品被污染程度的標志；觀察細菌在食品中的繁殖動態(tài)，為被檢樣品的衛(wèi)生學(xué)評價提供依據(jù)；了解生產(chǎn)中，從原料加工到成品包裝過程中，受外界污染的情況，反映樣品的衛(wèi)生質(zhì)量；預(yù)測食品的存放期限。三、注意事項器具干凈，滅菌樣品具有代表性稀釋液要有空白對照蛋白胨水最合適，含鹽量高時，用水最合適培養(yǎng)基的溫度梯度稀釋要換管，每管充分振搖培養(yǎng)基的瓊脂1.5%混合檢樣時向兩個方向旋轉(zhuǎn)稀釋倍數(shù)越高，檢樣數(shù)越少出現(xiàn)鏈狀菌落時以一個菌落記，片狀菌落不宜采用無菌操作計數(shù)準確所有平皿菌落密布時，在稀釋度最大的平皿上，任意數(shù)2cm2,除以2，乘以63.6cm2，再乘以稀釋倍數(shù)對于發(fā)酵制品，校正pH7.6檢樣作幾個適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液選擇三個適宜稀釋度各以1mL的量加入滅菌平皿內(nèi)每平皿內(nèi)加入15mL培養(yǎng)基36℃左右培養(yǎng)24-48小時菌落計數(shù)報告第二節(jié)國標法測定1.步驟2.稀釋度的選擇及菌落報告方式稀釋度及菌落數(shù)稀釋液之比菌落總數(shù)CFU/g(mL)報告方式CFU/g(mL)10-110-210-31多不可計16420-164001.6×1042多不可計295461.6377503.8×1043多不可計271602.2271002.7×1044多不可計多不可計313-313003.1×1045000-<10<10627115-2702.7×1027多不可計30512-305003.1×104（1）菌落數(shù)在30-300之間，取平均菌落總數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)；（2）兩個稀釋度在30-300之間，則視二者比例來決定；大于2取較小數(shù)字，小于2取平均數(shù)；（3）全大于300，則按最高稀釋倍數(shù)的平均菌落數(shù)；（4）全小于30，按最低稀釋倍數(shù)的平均菌落數(shù)；（5）無菌落數(shù)生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)來報告；（6）若所有菌落數(shù)都不在30-300之間，則取最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；（7）菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按實有數(shù)報告；大于100時，用二位有效數(shù)字報告，二位有效數(shù)字后面的數(shù)字，以四舍五入方法計算。以科學(xué)計數(shù)法報告。3.水樣的測定（1）標準:飲用水:大腸菌群數(shù)不超過3CFU/L,每100mL不得檢出;菌落總數(shù)≤100CFU/

mL。甲第鞭毛蟲、隱孢子蟲<1個/10L。

游泳池水:大腸菌群數(shù)≤100CFU/100mL；菌落總數(shù)≤1000CFU

/mL。（2）水樣的采集與制備采樣器在采樣前必須洗刷干凈，進行高溫高壓滅菌。取自來水時，先用清潔布將水龍頭拭干，再灼燒，之后放水5min—10min后，再采集水樣。經(jīng)氯處理的水，加入硫代硫酸鈉來脫氯。采樣后2h內(nèi)送檢。運送時避免搖動，避免水溢出后又回至瓶中。檢驗時應(yīng)將水樣搖勻。（3）測定程序、稀釋度選擇和報告方式：同前第三節(jié)其它測定方法1.疏水柵格濾膜法或等格法（isogridmethod）初濾5μm,再經(jīng)0.45μm2.試管稀釋法梯度稀釋后，定量接種稀釋液，培養(yǎng)后按生長管數(shù)判斷含菌量。MPN法（mostprobablenumber,MPN）適用于不完全溶解的藥物。設(shè)陰性對照。觀察陽性管數(shù)。美國藥典MPN法：三級三管制，10mL樣品加在90mL緩沖液中，進一步稀釋，每級接種3支。陽性管數(shù)MPNCFU/100mL(g)95%可信限1mL(g)×30.1mL(g)×30.01mL(g)×3下限上限22222222012321028035042040100470150033330000012323039064095040701501200130038003333333301232400460011000≥240003607101500130002400048000美國藥典MPN法測菌落總數(shù)，三級三管制3.旋轉(zhuǎn)平皿計數(shù)方法檢樣被螺旋平板注入器連續(xù)不斷地注入到旋轉(zhuǎn)著的瓊脂平板的表面，形成阿基米德螺旋型軌跡。4.ATP熒光測定法ATP熒光法細菌總數(shù)快速檢測系統(tǒng)，簡稱“BL細菌快檢儀”，由試劑組、微量熒光檢測儀、樣品預(yù)處理耗材三部件組成。1-5分鐘即能提供實時檢測數(shù)據(jù)，準確、便攜、操作容易。

螢火蟲會發(fā)光是由于它能合成將化學(xué)物質(zhì)的化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽艿纳锎呋瘎灮鹣x熒光素酶（簡稱蟲光素酶，luciferase）、蟲熒光素(D-luciferin)、以及ATP。在有氧的條件下，蟲光素酶催化蟲熒光素和ATP之間發(fā)生氧化反應(yīng)形成氧化熒光素并發(fā)出熒光。

當(dāng)蟲光素酶和蟲熒光素過量時，熒光的強弱取決于ATP的數(shù)量。因此，細菌越多，ATP量越高，熒光越強。熒光強弱可以通過熒光儀計量。通過相對熒光值和細菌細胞數(shù)的關(guān)系曲線，就能快速確定樣品中細菌的細胞數(shù)。便攜式食品微生物快速檢測儀

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第四節(jié)其它菌落總數(shù)的測定方法1.嗜冷菌計數(shù)：引起新鮮魚貝類食品變質(zhì)用無菌吸管吸取冷檢樣液0.1或1mL于表面已十分干燥的胰蛋白胨—大豆瓊脂

或CVT（內(nèi)含結(jié)晶紫或TTC）瓊脂平板上，涂布均勻，將平皿倒置于（7℃左右）環(huán)境中培養(yǎng)10天，計數(shù)。CVT計數(shù)紅色菌落。150-180元2.嗜熱菌計數(shù)：引起罐裝食品變質(zhì)。將檢樣25g加入225mL無菌水的三角瓶中，溶液或懸浮液迅速煮沸5min，將燒瓶浸于冷水內(nèi)冷卻。平酸菌：在5個無菌培養(yǎng)皿中各注入2mL樣品，用葡萄糖-胰胨瓊脂傾注平板，凝固后，50-55℃培養(yǎng)48-72h，計數(shù)。平酸菌在葡萄糖-胰胨瓊脂上菌落圓形，直徑2-5mm，具有不透明的中心及黃暈，暈很狹。產(chǎn)酸弱的菌，其菌落周圍不存在或不易觀察到黃暈。從培養(yǎng)箱內(nèi)拿出后應(yīng)立即計數(shù)，否則黃暈很快消褪。不產(chǎn)硫化氫的嗜熱厭氧菌（TA菌）：將檢樣液體加入等量的新制備的去氧肝湯（20mL）中，以無菌的2%瓊脂封頂，55℃培養(yǎng)72h，當(dāng)有氣體生成（瓊脂塞破裂，氣味似干酪）時，則有嗜熱厭氧菌。產(chǎn)硫化氫的嗜熱厭氧菌：將檢樣液體加入等量的已熔化的硫酸亞鐵瓊脂中（20mL）中，一式六份。在冷水中使培養(yǎng)基固化，在55℃培養(yǎng)48h，形成特征性的黑小片。某些嗜熱菌不生成硫化氫，但生成還原性氫，使全部培養(yǎng)基變黑。3.厭氧培養(yǎng)菌計數(shù)：將檢樣液體稀釋液1mL，注入已溶化并涼至45-50℃的硫乙醇酸鈉瓊脂管內(nèi)，傾注平板。冷凝后，在其上層疊一層3%無菌瓊脂，37℃96h，計數(shù)。4.革蘭氏陰性菌計數(shù)：先傾注平板，凝固后在37℃烘去表面水分，吸檢樣液體0.1mL于平板上，一式兩份。涂布均勻，再層疊45-50℃的VRB瓊脂3－4mL。30℃48h,計數(shù)。5.乳酸菌、乳鏈球菌、雙歧桿菌酸奶及保健制品，評