DB45T 1682-2018 水牛胚胎質(zhì)量檢測技術(shù)規(guī)程

廣西壯族自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I前言 II 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14抽樣和胚胎保存 15檢測環(huán)境 26檢測方法 27評定結(jié)果 3附錄A(規(guī)范性附錄)試劑、耗材和設(shè)備 4附錄B(規(guī)范性附錄)冷凍胚胎解凍方法 6附錄C(規(guī)范性附錄)胚胎圖片示例 7本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由廣西畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：廣西壯族自治區(qū)水牛研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：鄭海英、尚江華、楊春艷、黃加祥、鄭威、梁賢威、鄢勝飛、李孟琪、于農(nóng)淇、張秀芳、黃芬香。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T18088出入境動(dòng)物檢疫采樣3術(shù)語和定義經(jīng)特殊方法處理的胚胎放置在-196℃的超低溫度中，使其新陳代謝暫時(shí)停止，從而將胚胎進(jìn)行長4抽樣和胚胎保存24.2胚胎保存間不能超過10s。胚胎保存期間，要定期檢查容器中液氮消耗情況，適時(shí)補(bǔ)充液氮，確保保存胚胎的細(xì)4.3信息記錄5檢測環(huán)境6檢測方法6.1系譜資料6.2標(biāo)識6.4.1胚胎的形態(tài)學(xué)檢測將胚胎置于38℃~39℃、5%CO?和100%最大飽和濕度的環(huán)境下培養(yǎng)，并于開始培養(yǎng)后24h和48h受精后第4d~5d的胚胎，能觀察到球狀的細(xì)胞團(tuán)，分裂球間隙不明顯，占據(jù)透明帶內(nèi)腔的50%~3受精后第5d~6d的胚胎，細(xì)胞團(tuán)變小，卵裂球之間界限難以分辨，細(xì)胞團(tuán)與透明帶之間空隙明顯增大，占透明帶內(nèi)腔的60%～70%。6.5.1.3早期囊胚受精后第6d~7d的胚胎，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的一部分出現(xiàn)囊胚腔，但難以分清內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層，細(xì)胞團(tuán)占透明帶內(nèi)腔的70%～80%。6.5.1.5擴(kuò)張囊胚受精后第7d~9d的胚胎，體積增至原來的1.2~1.5倍，與透明帶之間無空隙，囊胚腔明顯擴(kuò)大，6.5.1.6孵化囊胚度適中，不規(guī)則的細(xì)胞相對較少，變性細(xì)胞比例少于10%;——B級：胚胎的發(fā)育階段與預(yù)期的發(fā)育階段一定數(shù)量細(xì)胞的顏色明暗不一、密度不均勻，變性細(xì)胞比例為10%～20%;結(jié)構(gòu)較松散，游離的細(xì)胞較多，變性細(xì)胞比例為20%～40%;16-細(xì)胞胚胎以下的受精卵。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)有較多碎片、輪廓不清晰、結(jié)構(gòu)松散，變性細(xì)胞比例高于40%,為不可用胚胎。6.6評定要求每次評定應(yīng)安排2名經(jīng)胚胎生物技術(shù)培訓(xùn)的技術(shù)人員進(jìn)行檢測，獨(dú)立評定，得出綜合評定結(jié)果。若一次評定結(jié)果未能達(dá)成一致，則另安排技術(shù)人員2名進(jìn)行二次評定，并綜合××胚胎的發(fā)育階段為××;級別為××;在38℃~39℃、5%CO?和100%最大飽和濕度的CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h(或48h),胚胎由××階段發(fā)育4緩沖鹽溶液)、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)。A.2.4移液器(2μL,20μL,200μL,1000μL)。A.2.5移液器盒(2μL,20μL,200μL,1000μL)。5A.3主要設(shè)備A.3.1體視顯微鏡(20×)。A.3.2CO?培養(yǎng)箱(38℃~39℃、5%CO?和100%最大飽和濕度)。A.3.3冰箱或冰柜(-20℃~4℃)。A.3.4高壓滅菌器。A.3.5超凈工作臺。A.3.6恒溫?zé)崤_(39℃)。A.3.7低溫冰箱(-80℃)。A.3.8電子分析天平(感量0.01mg)。A.3.9移液器(2μL,20μL,200μL,1000μL)。A.3.10超聲波清洗儀。A.3.12雙重蒸餾器。A.3.13超純水儀。A.3.14液氮生物容器。A.3.15酒精燈。6B.1甘油冷凍胚胎的解凍分別配制含6%、3%和0%甘油的0.1mol/L蔗糖PBS胚胎解凍液，用0.22μm濾器過濾。B.1.2胚胎解凍從液氮罐中取出裝有胚胎的細(xì)管，室溫下空氣浴10s后置于35℃~37℃水浴中，浸浴至胚胎冷凍用75%酒精消毒衛(wèi)生棉球擦干細(xì)管，剪去封口端，將胚胎推入培養(yǎng)皿中；將胚胎依次移入含6%、3%和0%甘油的0.1mol/L蔗糖胚胎PBS解凍液中，各停留5min;最后用胚胎體外培養(yǎng)液清洗3次，即可B.2乙二醇冷凍胚胎解凍將胚胎細(xì)管空氣浴10s后置于35℃~37℃水浴中，浸浴至胚胎冷凍細(xì)管內(nèi)液體徹底融化，用經(jīng)滅7(規(guī)范性附錄)胚胎圖片示例C.1桑椹胚胚胎質(zhì)量示例見圖C.1。