基因工程課件

第八章基因工程(jīyīngōngchéng)

（GENETICENGINEERING）1共一百六十六頁本章，我們討論4個問題：1.什么是基因工程——基因工程的概念(gàiniàn)。2.為什么能進行基因工程——基因工程的原理和技術。（包括3大理論和3大技術準備）3.怎樣進行基因工程——3大步驟（DNA體外重組，重組DNA導入宿主細胞后擴增和表達，基因工程后處理）4.基因工程的應用和前景——對于醫(yī)學來說即生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品、開展基因治療等。2共一百六十六頁第一節(jié)概述一.現(xiàn)代科學技術發(fā)展的3個特點：

（一）科學技術加速發(fā)展和急劇變革：1.當代科學發(fā)展成指數(shù)增長趨勢，全世界發(fā)表科技論文6000－8000/天，平均1篇/10.8秒問世。2.人類科技知識在19世紀半衰期是50年，現(xiàn)在是3－5年（終身教育學習）。

3.1973年，CohenGroup第一次實現(xiàn)了細菌遺傳性狀的轉移terr+nersr→terrner，導致基因工程(jīyīngōngchéng)技術誕生，至今不到30年，人類已經(jīng)擁有了克隆羊、豬等等的技術，可以復制一個生命體。（克隆羊多利1997－2003，體細胞克隆，胚胎細胞克隆）3共一百六十六頁PscloltetrRb-3nersrtetrnertetr

nerOtetrne圖8-1CohenGroup第一次實現(xiàn)了細菌(xìjūn)遺傳性狀轉移示意圖4共一百六十六頁(二)科學技術發(fā)展的綜合化

1.19世紀中葉，以科學技術是分離的，它們各有獨自文化傳統(tǒng)，它們的發(fā)展往往是脫節(jié)的。2.科學回答“是什么”“為什么”，技術回答“做什么”“怎么做”。當今科技發(fā)展已經(jīng)密不可分，科學里包含技術，技術里體現(xiàn)科學。3.當代科技發(fā)展有兩種形式：一是突破，二是融合。突破是線性的，即從研究開發(fā)新一代的科技成果取代(qǔdài)原有一代科技成果。融合是非線性的，即混合原有不同的科技領域，進而發(fā)展新產(chǎn)品，造成革命性市場，它們是互補和合作的結果?；蚬こ碳仁强茖W又是技術，既是突破，又是融合。她造成革命性市場（美國基因工程產(chǎn)品300億美元/年，乙肝疫苗50美元/人）；她是分子遺傳學，生物化學，細胞學，細胞生物學，分子生物學相互滲透，交叉融合、突破的結果。5共一百六十六頁(三)科技發(fā)展必需和人文社會科學發(fā)展相結合：

1.當代各種全球性問題出現(xiàn)，從一定意義上來說是由于科學技術廣泛應用于社會而引發(fā)的，如TMD、NMD(布什對薩達姆)2.科學技術是第一生產(chǎn)力，而文化水平是人類把握科學技術的一個尺度。3.科學技術是一把雙刃劍，原子核技術可以給人類帶來光明，原子彈卻可以把長崎、廣島夷為平地；克隆技術，基因工程技術可以挽救瀕臨滅絕的動物（國寶熊貓），也可以動搖人類以性愛為基礎的生產(chǎn)方式(shēngchǎnfāngshì)……（冷冰冰克隆人和自然人，×情人節(jié)少了一個經(jīng)濟增長點；克隆戰(zhàn)爭狂人和反戰(zhàn)英雄；克隆idea孫悟空齊天大圣）。基因工程技術是當代科學技術重要的前沿。6共一百六十六頁二．基因工程的概念（一）基因（gene）

基因從化學上來說，指的是一段DNA或RNA順序，該順序可以產(chǎn)生或影響某種表型（genotype，phenotype），可以由于突變生成等位基因變異體（體細胞父源和母源；正常和突變基因）；從遺傳學上來說，基因代表一個遺傳單位，一個功能單位，一個突變單位。（二）基因工程（geneticengineering）

基因工程

在體外通過人工剪、接，將不同(bùtónɡ)來源的DNA分子組成一個雜合DNA分子(DNA分子重組體)，然后導入宿主細胞去復制擴增或表達。因為通過人工設計,得到一定的設計方案，故稱為基因工程。由于整個操作在分子水平上進行，所以也稱分子克隆。

基因工程的基本特點是，分子水平操作，細胞水平表達。

7共一百六十六頁

在這個過程中：1.“基因剪刀”

剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀”2.“縫紉針”

連接不同來源DNA分子的酶就像一根“縫紉針”，使二者連在一起3.“交通工具(jiāotōnggōngjù)”使用載體好比一輛車子

4.“乘客”

有用基因如IL2好比使乘客，車子把乘客送進理想天堂（宿主細胞）去繁衍生息，春華秋實，生產(chǎn)我們需要的產(chǎn)品或開展基因治療（IL2/LAK→抗癌）。8共一百六十六頁

我們應該記住他們——1.第一個實現(xiàn)DNA重組的人－Berg1972年，Berg用E.coRⅠ切割SV40DNA和λphageDNA，經(jīng)過連接組成重組的DNA分子。Berg是第一個實現(xiàn)DNA重組的人。2.第一個取得基因工程成功(chénggōng)的人－Cohen

1973年，CohenGroup將E.coli的tetr質(zhì)粒psclol和nersrR6-3質(zhì)粒體外限制酶切割，連接成一個新的質(zhì)粒，轉化E.coli，在含四環(huán)素和新霉素的平板上篩選出了terrNer,實現(xiàn)了細菌遺傳性狀的轉移。這是基因工程史上的第一個克隆化并取得成功的例子，這一年被定為基因工程誕生的元年。9共一百六十六頁三．基因工程克隆技術――人類對自然的干預（一）遺傳和變異是生物學的一對重要概念。

1.遺傳賦予生物種的穩(wěn)定，保證生物種的延綿不斷（不能斷香火(xiānɡhuǒ)）。2.變異賦予生物種的進化，保證生物種對環(huán)境的適應。3.遺傳和變異這一對矛盾在一個生物體內(nèi)統(tǒng)一起來。4.在生物演變的歷史長河中，自然發(fā)生的變異是相當相當緩慢的。5.隨著生物科學的發(fā)展，尤其是基因工程技術的誕生，人類開始干預生物的變異（福耶禍耶？無法定論）6.經(jīng)典的遺傳學千百萬年才能積累出現(xiàn)的有利的變異，通過基因工程手段幾十年乃至幾年就可以實現(xiàn)。而時至今日，幾乎一發(fā)不可收拾。10共一百六十六頁(二)多利

1997．2．23．，Nature雜志報道，英國愛丁斯堡羅斯林研究所和PPL生物技術公司已經(jīng)成功克隆了一只名叫多利的綿羊（1997－2003/7/12）。這一消息的公布，全世界震驚的程度不亞于原子彈在長崎和廣島的爆炸，在全球引起了軒然大波，以至世人驚呼(jīnɡhū)：不要讓科學瘋狂！為什么以前胚胎克隆沒有在世界上引起軒然大波呢?原因是此克隆非彼克隆，多利取自功能徹底分化的成年動物乳腺細胞，即體細胞。它推翻了遺傳學上一條上百年的定律：體細胞功能高度分化，不可能重新發(fā)育成個體。11共一百六十六頁（三）多利誕生的過程

為什么震驚和驚呼，我們先了解一下多利誕生的過程以及胚胎細胞克隆和體細胞克隆的區(qū)別這兩個基本問題，對我們學習后面內(nèi)容或許有所幫助和啟發(fā)(qǐfā)。多利誕生的過程：1.取出第一只成年母羊乳腺的普通細胞，分離基因備用。2.取出第二只母羊未受精的卵細胞，取出基因換上第一只羊乳腺細胞基因（“掉包”），放電激活該卵細胞，使之象正常受精卵一樣進行細胞分裂，直至一定階段，胚胎成熟。3.將成熟的胚胎移植到第三只母羊子宮中發(fā)育，妊娠（同正常一樣），最后產(chǎn)下多利。這樣一只與第一只羊基因百分之百一樣的復制品誕生了。

12共一百六十六頁（四）此克隆非彼克隆

胚胎細胞克隆體細胞克隆供體細胞胚胎細胞（核）體細胞（核）受體細胞去核未受精的卵細胞去核未受精的卵細胞發(fā)育場所母體宮腔母體宮腔關鍵(guānjiàn)區(qū)別克隆的是子代（多生了一個）復制的是自己（復制了一個）（五）克隆(kèlónɡ)是一把雙刃劍

試想，有了克隆技術，有人在你毫不知曉的情況下復制一個“你”去犯罪，怎么辦？試想，有了克隆技術，一些極權的政治野心家一下子克隆出好幾個戰(zhàn)爭狂人希特勒、墨索里尼，怎么辦？還有，有了克隆技術，世界上同時生活著多個你、我、父母、兄弟、姐妹，按現(xiàn)行的社會倫理道德很難為其“名份”定位，又該怎么辦？因此說克隆對人類社會倫理道德提出了一場非同尋常的挑戰(zhàn)，平添一系列是我非我、是父非父、是妻非妻、是子非子之類的麻煩事，絕非危言聳聽。從社會倫理角度看，用克隆技術培育出的人，有其特定的生理性狀，這對人類的自然發(fā)展和人種的自然構成無疑會產(chǎn)生極大的影響。13共一百六十六頁

從家庭倫理角度看，將克隆技術用于人體繁殖，會加劇家庭多元化傾向，還會從根本上改變?nèi)说挠H系關系，確定人類親系關系的標準也將發(fā)生改變。從性倫理角度看，它完全改變了人類自然的基于性愛的生育方式，使人口的生產(chǎn)與性愛分離，從而破壞男女之間基于性受而獲得后代的情感，并由此改變?nèi)祟惖幕拘詡惱黻P系。從遺傳學上看，人本來是由兩性細胞結合而產(chǎn)生的，這種結合有利于人種進化(jìnhuà)，而克隆使人的遺傳基因成為單一的，勢必導致人種退化。從哲學上看，克隆還會使人們正常的生與死的概念發(fā)生動搖。圖8-2用克隆技術復制(fùzhì)人類的假想圖14共一百六十六頁四．基因工程3大理論，3大技術準備：（一）理論上的3大發(fā)現(xiàn)：1.20世紀40年代，Avery發(fā)現(xiàn)了生物遺傳物質(zhì)的化學本質(zhì)是DNA。超越時代的科學成就往往(wǎngwǎng)不易被人們接受，Avery當時并未贏得陣陣掌聲，他的論文事隔10年以后才公開發(fā)表。2.20世紀50年代，Watson-crick提出了DNA結構的雙螺旋結構模型，搞清楚了生物遺傳物質(zhì)的分子機制。3.20世紀60年代，確定了遺傳信息的傳遞方式：DNA→RNA→Pr,破譯了全部遺傳密碼，43。15共一百六十六頁（二）技術上的3大發(fā)明：1．“基因剪刀”－限制性內(nèi)切酶的發(fā)明

（1）20世紀40－60年代，科學家們就為基因工程設計了美好的藍圖，但是面對龐大的dsDNA（104，2.2*1011公里）束手無策，無從下手把它切成單個基因片斷。（2）當時的酶學知識已有相當?shù)陌l(fā)展，但是沒有一個(yīɡè)已發(fā)現(xiàn)的酶能完成這樣的使命。（3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血桿菌（Haemophilusinffuenzae）分離純化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁錮，迎來了改造生物的春天，為基因工程奠定了最為重要的技術基礎。16共一百六十六頁2．載體(“交通工具車子”)－基因工程技術誕生的第二個技術準備

（1）

有了切割與縫合（ligase）基因DNA的工具，還得有一個車子（富康）將重組DNA送到宿主細胞中去。（2）1946年起，Lederberg就研究細菌性因子（F因子）.50-60年代相繼發(fā)現(xiàn)了R因子（抗藥因子），CoE(大腸桿菌因子)等質(zhì)粒。（3）然而，直到(zhídào)1973年Cohen才能將質(zhì)粒作為基因工程載體使用（至今一直是基因工程最重要最廣泛使用的載體）。這是基因工程的第二個技術準備。17共一百六十六頁

3．逆轉錄酶－1970年Baltimove和Temin等同時各自發(fā)現(xiàn)了逆轉錄酶，打破了遺傳學（生物學）中心法則，使真核基因的制備成為可能。（原因如下）(1)真核基因組龐大而復雜，不易制得基因圖譜。HGP2005年完成(wánchéng)，2.8萬個基因，1－3kb/基因，104，2.2*1011公里。（2）即使有了基因圖譜，因為真核基因有內(nèi)含子，不能在原核表達系統(tǒng)剪接出mRNA，沒有成熟的mRNA就不能得到相應得產(chǎn)物。（3）經(jīng)過逆轉錄mRNA→cDNA(complementoryDNA)文庫要比基因組文庫小得多，所以篩選陽性克隆就方便得多。有了這些理論核技術的武裝，基因工程的臨盆降生指日可待，Berg和Cohen兩位科學的“助產(chǎn)士”，把基因工程接到了人間。18共一百六十六頁五．與基因工程相關的概念：（一）克?。╟lone,cloning）：

1.原意是指單細胞純系無性繁殖。2.現(xiàn)代概念是將實驗得到的人們所需的微量基因結構，引入適當?shù)乃拗骷毎腥ァＴ诤线m的生理環(huán)境中進行無性繁殖，從而利用宿主的生理機制繁衍人們所需要的基因結構，并進行表達。由于整個操作在分子水平上進行，所以稱為分子克?。╩olecularcloning）。3.

這個術語(shùyǔ)的幾種含義：

（1）作為名詞

①帶有相同插入順序的重組DNA分子的1個群體。②基因型（genetype）相同的細胞或生物體的一個群體。③最常用的是描述一個微生物的一個菌落，這些微生物帶有插入了特定DNA片斷的載體分子。

（2）作為動詞，是“去克隆”，即利用體外DNA重組技術將一個特定的基因或DNA順序插入一個載體分子。19共一百六十六頁

（二）重組DNA技術(DNArecombinationtechnique)

是用酶學的方法將不同來源的DNA在體外切割，連接組成一個雜合的DNA分子的技術。基因工程包括DNA重組技術，現(xiàn)將相關的概念關系列表如下。

（三）生物工程（Biologicengineering）：是更大范圍內(nèi)生產(chǎn)及產(chǎn)品的工程技術，是現(xiàn)代生物學中一切工程技術的總稱，包括：

1.遺傳工程（geneticengineering）

比較基因工程有更廣泛的內(nèi)容，包括基因工程，但基因工程不等于遺傳工程，凡是人工改造遺傳性狀的技術都稱之遺傳工程，有個體的，細胞的，分子水平的。

（1）基因工程：①DNA重組；②DNA體外誘變；③體外基因操作；④基因化學合成等。（2）物理(wùlǐ)化學誘變；（3）細胞融合（4）花粉培育（5）有性雜交等。

2．發(fā)酵工程3．酶學工程4．細胞工程5．農(nóng)業(yè)(nóngyè)工程6．希望工程20共一百六十六頁第二節(jié)工具酶常用的工具酶（toolenzymes）有：

1.限制性核酸內(nèi)切酶（resrictionenzymes,restrictionendonadease)2.DNA連接酶（DNAligase,ligase)3.逆轉錄酶(reversetranscriptase)4.DNA聚合酶(DNApolymerase,DNApol)5.核酸酶(nuclease)6.末端(mòduān)轉移酶(terminaltransferase)7.堿性磷酸酶(BAP或CIP)以1.和2.最為常用，最為重要。工具酶現(xiàn)已商品化。21共一百六十六頁一．限制性核酸內(nèi)切酶（一）限制酶的概念（定義，分類，命名，限制與修飾辨正關系）1.定義限制酶（restrictionendonuclease,restrctionenzymes）是一類專門切割DNA的酶，它們能特異結合一段被稱為限制酶識別順序的特殊DNA序列(xùliè)。并切割dsDNA。所謂限制（restriction）=切割（clearage）=水解（hydrolysis）該部位的核苷鍵（磷酸二酯鍵）2.分類限制酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的（400多種E/350M）。所有的限制酶可分成3類。

（1）Ⅰ、Ⅲ型，兼具限制與修飾活性，它們識別與切割順序不在一個地方，不產(chǎn)生特異性的DNA片段，與基因工程意義不大（有說Ⅲ型識別核切割的位點一致，但罕見）。

（2）Ⅱ型基因工程說到的限制酶是Ⅱ型酶，具有此類酶的微生物限制－修飾系統(tǒng)分別由限制酶核甲基化酶來完成。Ⅱ型酶分子量小，僅需Mg2＋作為催化反應的輔因子，識別與切割位點相同，產(chǎn)生特異的DNA片段。22共一百六十六頁3.

命名（1973年Smith原則、Ⅱ型酶）根據(jù)分離此酶微生物的學名，一般(yībān)取3個字母。第一個字母大寫該微生物屬名前的第一個字母第二、三個字母小寫該微生物種名前的2個字母第四個字母大寫有變種或品系的第一個字母羅馬字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ從一種微生物中發(fā)現(xiàn)了幾種限制酶，按發(fā)現(xiàn)順序排列

如EcoRⅠ是指從大腸桿菌（Escherichiacoli）R株分離得到的第一種限制酶。23共一百六十六頁

(二)限制酶的識別位點1．

一般特征（4點）：（1）Ⅱ型酶識別的特殊DNA序列稱為限制酶的識別位點（或切割位點）。

（2）它能識別dsDNA的4－6bp的回文序列并水解該部分的核苷鍵。一般來說是4－6bp，有6個以上的，但沒有4個以下的。（3）識別順序呈二重對稱(duìchèn)，即1800旋轉對稱。如：

GCCGGTNACGAATTCHhaCGGCMaeⅢCANTGEcoRⅠCTTAAG(4)酶靶順序大小是很重要的，它決定產(chǎn)生特定DNA中段的大小。若DNA堿基組成是均一的，限制酶切點是隨機的，那么對于：①

要求4bp靶序列如HpaⅡ,MboⅠ等在龐大DNA鏈上平均44核苷酸即可遇到一個靶序列，即1/256②

同理，要求6bp的酶，則平均46遇到一個靶序列，即1/4096。24共一百六十六頁

2.識別簡并序列;

簡并序列是指序列中有核苷酸位可以是不同的核苷酸。如：GTYRACY=C或TR=G或AYR=CG或CA或TG或TAHinⅡ?qū)嶋H上可以識別4個特定序列。3.識別位點與切割位點不同，但二者距離是一定的(某些(mǒuxiē)酶識別位點在切割位點附近),即產(chǎn)生特定的DNA片段，這是與Ⅰ型酶的區(qū)別之一。

HgaⅠ識別位點GACGC→5/10(核苷酸距離)→dsDNA上切割5ˊGACGCNNNNN↓NNNNN3ˊ3ˊCTGCGNNNNNNNNNN↑5ˊ先識別（搞清楚）滑行一段距離再切，此稱為Distantcleavage

25共一百六十六頁

(三)限制酶的切割位點：限制性對dsDNA2條鏈同時切割（其具體切割點，即磷酸二酯鍵斷開的位點，相對二重對稱軸的位置而異）產(chǎn)生3種不同切口：1．

形成平頭末端（flush或bluntend）如－TC↓GA-smaⅠbsuRⅠor–TC3ˊ+5ˊGA-－AG↓CT-AluⅠ-AG5ˊ+3ˊCT-2.形成5′－粘性末端（5′－cohesiveend即3′延伸(yánshēn)末端）5′-GAATTC3′EcoRⅠ5′-GAATTC-3′+3′-CTTAAG5′3′-CTTAAG-5′3.形成3′－粘性末端（3′－cohesiveend）5′CTGCAG3′pstⅠG-3′5′-CTGCA+3′GACGTC5′ACGTC-5′3′-G粘性末端（stickyend）—限制酶切割產(chǎn)生2個突出的末端稱之，作用是放在一起自發(fā)形成雙鏈。26共一百六十六頁（四）同裂酶(isoschizomers)

通常不同的酶識別不同的順序，然而有許多不同源限制(xiànzhì)酶產(chǎn)生相同的末端，此即同裂酶。1．異源同工酶（Isoschizomers:來源不同，識別順序相同，切割方式可同可不同：(1)識別順序與切割方式同，如：MboⅠ5′和SauSⅠ3′（－NN↓GATCNN-3′）-NNCTAG↓NN-5′(2)識別順序同，切割位點不同，如：SmaⅠ和XmaⅠCCC↓GGGC↓CCGGG(3)識別與切割相同，但其中一酶可以切“修飾”（甲基化*），另一酶不能。如：HpaⅡ→CCGGMspⅠ→CCG*GMboⅠ→GATCSau3A→GA*TC2.一個位點包含在另一個位點之中（稱subsets-識別與切割相互有關的酶稱之。）

HpaⅡCC↓GGSmaⅠ的6個bp含HpaⅡ的4個bp順序，所以HpaⅡSmaⅠCCC↓GGG能識別與切割SmaⅠ的6個bp，但含有HpaⅡ的ccgg其它6核苷酸順序都不能被SmaⅠ切割。3．同尾酶（isoaudumers-識別順序不同，產(chǎn)生粘性末端相同的酶稱之。）

BamHⅠG↓GATCC由此產(chǎn)生的DNA片段可借粘性末端相互連接，Sau3AN↓GATCN在DNA重組時具有更大的靈活性。27共一百六十六頁

(五)限制酶得正常識別切割能力是buffer的或幾個(jǐɡè)因子的函數(shù)（1－8等）

1.酶濃度2.酶的專一性3.離子濃度4.pH5.溫度6.底物濃度、純度7.2價離子：Mg2+、Mn2+、Co2+、Zn2＋8.保護劑：甘油、DMSO、甲酰胺Polisky證明，Mgcl2從5mM下降至2mM，pH值上升到8.5，EcoRI專一性從6bp下降至4bp即NAATN,這種識別AATT的EcoRI稱EcoRI*。一種限制酶可能被它識別位點的甲基所抑制，這對于組建DNA甲基化圖譜是很重要的，是研究一個動向。對于限制反應機制，盡管書上列出1，2步反應，但人們更關注他的應用。所以這方面資料極少（全球1－2人）。（六）限制酶的應用：

1．DNA重組2.分子雜交受體體段DNA3.DNA序列分析4.制備DNA指針5.基因定位,DNA7.DNA甲基化堿基的識別和切割8.組建新質(zhì)粒28共一百六十六頁DNA物理圖譜——標明限制酶在DNA分子上的限制位點數(shù)，限制性片段的大小(dàxiǎo)及排列順序的圖譜稱之或稱限制性圖譜。組建圖譜是基因工程的第一步工作（很難，拿來主義多，受惠贈，千萬注意要圖譜，不要受騙），與基因定位，轉錄，消化，分離，分子雜交，克隆轉化有直接的關系。29共一百六十六頁二．DNA連接酶：DNA連接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用T4DNAligase.（一）功能：催化有互補順序的兩個dsDNA分子的粘性末端或平頭末端3′－OH、5′－P連接(liánjiē)作用。（二）來源－噬菌體T4感染Ecoli分離的一種單鏈多肽酶、MW.68KD。（三）催化反應：

（1）需要ATP、Mg2+作輔助因子；（2）缺刻（Nick）DNA也可作該酶的底物。（3）對粘性末端催化活性大于平頭末端（酶量1：100）30共一百六十六頁三、逆轉錄酶（一）概述

逆轉錄酶也稱反轉錄酶或RNA依賴的DNA聚合酶（RNAdependentDNApolymerase,RDDP）。是由Baltimove從鼠白血病病毒（murineleukemiavirus,MLV）和Mizutan從勞氏肉瘤病毒(Roussarcomavirus,RSV)中，于1970年分別各自發(fā)現(xiàn)的，這兩個小組論文同時在同一期Nature上，可見其意義。該酶在逆轉錄病毒（retrovirus）生產(chǎn)循環(huán)中起主宰作用。（二）功能(gōngnéng)

基因工程中主要用于逆轉錄mRNA→cDNA（complementoryDNA）。（三）商品化逆轉錄酶有兩種

①AMV（禽成髓細胞瘤）②Mc-MLV(鼠白血病病毒)。31共一百六十六頁（四）酶的活性

由于尚不完全清楚原因，sscDNA能形成發(fā)夾結構，引導EcoliDNApolⅠkelnow片段或錄酶合成cDNA第二條鏈，（多年來除了自身(zìshēn)引導合成cDNA第二條鏈外別無它法）。逆轉錄酶是一種多功能酶，它的酶活性有：1.逆轉錄酶以mRNA為模板合成cDNA2.DNA依賴DNApol以ssDNA為模板，3′－OHDNA片段為引物，按5′→3′合成DNA鏈。3.

RnaseH外切RNA酶活性，底物是RNA－DNA雜交分子RNA鏈，有兩種：①5′→3′外切RNA，稱5′→3′外切RNA酶；②3′→5′外切RNA酶，稱3′→5′外切RNA酶，也稱RnaseH。4.DNA內(nèi)核酸酶Mn2＋存在時，逆轉錄酶能切cccDNA，此活性無專一位點，對熱不穩(wěn)定。5.

DNA解旋酶類似unwinding。32共一百六十六頁四、DNA聚合酶：

DNA聚合酶以DNA為模板合成DNA，基因工程常用的酶有：（一）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coliDNApolⅠ）

1956年，A.kornberg首先從E.coli中分離得到。是由1條多肽鏈組成的球蛋白直徑65，MW109KD，并以蛋白敏感的多肽接頭折疊成兩個區(qū)域含19－45％а螺旋結構，分子中有單鏈巰基，每分子含1個Zn2＋原子，還不能證明Zn2＋參加了催化反應，酶活性中心有3個密切相連的結合位點－即DNA核模，核苷磷酸（估計引物，生長鏈痘結合在這里）和dNTP結合位點。1．E.coliDNApol由大小兩亞基組成，具有3種酶活性，即大亞基5′→3′DNA聚合酶，3′→5′外切酶及小亞基的5′→3′外切酶活性：（1）5′→3′DNA聚合酶活性以ssDNA為模板，沿引物3′－OH方向，按模板順序從5′→3′延伸。5′CCGATA－OHE.coliDNApolⅠ5′CCGATAGCCT3′3′GGCTATCGGA5′Mg2＋dDNP3′GGCTCGGA5′（2）3′→5′外切酶活性即從游離的3′－OH末端降解ssDNA或dsDNA，其意義在于識別和消除不配對的核酸，保證DNA復制的忠實性。其dsDNA外切活性可被5′→3′聚合活性所抑制。5’CGCATCG-OH3’E.coliDNApolⅠ5’CGC3’GCGMg2＋3’GCG＋dAdTdCdG其dsDNA外切酶活性可被5′→3′DNA聚合酶活性所抑制。（3）5′→3′外切酶活性：從游離的5’端降解dsDNA成單(chénɡdān)核苷酸或寡核苷酸，也降解DNA:RNA雜交體RNA成分（具有RnaseH活性）5’－CTCATTAG－3’E.coliDNApolⅠ5’－CATTAG3’－GCGTAATC－5’Mg2＋3’－GCGTAATC+pC,pG33共一百六十六頁2.E.coliDNApolⅠ(DNApolⅠ)在基因工程的應用：

（1）制備高比活性的探針DNApolⅠ可催化(cuīhuà)DNA缺口移位反應（Nicktranslation），為基因工程制備高比活性放射性探針（放標，非放標，32P，地高辛6400.00/盒）5’――――――――3’3’――――――――5’dsDNAMg2＋↓DNA酶Ⅰ5’—3’（3’—5’）↓32PdNTP,DNApolⅠ（全酶）5’―3’3’―5’（參缺口平移法圖解）（2）用于分子克?。ㄌ畛淙笨诶谥亟M）

DNApolⅠ能填充DNA的小缺口區(qū)（Gappedregion）→以便有效在體外用于DNA分子重組，如：①切割cccdsDNA分子作載體時②插入一段不具粘性末端的DNA片段或加入1個同源順序ssDNA片段③此時用DNApolⅠ填充這個缺口④再用ligase(3’-OH,P-5′)連接，組成重組DNA分子。34共一百六十六頁（3）DNA序列分析

DNApolⅠ是3種測測序法（Sanger雙脫氧法（測序自動化原理同Sauger雙脫氧法），化學降解法和加減法）中的關鍵試劑→每個方法的成敗都取決于DNApolⅠ從融合引物復制的ssDNA的能力（詳參DNA的序列測定），這里僅作簡介。①

Sauger雙脫氧法DNApolⅠ參入了2’3’－雙脫氧核苷酸到相應的融合了的引物中，從而終止了鏈的進一步延伸，這樣每個大小不同片段(piànduàn)都帶有ddNTP。經(jīng)過PAGE測出DNA順序。②

化學降解法當Mg2＋被Mn2＋取代時，DNApolⅠ有參與相應NTP取代dNTP的能力，參與的這個NTP可以作為1個特殊切割位點而被降解，得到帶有NTP末端的DNA片段，這是化學法測序的主要原理。③

加減法主要原理是在限制使用dNTP條件下加入DNApolⅠ和T4誘導的DNApol同時反應。在減法反應中從4個反應混合物中每4個dNTP中減去1個。生長鏈沿著引物延伸至缺少的那個dNTP為止。在加法反應中所用的dNTP只有1種，如dATP，通過DNApol3′→5′外切酶活性使鏈終止在帶有A的3’末端用其它3種dNTP進行類似反應，這樣通過加或減法8個混合物的電泳結果即可推出DNA鏈的順序。

35共一百六十六頁（二）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－Klenow片段酶

基因工程很多情況下，E.coliDNApolⅠ可用它的1個大片段Klenow片段酶代替。該酶是枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解E.coliDNApolⅠ所得到的。

1.Klenow大片段是一條多肽鏈，MW76KD，保留了E.colipolⅠ的5′→3′DNA聚合酶，3′→5′外切酶活性。

2.Klenow在基因工程用于：(1)補平用限制(xiànzhì)酶消化dsDNA得到的5’粘性末端（即3’延伸末端）5’－G-OHKlenow,Mg2＋5’－GAATT3’－CTTAADntp3’－CTTAA(2)同（1），填平過程中，用32pdNTP標記DNA片段3’末端。(3)cDNA克隆了中，用于合成cDNA的第二條鏈。(4)在Sanger雙脫氧法ddNTP系統(tǒng)進行序列分析。

36共一百六十六頁（三）T7噬菌體DNA聚合酶及測序酶:1.

T7噬菌體DNA聚合酶

（1）來源

T7噬菌體感染的E.coli誘生的DNApol是兩種蛋白的復合物（T7噬菌體基因蛋白和宿主硫氧還原蛋白的緊密復合體）。（2）

酶的活性

與Klenow片段（酶）相似，有5’－3’聚合活性以及3’－5’外切酶活性，無5’－3’外切酶活性。①

5’－3’聚合活性其5’－3’聚合能力和合成DNA平均長度較目前已知的其它任何DNApol都強（持續(xù)聚合能力強）?？捎糜诳截愰L段模板的引物延伸反應。②

3’－5’外切酶活性較Klenow酶強1000倍，其用途與Klenow酶一致，不同的是在于可對3’突出端的DNA分子進行末端標記。

2．測序酶

是經(jīng)過(jīngguò)基因工程改造的T7噬菌體DNApol，它完全喪失了外切酶的活性，故該酶是Sanger雙脫氧法對長片段DNA進行序列分析的理想用酶（商品名即測序酶）。

37共一百六十六頁

（四）TaqDNA聚合酶(TaqDNApol，Taqpol）

該酶是一種耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶，具有5’－3’聚合活性以及依賴5’－3’聚合酶作用的外切酶活性，聚合酶的最適反應溫度是75℃－80℃,37℃活性有10％。該酶的主要用途是進行PCR反應（詳參聚合酶鏈，polymerasechainreaction）1.來源1969年在美國黃石公園溫泉分離出一種嗜熱真菌，即水生棲熱菌株（thermusaquaticusstrain,TYC），該菌能在70℃－75℃生長，已經(jīng)克隆(kèlónɡ)化該菌的基因，cetus公司首次分離純化了該酶，商品名為TaqDNApolymerase，分子量94KD，－20℃至少可貯存6個月，由于TaqDNApolymerase能抵抗鏈分離所需要的高溫（94℃－95℃）的反復處理，故只需在第一次熱變性后，加一次酶，即可以進行30－40次循環(huán)，簡化加快了操作程序，實現(xiàn)了PCR的自動化，耐熱酶還有VENT、sac等，以Taq應用最廣。

38共一百六十六頁

2.使用Taqpol主要考慮下述5個參數(shù)（PCR）

（1）熱穩(wěn)定性PCRcycle中，DNA變性處理通常30－60秒，按30個循環(huán)累計熱變性時間為15－30分鐘，Taqpol連續(xù)保溫30分鐘后，仍保持相對高的活力。（2）特異性退火(tuìhuǒ)（復性）和延伸的溫控對引物模板的轉移性影響很大。Taqpol最是反應溫度是75℃左右，而退火(tuìhuǒ)溫度可在55－70℃，因而Taqpol可顯著提高引物退火(tuìhuǒ)特異性，避免了引物與模板非特異性產(chǎn)物的合成。（3）延伸長度PCR有時需要擴增>1kb的片段，這就要求選用DNApol具有較強的延伸能力。當擴增片段>250bp時，使用Klenow片段時的擴增率大為降低，而Taqpol能從基因組擴增2kb片段。39共一百六十六頁（4）合成產(chǎn)率高

據(jù)酶反應動力規(guī)律，聚合反應后期會產(chǎn)生平臺效應，平臺期出現(xiàn)時，合成產(chǎn)物積累多少，直接與DNApol的性能有關。用Taqpol平臺期在25輪循環(huán)(xúnhuán)時出現(xiàn)，產(chǎn)物累計達1×107拷貝，高于Klenow片段。（5）忠實性

評價一個DNApol的忠實性在于檢測復制過程中核苷酸錯誤摻入的頻率，酶的忠實性是一個關鍵特性，尤其是PCR擴增物進行DNA序列分析時就顯得尤為重要。Klenow片段錯誤頻率約為1/10000,Taqpol約為1/5000，實際應用中，Taqpol經(jīng)過25輪循環(huán)中，延伸產(chǎn)物的任何位點將在400堿基中出現(xiàn)一個分子篡改原始序列。目前已發(fā)現(xiàn)T4DNApol的忠實性較上二者好，其堿基錯誤摻入頻率<107?，F(xiàn)國外已建立Taq酶克隆菌株，能改進上述性能，增加產(chǎn)量，提高產(chǎn)率。

40共一百六十六頁（五）

T4噬菌體DNA聚合酶（T4DNApol）1.來源

源于T4噬菌體感染(gǎnrǎn)的E.coli。2.酶的活性，相似于Klenow片段，但遠遠強于Klenow片段（1）5ˊ→3ˊ聚合活性（2）3ˊ→5ˊ外切酶活性（T4pol/Klenow）

3.基因工程中用途與Klenow片段一致（參前，標記末端，填平5’末端），不同的是可對3’突出端的DNA分子進行標記。這是用其強勁的3ˊ→5ˊ外切酶活性切除3’突出端，產(chǎn)生3’凹端。

5’－CTGCCTGCA—3’T4DNApol5’－CTG5’-CTACC

3’-GACGG32P-dCtp,dNtp3’－GACGG3’-GACGG41共一百六十六頁五．核酸酶

常用的的單鏈特異的SI核酸酶（核酸酶SI,nucleaseSI，SI）和BAL31。（一）核酸酶SI(SI核酸酶，nucleaseSI，SI，常用的核酸酶)

1.來源源于米曲霉素（aspergillusoryzas）2.酶作用底物ssDNA、ssRNA、dsDNA、或DNA-RNA雜交鏈。3.酶活性有低、中、極高3種情況變化－(1)降解ssDNA或ssRNA形成5’p末端的單或寡核苷酸，對DNA活性強于>RNA,如：ssDNA或ssRNASI，PH4,5Zn2＋5ˊpdN或5ˊprN(2)中量SI可從切口（Nick）或小缺口（smallgaps）處降解dsDNA，(3)極大量的SI才能講解(jiǎngjiě)dsDNA或DNA-RNA雜交鏈，原因是后者對SI講解(jiǎngjiě)有抗性，所以SI又稱單鏈特異的核酸酶。在基因工程中用于：①去除DNA片段的粘性末端而產(chǎn)生平端。②打開cDNA中的發(fā)夾環(huán)，使其成平端。③分析DNA：RNA雜交體結構，可證明基因內(nèi)部內(nèi)含子的存在（當一條DNA與它的mRNA雜交時，如果雜交鏈中有RNA－loop環(huán)，SI可切開這個環(huán)，這是基因中有間隔順序證明。42共一百六十六頁(二)BAL31核酸（源于乳白短桿菌）

1.來源乳白短桿菌。2.酶活性3’外切核酸酶活性和內(nèi)切核酸酶活性。3.（1）3’外切核酸酶活性：底物平端dsDNA或dsDNA切口；3’－OH突出端或ssDNA；dsRNA。（2）內(nèi)切核酸酶活性：DNA的單鏈區(qū)；底物DNA螺旋構象有所改變的雙鏈區(qū)。4．基因工程用于：（1）通過可控方式去除dsDNA末端(mòduān)的核苷酸→用于基因克隆表達、缺失突變等。（2）與限制酶協(xié)作→建立物理圖譜。（3）確定DNA的二級結構→如z－DNA與b-DNA的結合部位等。

43共一百六十六頁六、末端轉移酶（TTE）（一）來源小牛胸腺。是僅存于前淋巴細胞及淋巴樣細胞內(nèi)的一種不同尋常的DNApol，催化dNTP加到DNA分子3’－OH末端，也稱末端脫氧核苷酰（酸）轉移酶（terminaltransferase，TTE）。（二）底物帶3’－OH末端的ssDNA具有延伸3’-OH末端dsDNA或平端dsDNA的作用。（三）酶活性：1.催化一個單核酸（dNTP）－>加到另一個DNA分子的3’－OH末端，如：ssDNA－OHTTE，Mg2＋或Mn2＋DNA－pd（N）n＋ppindNTP2.平端或帶延伸3’－OH末端的dsDNA需要Co2＋存在才能作模板，如：dsDNATTECo2＋DNA－pd（N）n＋nppindNTP（四）

基因工程中用于：

1．加一個互補同源多聚尾－>到載體和cDNA－>造成便于重組的人工(réngōng)粘性末端。2.在32p存在時，用于標記DNA分子的3’末端。44共一百六十六頁七、堿性磷酸酶（alkalinephoptase,APE）

APE包括BAP（細菌堿性磷酶和CIP（小腸堿性磷酶）。功用如下：（一）去除DNA、RNA和dNTP的5ˊ磷酸根。（二）去除5ˊ-P，防止DNA片段或載體自身(zìshēn)環(huán)化。（三）32p標記5ˊ—末端前，先用其去除DNA或RNA上的5ˊ-P。45共一百六十六頁幾種重要(zhòngyào)的工具酶的酶學性質(zhì)及在基因工程中的應用酶來源活性底物輔因子特點用途1.限制酶（Ⅱ）(restrictionendonuclease,restrctionenzymes）微生物400RE/350M內(nèi)切dsDNAMg2＋特異性識別和切割dsDNA,產(chǎn)生平頭或粘性（5’-3’-）末端1．DNA重組2.組建新質(zhì)粒3.構建物理圖譜4.制備探針5.DNA序列分析6.分子雜交2.連接酶（ligase）T4phage連接兩個片段dsDNAMg2+ATP活力：粘端>平端1．DNA重組2.DNA序列分析3.DNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）E.coli5’－3’聚合；3’-5’外切；5’-3’外切ssDNAdsDNAdsDNAssDNAMg2＋對dsDNA外切活性可被5’－3’pol活性所1.制備探針2.DNA序列分析46共一百六十六頁酶來源活性底物輔因子特點用途4.逆轉錄酶（ReverseTranscription）RNA腫瘤病毒RNA→cDNA；DNA→DNARNAseH解旋ssRNAssDNARNA:DNAcccDNAMg2＋RNA指導DNA指導解超螺旋制備cDNA5.SI核酸酶（NaseSI）米曲霉切單鏈ssDNAssRNAZn2＋切除單鏈切尾巴，產(chǎn)生平端，用于質(zhì)粒組建和DNA重組6.Bal31乳白短桿菌外切dsDNACa2＋5’3’兩端同時籌速外切7.末端轉移酶（TTE）小牛胸腺加dNTP到DNA分子3’－OH末端dsDNAorssDNA3’-OHMg2＋Co2＋存在可具有延伸3’－OH的DNA為模板造成人工粘端，便于重組；32p標記DNA分子3’末端8.BIP/CIP細菌/牛腸切除磷酸ds,ssCa2＋Mg2＋阻斷片段或載體自身環(huán)化。47共一百六十六頁第三節(jié)載體一．載體的概念：

1.要把一個有用的基因（目的基因——研究或應用基因）通過基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。

2.凡來源于質(zhì)粒或噬菌體的DNA分子，可以插入或克隆(kèlónɡ)DNA片段統(tǒng)稱為vector。3.基因工程所用的vector實際上是DNA分子，是用來攜帶目的基因片段進入受體細胞的DNA48共一百六十六頁二、載體(zàitǐ)的分類分類依據(jù)類別克隆擴增或表達舉例1.按功能分成（1）克隆載體（2）表達載體√√PBR322PCDN32.按進入受體細胞類型分（1）原核載體（2）真核載體（3）穿梭載體PUC8PBUDCE41YE3.按載體來源分病毒載體＋4.按克隆片段得大?。寺∧芰Γ┓?1)<1kb(2)<10kb(3)<22kb(4)<50kb(5)0.1-0.4Mb(6)0.5-2Mb(1)M13(2)plasmid(3)λphage(4)casmid(5)BAC(6)YAC√49共一百六十六頁說明：1.穿梭載體（sbuttlevector）

指在兩種宿主生物體內(nèi)復制的載體分子，因而(yīnér)可以運載目的基因（穿梭往返兩種生物之間，如：YEP,DIDB2192.YAC

YeastArtificialChromsome由酵母基因和PBR322質(zhì)粒衍生物構成，對克隆大的真核基因十分有用，在HGP中發(fā)揮主要作用。3.BAC

細菌人工染色體。50共一百六十六頁三、基因工程載體的3個特點：（一）都能獨立自主的復制

載體DNA分子中有一段不影響它們擴增的非必需區(qū)域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被動的跟著載體一起復制/擴增，就像載體的正常成分一樣。（二）都能便利的加以檢測

如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細胞放在含有該抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長時，只有攜帶這些(zhèxiē)抗性基因的載體分子的受體細胞才能存活。（三）都能容易進入宿主細胞中去，也易從宿主細胞中分離純化出來。

51共一百六十六頁四、克隆載體和表達載體：

所有的載體可以分成兩大類：克隆載體和表達載體。其中最常用的是質(zhì)粒載體。（一）概念：1.克隆載體（cloningvector）

都有一個松弛的復制子，能帶動外源基因，在宿主細胞中復制擴增。它是用來克隆和擴增DNA片段（基因）的載體。2.表達載體（Expressionvector）

具有克隆載體的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）還具有轉錄(zhuǎnlù)/翻譯所必需的DNA順序的載體。為了有效的轉錄(zhuǎnlù)，必需有強大的能夠被宿主細胞識別的啟動子，為了實現(xiàn)翻譯，克隆基因必需有合適的SDs和RbS。這樣一個基因表達需要的具有表達和調(diào)控能力的載體稱表達載體。52共一百六十六頁（二）載體的元件及性質(zhì)

克隆(kèlónɡ)載體ori→Amp→Mcs

E.coli表達載體元件P→Rbs/SDs→Mcs→terms

真核表達元件P/E→Mcs→terms→加poly（A）信號克隆載體元件以及性質(zhì)E．coli表達載體哺乳動物質(zhì)粒細胞表達載體1.

Ori能在受體細胞中復制，含有復制位點（起點）2.

Ampr

抗生素抗性基因可以便利加以檢測3.MCS多克隆位點，克隆攜帶外源基因片段4.

載體可導入宿主細胞（生物學/非生物學方法）1.

Ori2.Ampr3.Mcs4.

Promoter5.

SDsRbs6.Terms7.可導入E.coli1.orip在E.coli中能作復制起始位點2.Ampr細菌抗生素抗性基因3.Kanr真核細胞（哺乳類）藥物抗性基因4.Orie真核細胞復制起始位點5.Mcs多克隆位點6.

P/E啟動子/增強子7.

Terms終止信號8.

加poly（A）信號9.

可導入真核細胞（哺乳類）（7－8別為轉錄翻譯終止密碼，真核細胞表達元件。）53共一百六十六頁（三）元件的類別和質(zhì)量：基因工程前考慮的4個問題：

(1)基因工程的目的克隆擴增/表達:①生產(chǎn)產(chǎn)品②基因治療(2)克隆片段的大小運載多大重量的車子。(3)受體細胞類型真核/原核/穿梭。(4)載體本身(běnshēn)及其元件的質(zhì)量不能搞成“豆腐渣工程”，如P要“強大陣容”。54共一百六十六頁1.Ori－復制起始點（origin，ori）（1）決定質(zhì)粒自我增殖和拷貝數(shù)的主要元件。（2）使繁殖后細胞維持一定量的拷貝數(shù)。（3）一般情況下，一個質(zhì)粒只含一個ori，構成(gòuchéng)一個獨立的復制子。（4）穿梭質(zhì)粒含原核和真核生物2個復制子，以確保兩類細胞中都能擴增。（5）基因工程使用松弛復制子，以獲得更多的基因產(chǎn)品。

復制子是一段包括復制起始位點，反式因子作用在內(nèi)的DNA片段，其功能是通過復制使質(zhì)粒能穩(wěn)定存在宿主菌內(nèi)（如E.coli）。松弛復制子的特點①拷貝數(shù)多，10－200個，分子量小。②復制不受宿主細菌復制系統(tǒng)的限制，僅需DDDPI，當宿主蛋白質(zhì)合成受到抑制（如培養(yǎng)中加入氯霉素時）其拷貝數(shù)猛增至1000－3000之多，該性質(zhì)多基因工程技術十分有利。③分子量小，不具備自傳遞能力。④基因工程使用松弛型質(zhì)粒，如含PBMI復制起點的質(zhì)粒。55共一百六十六頁2.抗生素抗性基因：（genotype）編碼產(chǎn)物功能（phenotype）（1）Ampr酶水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。（2）tetr1個膜蛋白可以阻止四環(huán)素進入細胞。（3）camr乙酰轉乙酶生成氯霉素羥乙?；苌铮怪ザ拘?。（4）neor（kanr）氨基(ānjī)糖苷磷酸轉移酶使G418（長那霉素衍生物）失活（5）hygr潮霉素β磷酸轉移酶使潮霉素β失活。56共一百六十六頁3.

MCS——多克隆位點（multiplecloiningsite，MCS）（1）MCS

是多個限制酶識別的一段DNA順序，以便克隆/插入外源基因/DNA片段，與之相關(xiāngguān)概念有：（2）多聚接頭（polyliker）有些質(zhì)粒載體單一切點少，不能普遍使用。為了擴大使用范圍，可以加一段有許多限制酶識別的單一切點的多聚接頭。（3）人工接頭（linker）

是用若干個bp組成的dsDNA片段，一般有一個或以上限制酶識別與切割的順序。(2)與（3）已經(jīng)商品化，注意liker與adaptor的區(qū)別（下述）57共一百六十六頁4，啟動子（pormoter）（1）概念：

①促進DNA轉錄的DNA順序，又稱啟動基因或啟動序列。

②這個DNA區(qū)域(qūyù)常在基因或操縱子編碼順序的上游（up－stream），RNApol結合在上面，指導酶朝向正確的轉錄位置。③啟動子又稱啟動基因，是DNA分子上可以與RNApol特異性結合并使之開始轉錄的部位，但啟動子本身不被轉錄。④DNA分子一個與啟動子基因轉錄有關的區(qū)域，包括RNApol識別，結合和轉錄起始3個功能部位。58共一百六十六頁（2）原核(yuánhé)生物啟動子和真核生物啟動子的比較啟動子功能性質(zhì)：①決定轉錄方向，啟動啟動下游（down－stream）基因互補鏈轉錄，轉錄mRNA與信息鏈一致。②決定dsDNA的哪一條鏈作為模板，轉錄出RNA。③決定轉錄效率，強啟動子轉錄效率強，弱次之。④啟動子是可以接受(jiēshòu)調(diào)控的，可以被改造的。原核生物E.coli啟動子長約40－60bp真核生物啟動子識別位點－35bp（α2ββσ）TATA因子（TFⅡD）先結合TATAbox，再結合RNApol結合位點－10bp（即TATA合）－25bp，富含AT稱為TATA合或Hogness合，與RNApolⅡ結合。起始位點＋1－＋20bp＋1bp，轉錄合成RNA第一個bp的位置（同左）59共一百六十六頁（3）基因工程中常(zhōngcháng)使用強啟動子

表達系統(tǒng)常用啟動子及備注1.Ecoli（1）Lacuv5（乳糖uv5啟動子）（2）trp（色氨酸啟動子）（3）Tac（乳糖色氨酸雜合啟動子）（4）λPL（λphage左向啟動子，包括CI857ts阻遏子）2.酵母（1）己醇脫氨酶啟動子（2）酸性磷酸酶啟動子3.哺乳動物細胞（1）SV40啟動子（帶有增強子）(2)腺病毒晚期啟動子（3）Melallothionen基因啟動子4.昆蟲細胞（1）多角蛋白基因啟動子（2）10K蛋白基因啟動子5.植物（1）花葉菜花葉病毒啟動子（2）Napalin合成酶啟動子（3）微蛋白啟動子。（Tubulin）60共一百六十六頁用于原核(yuánhé)表達系統(tǒng)的強啟動子①Lac→②Lacuv5→③Trp→④Tac→⑤λPL→⑥T7

名稱來源組成正調(diào)控負調(diào)控備注1．LacE.coli乳糖操縱子（1）Pg（啟動基因）；（2）CAP（降解物激活蛋白基因）；（3）O（操縱子）；（4）S（部分β－半乳糖苷酶結構基因）。分解代謝系統(tǒng)：CAP－cAMP－>激活P（啟動子）－>促進轉錄阻遏物－R調(diào)節(jié)基因R編碼產(chǎn)物產(chǎn)生阻遏蛋白－>結合在O上（操縱基因）－>阻止轉錄存在乳糖時－>乳糖－>結合阻遏蛋白－>解除對轉錄阻遏－>開始轉錄2．Lac－uv5是一個突變?nèi)樘遣倏v子IPIG是β－半乳糖苷酶底物類似物－>它能與阻遏蛋白結合－>使O成游離狀態(tài)對分解代謝抑制不敏感－>即使沒有CAP－cAMP－>轉錄照常進行據(jù)報首Lac組建載體在原核細胞表達時IPTG可提高真核基因表達水平50倍。61共一百六十六頁名稱來源組成正調(diào)控負調(diào)控備注3．Trp從E.coli色氨酸操縱子分離（1）Pg（啟動基因）；（2）R（制動基因）；（3）O（操縱基因）；（4）SE（色氨酸Trp部分結構基因）。β－吲哚丙烯酸是Trp的競爭性抑制劑－>它能與阻遏蛋白結合－>阻止了Trp與之結合而活化－>使轉錄進行調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生阻遏蛋白，結合Trp有活性－>再結合在O上阻止轉錄－>缺乏Trp－>阻遏蛋白不能活化－>去阻遏據(jù)報道β－吲哚丙烯酸在轉錄水平至少可以增強50倍↑，另外制動基因缺乏可提高轉錄水平↑8－10倍4．Tac（Trp－Lac）人工構建的Trp＋Lac雜合啟動子（1）tacⅠ=Trp-35+Lac－uv5-20；（2）tacⅡ＝Trp-35＋一個合成的46bp片段；包括pribrow合和LacO（3）tac12＝Trp－35＋Lac－10區(qū)，操縱基因O部分，SD順序融合而成。IPIG誘導受Lac阻遏物的調(diào)控（1）比Lacuv5強7倍；（2）受體菌有RB791，XL－blue，SB221，JM109等。5。T7噬菌體啟動子帶有Lacuv5啟動子控制的T7噬菌體RNApol基因IPIG誘導（1）比Lacuv5強7倍；（2）受體菌有RB791，XL－blue，SB221，JM109等。62共一百六十六頁5.增強子/沉默子（enhancer，E/silencer（negatireenhancer）

（1）概念為真核基因(jīyīn)組（包括真核病毒基因(jīyīn)組）中的一種具有增強鄰近基因(jīyīn)轉錄過程的調(diào)控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。即在所調(diào)控基因(jīyīn)上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子－負增強子，負調(diào)控序列。（2）增強子的作用特點①可在基因的5’或3’端發(fā)揮作用，一般在5’端轉錄起始點上游－100至－300bp處。②

不受序列方向制約；③

通過增強啟動子發(fā)揮作用。（3）增強子的作用機制：①

改變DNA的螺旋結構，使其成柔曲線－>拉近E/P距離；②

為DNA模板提供某一特定空間微環(huán)境－>促進top異構酶改變DNA雙螺旋結構；③

為RNApol和反式作用因子提供一個與順式元件聯(lián)系的結構。如增強子的荃環(huán)利于與反式因子結合。63共一百六十六頁6.

核糖體結合位點/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）

mRNA有核糖體的兩個結合位點，對于原核而言是AUG（起始密碼）和SD序列（位于AUG上游3－11bp處由3－9bp組成的序列。這段序列富含嘌呤(piàolìng)核苷酸，剛好與16sRNA富含嘧啶的序列互補，是RNA識別和結合的位點。由于J.shine－LDagarne（1974）首先發(fā)現(xiàn)，故名。

mRNA5’AGGAGG－UUGACCU－AUG3’AUCCUCC－UAG,rRNA的3’末端（1）翻譯水平的調(diào)控是不嚴格的，只有mRNA/Rbs結合才是蛋白質(zhì)合成的關鍵。（Rbs是E.coli表達載體必不可少的元件）。（2）不同的啟動子表達一種pr.時，SD－AUG之間的距離可能是不一樣的，在試圖提高表達效率，SD－AUG之間的距離是重視的因素之一。64共一百六十六頁7．轉錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子（terminatorotranscrition，termterminatoroftranslation,terminator

codon,stopcodon）：

（1）轉錄終止子/term

指一個基因編碼區(qū)downstream的DNA順序，可被RNApol識別為停止合成mRNA的信號。原核生物中，在轉錄部分末端term常有一個IR和緊接著的一小段，基因轉錄部分之外可能還有影響轉錄終止的順序。值得注意的是：①有些載體不含終止序列，表達外源蛋白質(zhì)時也可獲得較滿意(mǎnyì)的結果（基因轉錄之外順序可影響轉錄終止）；②多數(shù)外源蛋白質(zhì)表達載體帶有合適的終止順序；③轉錄終止順序有長有短，短的長約700－800bp。（2）翻譯終止密碼子/terminatorcodon

mRNA種三個核苷酸順序可終止蛋白質(zhì)的合成，有3種終止碼：UAA（赫石型）UAG（琥珀型）和UAG（空白型）（參nonsensemutationsupperessor。）65共一百六十六頁8．加poly（A）尾信號

結構基因的最后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構成poly（A）加尾信號。mRNA轉錄到此后，產(chǎn)生AAUAAA和隨后的GU或U豐富區(qū)，與RNApol結合的延長因子，可以識別這種結構并與之結合，然后在AAUAAA下游10－30bp的部位切斷RNA，并加上poly（A）尾。

關于7和8，至今，對真核轉錄終止信號/終止機制了解不多,主要困難(kùnnɑn)是難以確定原初轉錄物的3’末端，因為大多數(shù)基因轉錄后很快進行加工?，F(xiàn)在基因工程表達載體使用的轉錄終止子都是病毒基因或細胞基因3’端的一段序列，其中包括3’不翻譯區(qū)，終止位點和poly(A)位點（整段照搬）。66共一百六十六頁第四節(jié)重組DNA技術的基本(jīběn)過程

基因工程包括3個步驟：1．

DNA重組2．

重組DNA導入宿主細胞－克隆擴增或表達3．

基因工程的后處理（down－streamtechniquesofGE）重組DNA技術的基本過程：1．

載體的選擇和制備——分；2．

制備目的基因(jīyīn)片段——切；3．

DNA片段的重組連接——接；4．

重組DNA導入受體細胞——轉；5．

轉化子的篩選——篩；6．

重組子的篩選——篩；7．

重組子的鑒定——鑒；8．

克隆擴增或表達——擴/表達；9．

基因工程的后處理——分。67共一百六十六頁(xbalI)EcoRIEcoRI(HindIII)PUC(xbalI)EcoRI(HindIII)EcoRIEcoRI+EcoRIEcoRIEcoRIEcoRIDigestionwithEcoRIRecoveryofAPPAIDNAframagaroseAPOAIPUCQ-APOAIPBR325-APOAIPUC9PUC9APOAIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIFigure8-3strategyofconstructionofrecombinantpucq