Westernblot實驗技術(shù)培訓課件

Westernblot實驗技術(shù)定義：印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法2Westernblot實驗技術(shù)WesternBlot基本原理

在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。快速、特異，信號弱、昂貴信號強、二抗選擇多，非特異性結(jié)合3Westernblot實驗技術(shù)WesternBlot一般流程SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色蛋白樣品的制備4Westernblot實驗技術(shù)蛋白樣品的制備5Westernblot實驗技術(shù)裂解液只能識別非變性的抗原表位的抗體，不能選擇SDS及強去污劑的裂解液研究蛋白之間相互作用，應選擇溫和非變性裂解液對于難溶解蛋白，應選用裂解強度更高的裂解液（如RIPA,SDS)6Westernblot實驗技術(shù)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：SDS是一種離子性的界面活性劑,它有強離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當SDS與蛋白質(zhì)混合時,它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS的平均結(jié)合量是1:1.4(以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之SDS後,由於SDS帶強負價,使蛋白質(zhì)原先的帶電價微不足道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價一致(chargedensity),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素7Westernblot實驗技術(shù)丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺

SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過硫酸銨(時間)Tris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份8Westernblot實驗技術(shù)凝膠濃度與蛋白分離范圍9Westernblot實驗技術(shù)10Westernblot實驗技術(shù)安裝玻璃板對齊、加緊配膠混勻、不要過度，防止氧化11Westernblot實驗技術(shù)12Westernblot實驗技術(shù)轉(zhuǎn)膜NC膜PVDF膜結(jié)合能力80-110ug/cm2125-200ug/cm2材料質(zhì)地脆韌性好溶劑耐受性無有操作程序緩沖液潤濕100%甲醇潤濕價格便宜較貴大于20KD—0.45um小于20KD—0.2um小于7KD—0.1um13Westernblot實驗技術(shù)不能有氣泡不要污染膜的表面注意正負極冰浴冷卻濕轉(zhuǎn)15Westernblot實驗技術(shù)半干轉(zhuǎn)不能有氣泡濾紙、膠、膜大小要一致，否則容易短路，產(chǎn)熱16Westernblot實驗技術(shù)封閉脫脂奶粉（5％）BSAWesternBlot膜封閉液（生物試劑公司提供）17Westernblot實驗技術(shù)一抗、二抗孵育把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育。37℃一小時，4℃過夜。倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，37℃一小時，4℃過夜。倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次10min。18Westernblot實驗技術(shù)二抗與底物反應顯色辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學發(fā)光顯色法(HRP)DAB顯色法：方便、經(jīng)濟，反應慢、不易保存、不能重新剝離檢測ECL發(fā)光法：靈敏、快速、反應快、能重新剝離檢測19Westernblot實驗技術(shù)WesternBlot常見問題分析20Westernblot實驗技術(shù)SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入APS和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對齊21Westernblot實驗技術(shù)條帶比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適22Westernblot實驗技術(shù)轉(zhuǎn)膜及抗體檢測凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個或多個白點？轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？

可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長期使用導致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的濾紙確保膜和膠塊之間沒有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫23Westernblot實驗技術(shù)背景太高膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應抗體濃度過高

原因?qū)Σ咿D(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度24Westernblot實驗技術(shù)沒有陽性條帶或比較弱抗體染色不充分靶蛋白含量太低HRP抑制劑轉(zhuǎn)膜時間不夠曝光時間過短

原因?qū)Σ咴黾涌贵w滴度，延長孵育時間增加樣本上樣量所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉大分量蛋白相應增加轉(zhuǎn)膜時間及曝光時間25Westernblot實驗技術(shù)彌散性條帶或非特異性條帶抗體濃度太高蛋白上樣量太多交叉反應

原因?qū)Σ呓档涂贵w濃度降低樣本上樣量26Westernblot實驗技術(shù)EnjoyExperiment,EnjoyLife27Westernblot實驗技術(shù)Westernblot實驗技術(shù)定義：印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法29Westernblot實驗技術(shù)WesternBlot基本原理

在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。快速、特異，信號弱、昂貴信號強、二抗選擇多，非特異性結(jié)合30Westernblot實驗技術(shù)WesternBlot一般流程SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色蛋白樣品的制備31Westernblot實驗技術(shù)蛋白樣品的制備32Westernblot實驗技術(shù)裂解液只能識別非變性的抗原表位的抗體，不能選擇SDS及強去污劑的裂解液研究蛋白之間相互作用，應選擇溫和非變性裂解液對于難溶解蛋白，應選用裂解強度更高的裂解液（如RIPA,SDS)33Westernblot實驗技術(shù)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：SDS是一種離子性的界面活性劑,它有強離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當SDS與蛋白質(zhì)混合時,它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS的平均結(jié)合量是1:1.4(以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之SDS後,由於SDS帶強負價,使蛋白質(zhì)原先的帶電價微不足道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價一致(chargedensity),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素34Westernblot實驗技術(shù)丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺

SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過硫酸銨(時間)Tris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份35Westernblot實驗技術(shù)凝膠濃度與蛋白分離范圍36Westernblot實驗技術(shù)37Westernblot實驗技術(shù)安裝玻璃板對齊、加緊配膠混勻、不要過度，防止氧化38Westernblot實驗技術(shù)39Westernblot實驗技術(shù)轉(zhuǎn)膜NC膜PVDF膜結(jié)合能力80-110ug/cm2125-200ug/cm2材料質(zhì)地脆韌性好溶劑耐受性無有操作程序緩沖液潤濕100%甲醇潤濕價格便宜較貴大于20KD—0.45um小于20KD—0.2um小于7KD—0.1um40Westernblot實驗技術(shù)不能有氣泡不要污染膜的表面注意正負極冰浴冷卻濕轉(zhuǎn)42Westernblot實驗技術(shù)半干轉(zhuǎn)不能有氣泡濾紙、膠、膜大小要一致，否則容易短路，產(chǎn)熱43Westernblot實驗技術(shù)封閉脫脂奶粉（5％）BSAWesternBlot膜封閉液（生物試劑公司提供）44Westernblot實驗技術(shù)一抗、二抗孵育把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育。37℃一小時，4℃過夜。倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，37℃一小時，4℃過夜。倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次10min。45Westernblot實驗技術(shù)二抗與底物反應顯色辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學發(fā)光顯色法(HRP)DAB顯色法：方便、經(jīng)濟，反應慢、不易保存、不能重新剝離檢測ECL發(fā)光法：靈敏、快速、反應快、能重新剝離檢測46Westernblot實驗技術(shù)WesternBlot常見問題分析47Westernblot實驗技術(shù)SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入APS和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對齊48Westernblot實驗技術(shù)條帶比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適49Westernblot實驗技術(shù)轉(zhuǎn)膜及抗體檢測凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個或多個白點？轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？

可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長期使用導致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的濾紙確保膜和膠塊之間沒有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫50Westernblot實驗技術(shù)背景太高膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應抗體濃度過高

原因?qū)Σ咿D(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度5