現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù).ppt

1、分子生物學(xué)研究方法,基因操作,核心技術(shù),（一）三大成就 ：,1、 40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；,一、發(fā)展歷程及基礎(chǔ),2. 50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；,Rosalind Franklin,3. 50年代末至60年代，相繼提出了中心法則和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。,Jacob and Monod,（二）兩大技術(shù)保證：,1.DNA的體外切割和連接,1962年Arber 發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，1967Gellert發(fā)現(xiàn)了 DNA

2、 連接酶,2. DNA的核苷酸序列分析技術(shù),二、 DNA操作技術(shù),（一） 核酸的凝膠電泳,基本原理：一種分子被放置到電場中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O，這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比,與分子的摩擦系數(shù)成反比,DNA和RNA被稱為多聚陰離子（polyanions），核酸分子放置在電場當(dāng)中，會(huì)向正電極的方向遷移。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。,大分子量的DNA 移動(dòng)的慢,小分子量的DNA 移動(dòng)的快,電泳緩沖液,陽極,陰極,DNA加樣孔,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范

3、圍為0.250kb之間,聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠分辨范圍為1到1000個(gè)堿基對之間,凝膠濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)；反之濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。,在紫外線的照射下結(jié)合溴化乙錠（簡稱EtBr）的DNA分子發(fā)出熒光,每條DNA帶中僅含有0.05g的微量DNA也可以被清晰地檢測出來。,稱樣,溶解,加熱,制板,倒膠,電泳操作基本程序,取樣,點(diǎn)樣,電泳,檢測,結(jié)果分析,（二） 核酸的分子雜交,將帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應(yīng)的同源區(qū)段就會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如果退火的核酸來自不同的生物有機(jī)體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。

4、DNA/DNA 或DNA/RNA,不同溫度下DNA的構(gòu)型變化,在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都必須通過毛細(xì)管或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地“吸印”上去的，因此，核酸雜交也被稱為“印跡雜交”。,材料：尼龍濾膜 、硝酸纖維素濾膜 、二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）,步驟： 第一，將分離的核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上核酸印跡轉(zhuǎn)移、電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法、菌落和噬菌斑印跡法; 第二，是將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交,Southern Blotting的過程 （1）堿變性的瓊脂糖凝膠電

5、泳分離的DNA （2）通過電泳液的移動(dòng)轉(zhuǎn)移膠中的DNA （3）固定膠中的DNA （4）預(yù)雜交和雜交（放射性和熒光檢測） （5）結(jié)果檢測,1、Southern Blotting（DNA印跡技術(shù)）,常用的熒光染料：C5、C3等,2.Northern blotting（RNA印跡技術(shù)） 是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。,3.Western blotting（蛋白質(zhì)雜交技術(shù)）,將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)。,主要步驟： 蛋白質(zhì)樣品的制備 SDS-聚丙烯酰胺凝膠(P

6、AGE)電泳 蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移：硝酸纖維素濾膜 靶蛋白的免疫學(xué)檢測,Step 1.靶蛋白于第一抗體（一抗）反應(yīng),Step 2.與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)二抗）反應(yīng),Step 3.顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng),4、原位雜交（in situ hybridization ）,將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交。 特點(diǎn): 能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究 不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對含量極低的靶序列靈敏度高 能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài),核酸原位雜交的基本步驟,細(xì)胞或組織的固定：載玻片 組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理: 用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì) 探針的選擇和標(biāo)記 雜交 雜交

7、結(jié)果檢測,檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù),5、探針的標(biāo)記,探針的種類:根據(jù)核酸的性質(zhì)，可分為DNA和RNA探針;根據(jù)是否使用放射性標(biāo)記物的與否,可分為放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針;根據(jù)是否存在互補(bǔ)鏈,可分為單鏈和雙鏈探針;根據(jù)放射性標(biāo)記物摻入情況,可分為均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記探針。,標(biāo)記物:核素標(biāo)記物（同位素標(biāo)記）：32P、35S、3H等 非核素標(biāo)記物（非同位素標(biāo)記）：生物素、地高辛、熒光素,缺口平移法,（1）雙鏈DNA探針,當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時(shí),E.coli DNA聚合酶就可將核苷酸連接到切口的3羥基末端。 同時(shí)該酶具有從53的核酸外切酶活性,能從切口的5端除去核苷酸。 由于在

8、切去核苷酸的同時(shí)又在切口的3端補(bǔ)上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動(dòng),用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素?fù)饺氲胶铣尚骆溨小?最合適的切口平移片段一般為50-500個(gè)核苷酸。,隨機(jī)引物法,隨機(jī)引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結(jié)合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探針。產(chǎn)物平均長度為400-600個(gè)核苷酸。,（2）單鏈DNA,從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針 從RNA合成單鏈cDNA探針,（3）寡核苷酸探針 （4）末端標(biāo)記DNA探針 （5）RNA探針,從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針,從RNA合成單鏈cDNA探針,所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕

9、獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。 提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。 處于能夠接受外源DNA狀態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。,（三） 細(xì)菌轉(zhuǎn)化,步驟：,1.將快速生長中的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會(huì)造成細(xì)胞膨脹（形成原生質(zhì)球）。,2.與轉(zhuǎn)化混合物中的外源DNA形成粘附在細(xì)胞表面的復(fù)合物。 3.立即將該體系轉(zhuǎn)移到42下做短暫的熱刺激，復(fù)合物便會(huì)被細(xì)胞所吸收。 4.在全培養(yǎng)基中生長一段時(shí)間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)、細(xì)胞活性恢復(fù) 5. 涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。,（四）基因擴(kuò)增,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即PCR

10、技術(shù)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。,1、 基本原理 ：PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。,模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右,一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；,模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；,引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA互補(bǔ)的鏈。,第一

11、次PCR 循環(huán)的結(jié)果是產(chǎn)生兩個(gè)靶序列的復(fù)制。,2、PCR反應(yīng)五要素： 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+,（1）PCR引物設(shè)計(jì),一對引物，與3端互補(bǔ) 長度：1530個(gè)核苷酸 堿基分布隨機(jī) 引物內(nèi)、引物間不應(yīng)有互補(bǔ)序列 引物與非特異擴(kuò)增區(qū)無同源性 3端必須互補(bǔ) 5端可游離 引物濃度一般為0.1 0.5mol/L,（2）DNA 聚合酶,在核苷酸底物的存在下，以一條DNA鏈為模板催化新鏈的合成 需要具有 3 -OH 的引物 具有 5 到3 方向聚合的能力 通常具有 3到 5 外切酶活性 Taq DNA聚合酶在7080具有最高聚合活性,(3)鎂離子濃度: Taq酶活性需要Mg2+ ，Mg2+濃度過高導(dǎo)

12、致非特異擴(kuò)增，一般常用1.5mmol/L,(4)底物濃度:dNTP濃度在20200 mol/L，四種dNTP必須濃度相等,(5)PCR反應(yīng)的緩沖溶液 : 提供合適的酸堿度和某些離子：1050mmol/L Tris-HCl緩沖液、50mmol/L KCl、明膠,PCR儀,（五） 核苷酸序列分析,1. Sanger雙脫氧鏈終止法(dideoxy-termination sequencing) 原理：雙脫氧（2，3）-核苷酸可以象2-脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因3 端不具OH基，DNA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個(gè)DNA分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不同長度的DNA片段測定

13、出核苷酸序列。,不能和下一個(gè)核苷酸通過磷酸二酯鍵連接起來,添加 DNA polymerase 所有4 dNTPs 其中一種標(biāo)記的ddNTP,在四個(gè)不同的反應(yīng)管中各只包含一種ddNTP.,每一管中的復(fù)制的序列都停留在ddNTPs 處,5,反應(yīng)終止后，四個(gè)反應(yīng)管中的反應(yīng)混合液分別進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離. 這四個(gè)反應(yīng)管中延伸的寡核苷酸僅相差一個(gè)堿基. 電泳結(jié)構(gòu)通過顯色指示.,3 C C T T T A G C T 5,過程：制備ss-DNA與引物退火分為4個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)每個(gè)系統(tǒng)中加入dNTP（其中dATP常帶同位素標(biāo)記）和一種雙脫氧核苷酸DNA聚合酶定序反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物變性后電泳凝膠干燥放射自顯影（該法

14、亦適合mRNA的序列分析） 。 GC富集區(qū)常出現(xiàn)“隱影”或“停止”現(xiàn)象，如在反應(yīng)中加入dITP（脫氧三磷酸次黃嘌呤）或脫氧三磷酸-7-脫氧鳥苷可解決GC富集區(qū)的測序。,1）模板制備:可自動(dòng)化 2）定序反應(yīng):可自動(dòng)化 3）凝膠電泳:自動(dòng)化有一定困難 4）核苷酸序列閱讀與計(jì)算機(jī)輸入:可自動(dòng)化,2. DNA序列測定的自動(dòng)化,1. 凝膠阻滯試驗(yàn):凝膠阻滯試驗(yàn)（gel retardation assay），又叫作DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)（DNA mobility shift assay），是用于體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。,（六）DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究,在凝膠電泳中，由于電場

15、的作用，裸露的DNA朝正電極移動(dòng)的距離與其分子量的對數(shù)成反比。如果此時(shí)DNA分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合，那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會(huì)受到阻滯，在特定電壓和時(shí)間內(nèi)朝正電極移動(dòng)的距離也就相應(yīng)縮短了。,凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的基本原理圖,放射自顯影,*,*,*,*,凝膠電泳,放射性標(biāo)記的DNA,細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物,蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合,*,*,*,*,*,*,B,DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合物電泳遷移緩慢,滯后帶表明DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合,在DNaseI足跡試驗(yàn)（DNA foot-printing assay）過程中，首先將待檢測的雙鏈DNA分子用32P作末端標(biāo)記，并用限制性內(nèi)切酶去掉其中的一個(gè)末端，得到只有一條

16、鏈的單個(gè)末端標(biāo)記的雙鏈DNA分子，與細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物混合。 待二者結(jié)合之后，再加入少量的DNaseI（它可沿著靶DNA作隨機(jī)單鏈切割）消化DNA分子，并控制酶的用量使之達(dá)到平均每條DNA鏈只發(fā)生一次磷酸二酯鍵斷裂。,2. DNaseI足跡試驗(yàn),如果蛋白質(zhì)提取物中不存在與DNA結(jié)合的特異蛋白質(zhì)，經(jīng)DNaseI消化之后便會(huì)產(chǎn)生出距放射性標(biāo)記末端1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)核苷酸等等一系列前后長度均僅相差一個(gè)核苷酸的連續(xù)的DNA片段梯度群體。 如果有一種蛋白質(zhì)已經(jīng)結(jié)合到DNA分子的某一特定區(qū)段上，那么，它就將保護(hù)這一區(qū)段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不可能產(chǎn)生出相應(yīng)長度的切割條帶。在電泳凝膠的放射

17、自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位是沒有放射標(biāo)記條帶的，出現(xiàn)了一個(gè)空白的區(qū)域，人們形象地稱之為“足跡”。,32p,1 5 10,*,1 4 8 10,*,加入蛋白質(zhì)X,加入DNaseI凝膠電泳放射自顯影,1,5,10,A B,足跡,(a),(c),(b),DNaseI 足跡實(shí)驗(yàn),作業(yè)：,1、凝膠電泳的原理是什么？有哪兩種，分辨范圍各是多少？凝膠的濃度和分辨率的關(guān)系是什么？ 2、什么是核酸分子雜交？幾種雜交方法的過程各是什么？ 3、探針的類型有哪些？敘述一種探針的制作過程。 4、什么是細(xì)菌轉(zhuǎn)化？其步驟如何？ 5、什么是基因體外擴(kuò)增？步驟如何？ 6、Sanger雙脫氧鏈終止法的原理和過程各是什么

18、？,（七）實(shí)時(shí)熒光定量PCR,定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法 。,實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹：,1、SYBR Green I法：SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈的小溝部位結(jié)合的熒光染料。,基本過程是： 開始反應(yīng)，當(dāng)SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。 DNA變性時(shí)，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。 在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。 聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。 因此，在一個(gè)體系內(nèi)，

19、其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。,2、TaqMan探針技術(shù),TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的5 3外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。,在TaqMan探針法的定量PCR反應(yīng)體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。 探針的5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R) ，3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher, Q) 。 當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中

20、遇到與模板結(jié)合的探針，其5 3外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)。 每經(jīng)過一個(gè)PCR循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長的過程。信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行定量分析：,CT值定義為在基線上方產(chǎn)生可檢測到的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的熒光發(fā)射時(shí)所對應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù),確定未知樣品的 C(t)值后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量,通過一系列酶作用，使總mRNA轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌寄主菌株細(xì)胞，構(gòu)成包含所有基因編碼序列的cDNA基因文庫。,（八） RNA

21、基本操作技術(shù),1、總RNA的提取,Trizol試劑(苯酚-異硫氰酸胍）提取法： 液氮研磨材料，勻漿，加入Trizol試劑進(jìn)一步破碎細(xì)胞并溶解細(xì)胞成分； 加入氯仿抽提、離心，分離水相和有機(jī)相，收集含有RNA的水相，通過異丙醇沉淀，獲得比較純的mRNA； 通過OD260和OD280測定RNA的純度和濃度，并用含有甲醛的凝膠電泳檢測RNA.,2、mRNA的純化,寡聚-纖維素柱色譜法； Promega公司的PolyAT Ttract mRNA 分離系統(tǒng),將用生物素標(biāo)記的寡聚(dT)引物與細(xì)胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強(qiáng)力微磁球相連的m

22、RNA。,3、cDNA的合成,第一鏈的合成：以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，由反轉(zhuǎn)錄酶催化，并由oligodT作引物。 OligodT引物由1220個(gè)dT構(gòu)成，后面加上一個(gè)具有Xho等酶切位點(diǎn)的連接引物。,在cDNA 合成過程中，應(yīng)選用活性較高的反轉(zhuǎn)錄酶及甲基化dCTP，保證新合成的cDNA鏈被甲基化修飾，以防止構(gòu)建克隆時(shí)被限制性內(nèi)切酶切割； cDNA兩端應(yīng)加上不同內(nèi)切酶所識(shí)別的接頭序列，保證所獲得雙鏈cDNA的方向性。,第二鏈的合成：以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化，以RNaseH切割雜合鏈中的mRNA序列產(chǎn)生的小片斷為引物，由DNA連接酶連接成完整的DNA鏈。 同時(shí)加入另一個(gè)酶切位點(diǎn)

23、的黏性接頭（EcoR)，與cDNA連接后用Xho酶切。,4、cDNA文庫的構(gòu)建：基因重組,5、基因文庫的篩選： 核酸雜交法 PCR篩選法 免疫篩選法,（九）SNP的理論與應(yīng)用,單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。,通常所說的SNP都是二等位多態(tài)性的，這種變異可能是轉(zhuǎn)換（C T，在其互補(bǔ)鏈上則為G A），也可能是顛換（C A，G T，C G，A T），具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3； 轉(zhuǎn)換的幾率之所以高，可能是因?yàn)镃pG二核苷酸上的胞嘧啶殘基是人類基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其

24、中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。,1、根據(jù)SNP在基因組中的分布位置可分為：,基因調(diào)控區(qū)SNP(pSNP)； 基因間隨機(jī)非編碼區(qū)SNP(rSNP)； 基因編碼區(qū)SNP(cSNP)。,基因編碼區(qū)SNP(cSNP)分為兩種：,一種是同義cSNP（synonymous cSNP），即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同； 另一種是非同義cSNP（non-synonymous cSNP），指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能 。,2、SNP的特點(diǎn):,密度高：SNP在人類基因組的平均密

25、度估計(jì)為3001000 bp,在整個(gè)基因組的分布達(dá)3 106 個(gè), 遺傳距離為2-3cm,密度比微衛(wèi)星標(biāo)記更高,可以在任何一個(gè)待研究基因的內(nèi)部或附近提供一系列標(biāo)記。 富有代表性：某些位于基因內(nèi)部的SNP 有可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平,因此它們可能代表疾病遺傳機(jī)理中的某些作用因素。,遺傳穩(wěn)定性：與微衛(wèi)星等重復(fù)序列多態(tài)性標(biāo)記相比, SNP具有更高的遺傳穩(wěn)定性。 易實(shí)現(xiàn)分析的自動(dòng)化：SNP 標(biāo)記在人群中只有兩種等位型(allele), 故也稱為雙等位標(biāo)記(biallelic marker)。這樣在檢測時(shí)只需一個(gè) +/- 或 全/無 的方式, 而無須象檢測限制性片段長度多態(tài)性, 微衛(wèi)星那樣對片段

26、的長度作出測量, 這使得基于SNP 的檢測分析方法易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。,3、SNP的檢測分析技術(shù),（1）基因芯片技術(shù)(gene chips) 基因芯片又稱DNA芯片(DNAchips )或生物芯片(biological chips)，是用標(biāo)記的探針與特定的DNA 樣品雜交,然后通過檢測雜交信號(hào)的強(qiáng)弱判斷樣品中靶分子的數(shù)量。,基因芯片檢測技術(shù)的主要過程:,首先, 用生物素標(biāo)記擴(kuò)增后的靶序列或樣品, 然后再與芯片上大量的探針進(jìn)行雜交; 其次, 用含鏈霉素的熒光素作為顯色物質(zhì), 圖像的分析則用激光共聚焦顯微鏡或其他熒光顯微鏡對片基掃描, 由計(jì)算機(jī)搜集熒光信號(hào), 并對每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度數(shù)字化后進(jìn)行分析。,（2

27、）Taqman技術(shù),利用Taq酶的5 核酸外切酶活性, 切割與PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合的DNA 探針,此探針帶有一個(gè)供體-受體熒光染料對,兩者能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET )。Taq 酶切割使供體染料與淬滅的受體染料分離,結(jié)果使供體染料的熒光極大增強(qiáng)。,（3）分子信標(biāo)技術(shù),供體和受體熒光染料分別位于有互補(bǔ)序列的探針兩側(cè),當(dāng)未與靶序列雜交時(shí), 探針形成一個(gè)發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu),使供體- 受體染料對相互靠近而產(chǎn)生淬滅。反之,探針與正確的靶序列雜交時(shí), 染料對分離,熒光信號(hào)可增強(qiáng)至900 倍。,（4）焦磷酸測序法,是一項(xiàng)全新的DNA測序技術(shù)，可以快速、準(zhǔn)確地測定一段較短的目標(biāo)片段。其基本原理如下： 第1步：一

28、個(gè)特異性的測序引物和單鏈DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)。,第2步：向反應(yīng)體系中加入1種dNTP，如果它剛好能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對，則會(huì)在DNA 聚合酶的作用下，添加到測序引物的3末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸(PPi)。,第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP；在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光。通過CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個(gè)特異的檢測峰，峰值的高低則和

29、相匹配的堿基數(shù)成正比。,第4步：反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。,第5步：加入另一種dNTP，使第24步反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。,（十）基因克隆技術(shù),1、RACE技術(shù)：在已知cDNA序列的基礎(chǔ)上克隆5端或3端缺失序列的技術(shù)。 （1）獲得高質(zhì)量總RNA； （2）去磷酸化作用； （3）去掉mRNA的5帽子結(jié)構(gòu)，并以RNA連接酶連接上特異RNA寡聚接頭；,（4）以特異性寡聚dT為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成第一條cDNA鏈； （5）分別以第一條cDNA鏈為模板進(jìn)行RACE反應(yīng)； （6）將純化后的PCR產(chǎn)物克隆到載體DNA

30、中，進(jìn)行序列分析。,2、 克隆基因的分離,（1）應(yīng)用核酸探針分離克隆目的基因 把基因文庫轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，就可以與特異性的核酸探針進(jìn)行菌落或噬菌斑雜交，以便篩選出具有目的基因的陽性克隆，這個(gè)過程叫作克隆基因的分離或篩選。 應(yīng)用核酸探針分離目的基因的方法叫作核酸雜交篩選法。,（2） 應(yīng)用cDNA差示分析法克隆基因,RDA法充分發(fā)揮了PCR以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈DNA模板的特性，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴(kuò)增了目的基因片段。因?yàn)樵囼?yàn)對象（Tester）和供試探針（Driver）在接受差示分析前均經(jīng)一個(gè)4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群（re

31、presentation），保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。,（3） 基因的圖位克隆法,首先，將目的基因定位到某個(gè)染色體的特定位點(diǎn)，并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標(biāo)記。 其次，通過對許多不同的生態(tài)型及大量限制性內(nèi)切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標(biāo)記，通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個(gè)標(biāo)記之間的基因片段克隆并分離出來。 然后，根據(jù)基因功能互作原理鑒定目的基因。在RFLP作圖中，連鎖距離是根據(jù)重組率來計(jì)算的，1cm（厘摩）相當(dāng)于1%的重組率。,（十一）基因敲除技術(shù),基因敲除是自80年代末以來發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，是通過一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失

32、的技術(shù)。 通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。,1、完全基因敲除,指通過同源重組法完全消除細(xì)胞或者動(dòng)物個(gè)體中的靶基因的活性的基因敲除。 實(shí)驗(yàn)室采用取代型或插入型載體在ES細(xì)胞中根據(jù)正負(fù)雙向選擇原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：,正向選擇基因neo通常被插入到載體靶DNA功能最關(guān)鍵的外顯子中或通過同源重組法置換靶基因的功能區(qū)，其功能是： 形成靶位點(diǎn)的插入突變； 作為正向篩選標(biāo)記。 負(fù)向選擇基因HSV-tk置于目的基因外側(cè)，含有該基因的重組細(xì)胞不能在選擇培養(yǎng)基上生長。,完全基因敲除動(dòng)物模型的基本步驟：,基因載體的構(gòu)建：把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異

33、片段同源的DNA 分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo 基因，TK 基因等)的載體上，成為重組載體。 ES細(xì)胞的獲得：現(xiàn)在基因敲除一般采用是鼠胚胎干細(xì)胞。常用的鼠的種系是1及其雜合體，因?yàn)檫@類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。,同源重組：將重組載體通過一定的方式(電穿孔法或顯微注射)導(dǎo)入同源的胚胎干細(xì)胞(ES cell)中，使外源DNA 與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA 序列整合到內(nèi)源基因組中，從而得以表達(dá)。 選擇篩選已擊中的細(xì)胞：正負(fù)篩選法（PNS法），,表型研究：通過觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進(jìn)而了解目的基因變化前后對小

34、鼠的生物學(xué)形狀的改變，達(dá)到研究目的基因的目的。 得到純合體：由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體上中一條染色體中，所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進(jìn)行至少兩代遺傳。,2、條件性基因敲除法,將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。 是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶Cre介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，在對小鼠基因修飾的時(shí)空范圍上設(shè)置一個(gè)可調(diào)控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時(shí)間處于一種可控狀態(tài)。,利用Cre/LoxP 和來自酵母的FLPfrt 系統(tǒng)可以研究特定組織器官或特定細(xì)胞中靶基因滅活所導(dǎo)致的表型; 通過常規(guī)基因打靶在基因組的靶位點(diǎn)上裝上兩個(gè)同向排列的1oxP，并以此兩側(cè)裝接上loxP 的(“l(fā)oxP floxed”)ES 細(xì)胞產(chǎn)生“l(fā)oxP floxed”小鼠; 然后，通過將“l(fā)oxP floxed”小鼠與Cre轉(zhuǎn)基因鼠雜交產(chǎn)生靶基因發(fā)生特定方式(如特定的組織特異性)修飾的條件性突變小鼠;,在“l(fā)oxP floxed”小鼠，雖然靶基因的兩側(cè)已各裝上了一個(gè)loxP，但靶基因并沒有發(fā)生其他的變化，故“1oxP floxed”小鼠表型仍同野生型的一樣; 但當(dāng)它與Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交時(shí)，產(chǎn)生的子代中將同