島津液相色譜儀教材.ppt

1、島津液相色譜儀基礎(chǔ)知識(shí),島津企業(yè)管理（中國）有限公司 分析儀器事業(yè)部 分析中心,島津HPLC的歷史,Started in 1969,1969,1972,1978,1981,1982,1984,1991,1997,2000,2004,2010,2010,GPC系統(tǒng)開發(fā),LC-1（LC-830）銷售,LC-3A系列銷售,LC-4A系列銷售,LC-5A系列銷售,LC-6A系列銷售,LC-10A系列銷售,LC-VP系列銷售,LC-2010銷售,LC-20A Prominence銷售,LC-15C銷售,LC-30A Nexera銷售,與DuPont簽訂許可合同后制造銷售,CDQR方式的單柱塞型送液?jiǎn)卧獮?/p>

2、特征,內(nèi)置微型計(jì)算機(jī)的全自動(dòng)HPLC,世界上首創(chuàng)的微量型LC對(duì)應(yīng)HPLC,世界上最早的積木型HPLC、現(xiàn)在的HPLC的前身,世界上最早采用微沖程送液?jiǎn)卧蜏p低噪音技術(shù)的檢測(cè)器,采用有效性支持功能的積木型HPLC,追求性能和操作性更加完善的一體型HPLC,為分析實(shí)驗(yàn)室?guī)砀镄碌腍PLC ,為了讓LC分析更為便捷,130MPa耐壓系統(tǒng)，低系統(tǒng)容量，高溫分析和樣品自動(dòng)前處理,在售產(chǎn)品,島津HPLC的歷史,2000,1997,THECNLOGY BREAKTHROUGH,Flexible HPLC System with Micro-stroke Volume Solvent Delivery Uni

3、t,THECNLOGY BREAKTHROUGH,LC-2010,LC-VP,2008,2004,THECNLOGY BREAKTHROUGH,THECNLOGY BREAKTHROUGH,2010,THECNLOGY BREAKTHROUGH,2010,THECNLOGY BREAKTHROUGH,LC-20A Prominence,UFLC Prominence,LC-15C Essentia,UHPLC LC-30A Nexera,LC-20A Prominence,基礎(chǔ)知識(shí)講解內(nèi)容,1、色譜基礎(chǔ)知識(shí),2、硬件基礎(chǔ)知識(shí),3、定量基礎(chǔ)知識(shí),4、維護(hù)基礎(chǔ)知識(shí),第一部分,色譜基礎(chǔ)知識(shí),色譜起源

4、,石油醚,色譜,色素混合物,碳酸鈣顆粒,分離組分,色譜發(fā)展史,20世紀(jì)初，俄國植物學(xué)家M.S. Tswett提出經(jīng)典液相色譜法；,20-30年代，柱分配色譜和紙色譜；,50年代，氣相色譜，薄層色譜；,60年代，凝膠滲透色譜及高效液相色譜；,70年代，高效毛細(xì)管氣相色譜法；,80年代，電色譜；,90年代，光色譜。,色譜定義,色譜法：利用組分在兩相間分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的技術(shù) 流動(dòng)相：攜帶樣品流過整個(gè)系統(tǒng)的流體 固定相：靜止不動(dòng)的一相，色譜柱,色譜是一種分離技術(shù) 色譜的主要目的是對(duì)混合物中的目標(biāo)物 分離和定量,Ethyl Paraben,Propyl Paraben,Methyl Paraben

5、,Butyl Paraben,2.5,3.0,mV,500,400,300,200,100,0,0.0,0.5,1.0,1.5,2.0,min,色譜分類,高效液相色譜,High Performance Liquid Chromatography (HPLC),氣相色譜,Gas Chromatography (GC),薄層色譜,Thin-Layer Chromatography (TLC),毛細(xì)管電泳,Capillary Electrophoresis (CE),HPLC vs GC,液相色譜：,以液體作為流動(dòng)相的色譜分離方法,適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性 和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析 流動(dòng)相具有

6、運(yùn)載樣品分子和選擇 性分離的雙重作用,氣相色譜：,以氣體作為流動(dòng)相的色譜分離方法,適用于沸點(diǎn)較低、熱穩(wěn)定性好的中小分子 化合物的分析 流動(dòng)相只起運(yùn)載樣品分子的能力,HPLC簡(jiǎn)易流程圖,輸液泵,進(jìn)樣器,柱溫箱,檢測(cè)器,色譜柱,儲(chǔ)液瓶,數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),HPLC特點(diǎn),分離性能好,-910-12 g）靈敏度高（10,選擇性高（同分異構(gòu)，旋光異構(gòu)）,分析速度快,進(jìn)樣量?。?-100 L）,HPLC分類,反相色譜（reversed phase chromatography）,離子對(duì)色譜（ion-pair chromatography）,正相色譜（normal phase chromatography）,離子

7、交換色譜（ion exchange chromatography）,尺寸排阻色譜（GPC / GFC）,反相色譜,流動(dòng)相的極性大于固定相的極性,C18 (ODS) C8 (octyl) C4 (butyl),苯基 TMS,氰基,非極性,-O-Si(CH3)2-C18H37,SiO2,相互作用力是什么,疏水性,OH,C18 (ODS),SiO2,強(qiáng) OH,弱,疏水性,如果樣品有, CH3CH2CH2,碳鏈,作用力強(qiáng),芳香基,如果樣品有, COOH 羧基 NH2 氨基 OH 羥基,作用力弱,反相色譜流動(dòng)相的選擇,優(yōu)化水相（緩沖液）和有機(jī)相的比例非常重要,甲醇、乙腈和THF是常用的有機(jī)溶劑。,在有緩

8、沖液的情況下，緩沖液的濃度和pH值 非常重要。,流動(dòng)相極性變化對(duì)分離的影響,20 % 水,30 % 水,40% 水,1: 2: 3: 4:,對(duì)羥基苯甲酸甲酯 對(duì)羥基苯甲酸乙酯 對(duì)羥基苯甲酸丙酯 對(duì)羥基苯甲酸丁酯,有機(jī)相: 甲醇,固定相極性變化對(duì)分離的影響,C8,SiO2,C18 (ODS),一般,樣品,SiO2,強(qiáng),樣品,C4,SiO2,弱 樣品,固定相極性變化對(duì)分離的影響,ODS,C8,TMS,分析條件 柱: Shim-pack CLC-ODS 流動(dòng)相: MeOH : H2O = 7:3 流速: 1.0 mL/min 溫度: 40 進(jìn)樣體積: 10 L 檢測(cè)器: UV-254 nm,色譜峰

9、1. 苯甲酸甲酯 2. 苯甲酸乙酯 3. n-苯甲酸丙酯 4. n-苯甲酸丁酯,反相離子對(duì)色譜,原理,固定相,流動(dòng)相,樣品離子與流動(dòng)相中離子對(duì)試劑的反離子生成疏水,性離子對(duì)，而為反相色譜固定相保留。,疏水性的苯乙烯/二乙烯基苯樹脂或鍵合的硅膠,水（緩沖液）+ 離子對(duì)試劑 + 有機(jī)溶劑,所帶電荷與待測(cè)離子相反,離子對(duì)試劑,常用離子對(duì)試劑,陰離子化合物, 氫氧化四丁基銨 溴化四丁基銨,陽離子化合物, 丁烷基磺酸鈉 戊烷基磺酸鈉 己烷基磺酸鈉 庚烷基磺酸鈉 辛烷基磺酸鈉 癸烷基磺酸鈉 十二烷基磺酸鈉,（C4） （C5） （C6） （C7） （C8） （C10） （SDS）,反相離子對(duì)色譜流動(dòng)相的選擇

10、,離子對(duì)試劑的類型,所帶電荷與待測(cè)物質(zhì)相反,離子對(duì)試劑的濃度,10-410-2 mol/L,在一定范圍內(nèi)，濃度越大，被分離物的保留值越大。,流動(dòng)相的 pH,反相離子對(duì)色譜應(yīng)用,有機(jī)酸、堿、鹽的分離,包括, ,陰陽離子表面活性劑 大分子脂肪酸 烷基磺酸鹽和芳香硫酸鹽 含氮化合物 生物堿 水溶性維生素 酚類,正相色譜,流動(dòng)相的極性小于固定相的極性,硅 膠 柱: 氰 基 柱: 氨 基 柱: 二醇基柱:,常用 常用 分析糖 分析蛋白質(zhì),-Si-CH2CH2CH2CN,SiO2,SiO2,硅膠,-Si-CH2CH2CH2NH2,-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH),化學(xué)鍵合相,相互作

11、用力是什么,強(qiáng),SiOH,SiOH,弱,非常弱,OH,HO,氫鍵力,氫鍵力,如果樣品有, COOH 羧基 NH2 氨基 OH 羥基,氫鍵力強(qiáng),如果樣品沒有任何官能團(tuán)，如碳水化合物 如果樣品有大的基團(tuán), 由于空間位阻,氫鍵力弱,正相模式下流動(dòng)相的選擇,主要試劑 烷烴 （戊烷、己烷、庚烷、辛烷） 芳香烴 （苯、甲苯、二甲苯） 二氯甲烷 氯仿 四氯化碳,輔助試劑 甲基-t-丁基醚(MTBE)，乙醚，四氫呋喃(THF)，二氧雜 環(huán)乙烷， 嘧啶，乙酸乙酯，乙腈，丙酮，異丙醇，乙醇， 甲醇,為了調(diào)整保留時(shí)間，可以選擇主要試劑然后再加入輔助試劑。,流動(dòng)相極性變化對(duì)分離的影響,0 % 甲醇,2 % 甲醇,5%

12、 甲醇,1: 2: 3: 4:,鄰苯二甲酸二辛酯 鄰苯二甲酸二丁酯 鄰苯二甲酸二乙酯 鄰苯二甲酸二甲酯,主要試劑 : 己烷,反相色譜與正相色譜的對(duì)比,反相色譜,流動(dòng)相極性大于固定相極性 適用于能溶于水/有機(jī)混合物的中性或非離子化合物分離,正相色譜,流動(dòng)相極性小于固定相極性 適用于不溶于水/有機(jī)混合液的親脂樣品、異構(gòu)體混 合物的分離和制備HPLC,反相色譜與正相色譜的對(duì)比,反相, 保留時(shí)間重現(xiàn)性好 固定相耐用,正相, 對(duì)立體異構(gòu)體有很好的分離（Vitamin E等） 保留時(shí)間重現(xiàn)性稍差,離子交換色譜,原理：利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差 異來實(shí)現(xiàn)分離,固定相：離子交換樹脂,流動(dòng)相

13、：水緩沖溶液（常用）或有機(jī)溶劑與水緩沖溶液的混 合液,離子交換色譜所用的緩沖液：,陰離子分離：氫氧化物、硼酸鹽、碳酸鹽、酚鹽和兩性離子等,陽離子分離：礦物酸，如硝酸、鹽酸、硫酸和甲基磺酸等,離子交換色譜作用力,離子吸引力,樣品,+ + +樣品 + + + +,R +RN,R,- SO,3,離子交換色譜應(yīng)用,生物領(lǐng)域（蛋白質(zhì)、農(nóng)藥、氨基酸分析）,離子分,陽離子交換劑 -） 強(qiáng)陽離子交換劑（SCX）（R-SO3,-）弱陽離子交換劑（WCX）（R-COO,陰離子交換劑 +） 強(qiáng)陰離子交換劑 （SAX） （R4N 弱陰離子交換劑 （WAX）（DEAE）,尺寸排阻色譜法(SEC),原理：利用多孔凝膠固定

14、相的獨(dú)特特性，而產(chǎn)生的 一種主要依據(jù)分子尺寸大小的差異來分離的液相色 譜方法。,固定相：一種表面惰性、具有一定孔徑的多孔凝膠,應(yīng)用： 聚合物及生命科學(xué)領(lǐng)域,SEC分類,凝膠滲透色譜 （GPC）,主要用于聚合物領(lǐng)域 以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相（氯仿，THF，DMF）,常用固定相填料：苯乙烯二乙烯基苯共聚物,凝膠過濾色譜 （GFC）,主要用于生命科學(xué)領(lǐng)域 以水溶液為流動(dòng)相 常用固定相填料：親水性有機(jī)凝膠（葡聚糖，瓊脂糖，聚丙烯酰 胺等）,GPC分離原理,固定相是多孔填料，小分子樣品可以進(jìn)入孔徑內(nèi)部,樣品與固定相之間無作用力,保留時(shí)間不同,樣品,大,填充物顆粒,中,小,孔穴,GPC分離原理,排阻極限,Log

15、 (MW),滲透極限,V,第二部分,硬件基礎(chǔ)知識(shí),HPLC簡(jiǎn)易流程圖,脫氣機(jī),色譜柱,進(jìn)樣器,輸液泵,儲(chǔ)液瓶,柱溫箱,數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),檢測(cè)器,儲(chǔ)液瓶,由機(jī)械性能和化學(xué)穩(wěn)定性好的不銹鋼、玻璃或聚,四氟乙烯材料制成,使用過程中儲(chǔ)液瓶應(yīng)適當(dāng)密閉,所有溶劑應(yīng)先過濾，再裝入儲(chǔ)液瓶,溶劑前處理-過濾,過濾：0.45 m或更小孔徑濾膜,目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞 色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液,濾膜類型： 聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽。,醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水 基溶劑。,尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶 液，可以用于強(qiáng)酸，不適用于 DMF，THF， C

16、HCl3 等溶劑。,再生纖維素濾膜：蛋白吸收低，同樣適用于水溶性樣 品和有機(jī)溶劑。,溶劑前處理-脫氣,脫氣：除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡,氣泡對(duì)測(cè)定的影響：,1）泵中氣泡使液流波動(dòng)，改變保留時(shí)間和峰面積 2）柱中氣泡使流動(dòng)相繞流，峰變形 3）檢測(cè)器中的氣泡產(chǎn)生基線波動(dòng),常用脫氣方法,超聲脫氣,減壓脫氣,在線脫氣,脫氣機(jī)-在線真空脫氣,組成：,脫氣機(jī)主要由脫氣管、真空室和 真空泵組成。,脫氣管,真空室,到泵,真空室內(nèi)的脫氣管由特殊的 透析材料制成，當(dāng)溶劑流經(jīng)脫氣 管時(shí)，溶解在溶劑中的氣體穿過 管壁被脫出。,儲(chǔ)液瓶,輸液泵,性能要求, 能在高壓下連續(xù)工作, 輸出流量范圍寬, 輸出流量穩(wěn)定、

17、精確度、重復(fù)性高,47,島津輸液泵系列,目的,單元,LC-20AT LC-15C,流速范圍,0.001-10ml/min,特性和應(yīng)用,非凡的耐用性，適于常量 分析,極低脈動(dòng)，適于半微量LC 和LC-MS分析,極低脈動(dòng)，適于半微量LC 和 LC-MS分析,分析,LC-20AD LC-30A,LC-20AB,0.0001-10ml/min 0.0001-5ml/min,0.0001-10ml/min,LC-20AT,選配件 支架,壓力傳感器,泵頭固定座 泵頭,輔助進(jìn)口單向閥,主進(jìn)口單向閥,LC-20AT,主泵頭,副泵頭,串聯(lián)式柱塞往復(fù)泵,單向閥,LC-20AD,選配件支架,出口單向閥,壓力傳感器,

18、泵頭,泵頭固 定座,進(jìn)液口,泵頭,LC-20AD,進(jìn)口單向閥,泵頭,單向閥,并聯(lián)式微體積柱塞往復(fù)泵,LC-20AB,壓力傳感器,連接塊,出口單向閥,泵頭,泵頭固定座,進(jìn)口單向閥,泵B,LC-20AB,進(jìn)液口,泵A,柱塞往復(fù)泵結(jié)構(gòu)示意圖,單向閥工作原理,單向閥結(jié)構(gòu),單向閥工作原理,吸液沖程,寶石球,拋光面,泵頭,球座,進(jìn)口單向閥,出口單向閥,排液沖程,洗脫系統(tǒng)組成,等度洗脫系統(tǒng),梯度洗脫系統(tǒng),高壓梯度洗脫系統(tǒng),低壓梯度洗脫系統(tǒng),等度,B%,B%,梯度,時(shí)間,時(shí)間,使用梯度洗脫的原因,當(dāng)采用等度洗脫時(shí)：,MeOH / H2O = 6 / 4,分析時(shí)間長(zhǎng),分離度差,MeOH / H2O = 8 /

19、2,( column : ODS ),使用梯度洗脫的原因,當(dāng)采用梯度洗脫時(shí)：,95%,甲 醇 濃 度,30%,在最短時(shí)間內(nèi)獲得最佳的分離,梯度洗脫要點(diǎn),梯度洗脫：,優(yōu)點(diǎn)：可提高分離度、縮短分離時(shí)間、降低最小檢測(cè)量和提高分離精度,注意事項(xiàng)：,溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差 梯度混合的溶劑互溶性要好 梯度洗脫應(yīng)使用對(duì)流動(dòng)相組成變化不敏感的選擇性檢測(cè)器（如紫 外吸收檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器），而不能使用對(duì)流動(dòng)相組成變化敏 感的通用型檢測(cè)器（如示差折光檢測(cè)器） 查看空白實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù) 遵守分析周期（最初的分析數(shù)據(jù)不采用）,等度洗脫,輸液泵,進(jìn)樣器,柱溫箱,檢測(cè)器,色譜柱,單一或混合溶劑,高壓梯度系統(tǒng),A

20、,泵,B,混合器,泵,進(jìn)樣器,分析柱,柱溫箱,檢測(cè)器,數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),C,泵,梯度準(zhǔn)確率高 需要2-3個(gè)泵,可以不配在線脫氣機(jī),低壓梯度系統(tǒng),混合器,分析柱,進(jìn)樣器,輸液泵,低壓梯度比例閥,檢測(cè)器,柱溫箱,數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),脫氣機(jī),一臺(tái)泵最多可使用4種流動(dòng)相,泵前預(yù)混合,需帶在線脫氣機(jī),A,B,C,D,流動(dòng)相的選擇,采用“HPLC”級(jí)溶劑,避免使用會(huì)引起柱效損失或保留特性變化的溶劑,對(duì)試樣有適宜的溶解度,溶劑粘度要小,與檢測(cè)器相匹配,水的等級(jí),水的等級(jí),純化水 蒸餾水 去離子水,吸 光 率,去離子水,純化水,波長(zhǎng) (nm),因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子的吸光率較高,純化水中去除了無機(jī)和有機(jī)的污染物,水的

21、等級(jí),HPLC用水可以通過以下幾個(gè)方法得到：,專門的純水機(jī)或超純水機(jī)：理想的HPLC用水應(yīng)為18.2 M 的超純水， 并通過0.22 m的濾膜，除去熱源、有機(jī)物、 無機(jī)離子及空氣等,去離子水重蒸 二次或三次重蒸水,不管采用何種途徑，配制流動(dòng)相應(yīng)用新鮮水,水的等級(jí),未注入樣品時(shí)空白梯度的色譜圖,水中不純物的出峰,水中的不純物保留在柱中，隨之被乙腈洗脫,有機(jī)溶劑的等級(jí),有機(jī)溶劑的等級(jí),HPLC級(jí) 優(yōu)級(jí)純 分析純,微量分析、梯度洗脫,都經(jīng)過蒸餾和0.45 m的過濾（除纖維毛,未溶解的機(jī)械顆粒）,優(yōu)級(jí)純的純度比分析純大，但里面含有防腐劑和抗氧化劑,HPLC級(jí)經(jīng)過0.2 m的過濾，且除去有紫外吸收的雜質(zhì)

22、,有機(jī)溶劑的等級(jí),分析純級(jí)和 HPLC 級(jí)溶劑的吸光度比較圖,甲醇,乙腈,正己烷,選擇緩沖液的步驟,1. 確定最佳分離狀態(tài)時(shí)的流動(dòng)相pH,2. 選擇具有與流動(dòng)相的pH相近的pKa的緩沖液,（即使?jié)舛认∫簿哂休^強(qiáng)的緩沖能力）,3. 確認(rèn)檢測(cè)波長(zhǎng)下緩沖液是否有大的吸收,（在波長(zhǎng)210nm附近進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，不能用醋 酸和檸檬酸的緩沖液）,常用代表性的弱酸的pKa值,pK1,醋酸,檸檬酸,磷酸,4.87,3.13,2.16,pK2,pK3,4.76,7.21,6.40,12.32,緩沖液的使用,使用前必須過濾,使用后一定要進(jìn)行清洗 ，以免造成腐蝕、磨損、,阻塞： 用純水沖洗30-60 min(1 ml/

23、min)，再用甲,醇沖洗30 min。,易受到細(xì)菌和霉菌的影響,不能直接用有機(jī)溶劑 沖洗緩沖鹽溶液,進(jìn)樣器,手動(dòng)進(jìn)樣器 自動(dòng)進(jìn)樣器,要求： 無殘留 擴(kuò)散小 進(jìn)樣體積可變 可承受高壓,手動(dòng)進(jìn)樣器的原理圖,裝填狀態(tài),泵,進(jìn)樣狀態(tài),泵,6,1,2,6,1,2,5,4,3,5,4,柱子,3,柱子,1,6,5,1,6,5,4,4,進(jìn)樣量和檢測(cè)器響應(yīng)的關(guān)系示意圖,檢 測(cè) 器 響 應(yīng) 值,全量注入,部分注入,定量環(huán)體積的一半,3倍定量環(huán)體積,進(jìn)樣體積,部分注入和全量注入,部分注入：一般要求進(jìn)樣量最多為定量環(huán)體積的一半，如,20L的定量環(huán)最多進(jìn)樣10L的樣品，并且要求每次進(jìn)樣體積,準(zhǔn)確、相同。,全量注入：進(jìn)樣

24、量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20L的定,量環(huán)最少進(jìn)樣60至100L的樣品，這樣才能完全置換樣品定量,環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達(dá)到所要求的精密度及重現(xiàn)性。,交叉污染產(chǎn)生的原因,紅色表示殘留樣品,手動(dòng)進(jìn)樣方法,一般的方法,1.在進(jìn)樣狀態(tài)下清洗針口,2.在裝填狀態(tài)下插入微量注射器,3.注入樣品,4.切到進(jìn)樣狀態(tài),手動(dòng)進(jìn)樣方法,便捷的方法（不需清洗）,1.進(jìn)樣狀態(tài)下插入微量注射器,2.切到裝填狀態(tài),3.注入樣品,4.切回到進(jìn)樣狀態(tài),自動(dòng)進(jìn)樣器,由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控 制定量閥，按預(yù)先編 制注射樣品的操作程 序工作。,自動(dòng)進(jìn)樣器,清洗(Rinse)：進(jìn)樣針移動(dòng)到清洗口，針的外壁被清洗 液清洗的過程。,排氣(Purg

25、e)：排除管路中的氣泡和更換舊流動(dòng)相的 過 程。,色譜柱,常用色譜柱,反相,C18 (ODS) 、C8 、C4 、苯基、TMS、 氰基,正相,硅膠、氰基 、氨基、二醇基,離子交換色譜,陽離子交換劑 強(qiáng)陽離子交換劑(SCX) 弱陽離子交換劑(WCX) 陰離子交換劑 強(qiáng)陰離子交換劑(SAX) 弱陰離子交換劑(WAX),R-SO3- R-COO-,NR4+ DEAE,體積排阻色譜,苯乙烯二乙烯基苯共聚物、葡聚糖，瓊脂糖，聚丙烯酰胺,分離模式的選擇,反相色譜：第一選擇,反相離子對(duì)色譜/正相色譜：第二選擇,特殊：,高分子量化合物：聚合物、 蛋白或糖類 無機(jī)離子 光學(xué)異構(gòu)體,色譜柱的選擇,105,分子量,

26、104,非水相,體積排阻,離子交換,離子對(duì)反相,反相,103,水相正相,非極性,中等極性,高極性,色譜柱的連接,死體積可能會(huì)引起分離度變差和重現(xiàn)性變差等問題,色譜柱,公螺母,死體積,管線,好的連接,差的連接,色譜柱的使用,新色譜柱使用前：,最好用強(qiáng)溶劑在低流量下 (0.2-0.3 ml/min)沖洗 30 min，長(zhǎng)時(shí)間未用的分析柱也要同樣處理 新色譜柱先測(cè)柱效，并保留色譜圖和實(shí)驗(yàn)條件 定期檢測(cè)柱效,色譜柱的使用,1. 流動(dòng)相：高純度，過濾 pH范圍 有機(jī)溶劑與色譜柱匹配互溶、并能溶解 樣品,2. 凈化樣品,3.使用保護(hù)柱：與色譜柱填料、內(nèi)徑一致 避免色譜柱污染,色譜柱的使用,4. 分離條件流

27、速、柱溫、梯度的變化幅度,5. 定期使用強(qiáng)溶劑沖洗柱子,6. 使用緩沖鹽后，要先用含10%甲醇的水溶液沖洗， 再用有機(jī)溶劑沖洗,7. 流動(dòng)相正相反相轉(zhuǎn)換時(shí)用異丙醇過渡,色譜柱的存放,存放前充分沖洗,合適的存放溶劑,接好堵頭，避免固定相干涸,存放環(huán)境,柱溫箱,分析結(jié)果重現(xiàn)性好,提高柱效,降低柱壓,保證檢測(cè)穩(wěn)定性,柱溫箱,CTO-20A/AC 空氣強(qiáng)制循環(huán)式,CTO-15C,模塊加熱式,CTO-30A,CTO-10AS,液相色譜檢測(cè)器的選擇,樣品的性質(zhì),分離目的不同，對(duì)檢測(cè)的要求不同,定量：高選擇性、高靈敏度,定性或制備：通用性,常用檢測(cè)器,紫外可見光檢測(cè)器 (UV),二極管陣列檢測(cè)器 (PDA)

28、,熒光檢測(cè)器 (RF),示差折光檢測(cè)器 (RID),電導(dǎo)檢測(cè)器 (CDD),蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 (ELSD),質(zhì)譜檢測(cè)器 (LCMS),紫外可見光檢測(cè)器,樣品池,C : 濃度,Ein,l,Eout,朗伯-比耳定律,A= Cl = - log (Eout / Ein),(A : 吸光度),紫外可見光檢測(cè)器,樣品池,光柵,Ein,Eout,光電二極管,Ein,Ein,參比池,光電二極管,D2 / W 光源,紫外可見光檢測(cè)器,紫外檢測(cè)器,原理：基于被分析組分對(duì)特定波長(zhǎng)紫外光的選擇 性吸收。,定量基礎(chǔ)：朗伯-比耳定律，ACL,優(yōu)點(diǎn)： 1）靈敏度高,2）對(duì)溫度和流速不敏感,3）可用于梯度洗脫,缺點(diǎn)：僅適用

29、于測(cè)定有紫外吸收的物質(zhì),雙波長(zhǎng)檢測(cè),日本飲用水標(biāo)準(zhǔn)（2004年4月起實(shí)施 ）,1.磺草靈（asulam）,2.甲基硫菌靈（thiophanate-methyl）,3.環(huán)草隆1（siduron）,4.環(huán)草隆2（siduron）,5.依普同（iprodione）,分析條件： 色譜柱：Shim-pack VP-ODS (150 mmL. 4.6 mmI.D.),流動(dòng)相：Acetonitrile/ 50 mM KH2PO4(pH3.0) =55/45(v/v%),流速：1.0 mL/min,柱溫 : 40C,檢測(cè) : 230 nm, 270 nm,進(jìn)樣 : 10 L,飲用水中4種農(nóng)藥殘留雙波長(zhǎng)分析,波

30、長(zhǎng)切換,波長(zhǎng)掃描,紫外檢測(cè)器,啟動(dòng)儀器或開燈后，需要一定的時(shí)間使基線穩(wěn)定,檢查流通池與管路有無漏液,檢測(cè)時(shí)，請(qǐng)關(guān)閉前面板,清洗流通池，防止堵塞,標(biāo)準(zhǔn)流通池：12 L，耐壓12 MPa,（半微量流通池：2.5 L）,氘燈：2000小時(shí)，不要頻繁的開關(guān)（3小時(shí)）,二極管陣列檢測(cè)器,二極管陣列檢測(cè)器,樣品池,光柵,D2 / W 燈,每一組分可在每一波 長(zhǎng)處得到一吸光度值,二極管陣列,二極管陣列檢測(cè)器,光譜,色譜,吸光度,波 長(zhǎng),時(shí)間,二極管陣列檢測(cè)器,二極管陣列檢測(cè)器,采集三維譜圖，可以發(fā)現(xiàn)單波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)未,檢測(cè)到的峰,光譜定性，譜庫搜索,峰純度檢驗(yàn),二極管陣列檢測(cè)器,啟動(dòng)儀器或開燈后，需要一定的時(shí)間

31、使基線穩(wěn)定,檢查流通池與管路有無漏液,檢測(cè)時(shí)，請(qǐng)關(guān)閉前面板,清洗流通池，防止堵塞,標(biāo)準(zhǔn)流通池：10 L，耐壓12 MPa,（半微量流通池：2.5 L）,氘燈：2000小時(shí)，不要頻繁的開關(guān)（3小時(shí)）,熒光檢測(cè)器,激發(fā)波長(zhǎng),+ h1,*,*,A*,h1,A,h2,h2+,發(fā)射波長(zhǎng),熒光,熒光檢測(cè)器,氙燈,光電倍增管,光柵,樣品池,熒光檢測(cè)器,熒光檢測(cè)器,原理：基于被分析組分發(fā)射的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè),優(yōu)點(diǎn)： 1）靈敏度高，是最靈敏的檢測(cè)器之一,2）選擇性好,3）對(duì)溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫,缺點(diǎn)：僅適用于測(cè)定可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)或能經(jīng)過衍生化,反應(yīng)產(chǎn)生熒光的物質(zhì),可檢測(cè)物質(zhì)：多環(huán)芳烴、霉菌毒素、卟啉

32、、兒茶酚氨等（具,有對(duì)稱共軛體系）或氨基酸、脂肪酸等需衍生后檢測(cè)樣品,熒光檢測(cè)器,啟動(dòng)儀器或開燈后，需要一定的時(shí)間使基線穩(wěn)定,檢查流通池與管路有無漏液,檢測(cè)時(shí)，請(qǐng)關(guān)閉前面板,清洗流通池，防止堵塞,oC時(shí)， 溫度上升，熒光強(qiáng)度下降（常溫附近溫度變化超過1,有些化合物強(qiáng)度變化達(dá)到5%）,標(biāo)準(zhǔn)流通池：12 L，耐壓2 MPa,氙燈：2000小時(shí)(RF-20AxL)，不要頻繁的開關(guān),熒光檢測(cè)器應(yīng)用,氨基酸檢測(cè)OPA衍生,CHO,A,A,N-R,+ R-NH2,CHO,o-phthalaldhyde (OPA),脂肪酸檢測(cè)ADAM衍生,+ R-COOH,CHN2,9-anthryldiazomethan

33、e (ADAM),CH2OCOR,氨基酸檢測(cè)OPA柱后衍生,Taurine,mV 700 檢測(cè)器 A:Ex:350nm,Em:450nm,600,500,400,300,Asp,200,100,0,0.0,5.0,10.0,15.0,20.0,25.0,30.0,35.0,40.0,45.0,50.0,55.0,60.0min,Thr Ser,Gly,Met isoLeu Leu Tyr Phe,His,Lys Ammonia,Glu Pro,各組分濃度：0.02 mol/mL，進(jìn)樣10 L,Cys,Val,Arg,Ala,示差折光檢測(cè)器,光學(xué)系統(tǒng),鎢燈,準(zhǔn)直鏡,狹縫,物鏡,狹縫,反射鏡,調(diào)零

34、透鏡,硅光電池,樣品池,示差折光檢測(cè)器,示差折光檢測(cè)器,示差折光檢測(cè)器,原理：連續(xù)測(cè)定流通池中溶液折射率來測(cè)定試樣中,各組分濃度。,優(yōu)點(diǎn)：通用型檢測(cè)器,缺點(diǎn)：,1）對(duì)溫度變化敏感,2）對(duì)溶劑組成變化敏感，不能用于梯度檢測(cè),3）屬于中等靈敏度的檢測(cè)器,示差折光檢測(cè)器,檢測(cè)時(shí)，請(qǐng)關(guān)閉前面板,清洗流通池，防止堵塞,流通池：9 L，耐壓2 MPa,進(jìn)口：63.5 L,出口：280.2 L,鎢燈：20000小時(shí),糖分析例,分析條件 色譜柱 : Shim-pack CLC-NH2 流動(dòng)相 : 乙腈 / 水= 7 / 3 流速 : 1.0 mL/min 溫度 : 室溫,峰,1. 甘油 2. 木糖 3. 果糖

35、 4. 葡萄糖 5. 蔗糖 6.甘露糖 7. 乳糖,電導(dǎo)檢測(cè)器,V,I,K (電導(dǎo)) = I A / E V 2 / L cm x k=A cm (k : 電導(dǎo)率),k= (I/E)x(L/A),A,A,電極,L,電極,電導(dǎo)檢測(cè)器,原理：根據(jù)物質(zhì)在某些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)率的變化來 測(cè)定電離物質(zhì)含量，廣泛應(yīng)用于離子色譜法。,優(yōu)點(diǎn)：對(duì)流動(dòng)相流速和壓力的改變不敏感,缺點(diǎn)：對(duì)溫度變化敏感,（溫度每升高1，電導(dǎo)率增加2 %-2.5 %),用途：主要用于離子色譜，檢測(cè)無機(jī)和有機(jī)離子,電導(dǎo)檢測(cè)器,清洗流通池，防止堵塞,流通池：0.25 L，耐壓2.9 MPa,海水中陰離子分析例,分析條件 色譜柱 :

36、Shim-pack IC-A3 流動(dòng)相 : 8.0 mM p-hydroxybenzoic acid 3.2 mM Bis-Tris 流速: 1.5 mL/min 溫度: 40 進(jìn)樣體積 : 100 L,色譜峰 1. F- 2. Cl - 3. NO2- 4. Br - 5. NO3- 6. SO4 2-,(1.4 ppm) (10200 ppm) (10 ppm) (43 ppm) (44 ppm) (431 ppm),陽離子分析例,+,+,+,+,2+,2+,分析條件 色譜柱 : Shim-pack IC-C1 流動(dòng)相 : 5 nM 硝酸溶液 流速 : 1.5 mL/min 溫度 : 40

37、oC 進(jìn)樣：50 L,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,流動(dòng)相,霧化,載氣,霧化器,蒸發(fā),光電倍增管,檢測(cè)池,檢測(cè),光源,光電倍增管,漂移管,LED,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,原理: 流出物在檢測(cè)器中被高速氮?dú)鈬姵伸F狀液滴，溶劑揮發(fā) 后，溶質(zhì)形成微小顆粒，被載氣帶到檢測(cè)系統(tǒng)，進(jìn)入散射室 中，檢驗(yàn)散射光的強(qiáng)度。,優(yōu)點(diǎn): 消除了溶劑干擾以及溫度變化帶來的基線漂移，可梯度 洗脫，靈敏度高，是HPLC的通用型檢測(cè)器。,缺點(diǎn)： 不能使用非揮發(fā)性緩沖鹽做流動(dòng)相，如磷酸鹽。,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,廢氣不能直接排放在室內(nèi) 如果流動(dòng)相中含有機(jī)溶劑，使用惰性氣體做霧化氣 避免使用在工作溫度下能引起爆炸的溶劑和霧化氣 流動(dòng)相中不使用非揮發(fā)性鹽

38、 霧化氣壓力不要超過450 kPa 先開氣，后開泵 保證霧化器虹吸出口充滿液體 不要打開前門 LED燈：5000小時(shí),PEG-1000分析例,質(zhì)譜檢測(cè)器,強(qiáng)大的定性和選擇性能力,多組份樣品的準(zhǔn)確定性 未充分分離組份峰的鑒別 消除雜質(zhì)干擾,可作為便捷的定性分析,用于合成和衍生反應(yīng)的研究 作NMR預(yù)分析的質(zhì)譜鑒定,人造色素質(zhì)譜圖,(x1,000,000) 8.0,7.0,6.0,1,2 3,4,5,6,8,9,7,10,11,12,5.0,4.0,3.0,2.0,1.0,0.0 0.0,TIC,m/z 467 m/z 537 m/z 421 m/z 407 m/z 451 m/z 763 m/z

39、747 m/z 557 m/z 784.5 m/z 834.5 m/z 972.5,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,min,色譜柱:,流動(dòng)相:,時(shí)間程序: 流速: 進(jìn)樣體積: 柱溫:,Shim-pack XR-ODS (50 mmL x 2.0 mmI.D. Particle size: 2.2 m) A; 20mmol/L NH4Ac (pH 4.7) B; 20mmol/L NH4Ac (pH 4.7) /A CN=1/1 10%B (0 min) - 100%B (5.0 min) 0.5 mL/min 5 L 40 C,掃描范圍 m/z

40、200-1200,1: tartrazine 2: amaranth 3: indigo carmine, 4: new coccine 5: sunset yellow FCF 6: allura red AC,7: fast green FCF 8: brilliant blue FCF 9: acid red 10: phloxine B 11: erythrosine 12: rose bengal,第三部分,定量基礎(chǔ)知識(shí),定性方法,色譜峰的定性鑒別,通過保留值(通常是保留時(shí)間)進(jìn)行定性,需要指定保留時(shí)間誤差范圍（時(shí)間窗、時(shí)間帶）,在相同的分析條件下,保留時(shí)間相同并不肯定是同樣的組份,

41、保留時(shí)間不同肯定不是同樣的組份,定性確證,僅僅通過保留時(shí)間并不能完全確證該物質(zhì),通過加入標(biāo)準(zhǔn)物確認(rèn),通過改變色譜條件確認(rèn),光譜和質(zhì)譜信息也可以作為進(jìn)一步確證手段,其他儀器方法確證,定量分析的基本要求,需要有純物質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn),被定量組分峰要與其它峰達(dá)到基線分離,符合定性參數(shù)要求,選擇合適的定量方法,定量分析基本公式,在某些條件限定下，被測(cè)組分的濃度與檢測(cè)器的響應(yīng)值成正比的關(guān)系。 （蒸發(fā)光散射檢測(cè)器濃度與峰面積不成線性，分別取對(duì)數(shù)后成線性 ）,Ci= fi Ai Ci= fi Hi,Ci： fi: Ai： Hi：,組分濃度 響應(yīng)因子，與組分的物理化學(xué)性質(zhì)和檢測(cè)器的性質(zhì)有關(guān) 組分響應(yīng)面積 組分響應(yīng)高度,

42、實(shí)際修飾公式： Y=aX+b,常用定量方法,面積歸一化,外標(biāo)法,內(nèi)標(biāo)法,標(biāo)準(zhǔn)加入法,面積歸一化法,不能作為準(zhǔn)確定量的方法，僅在特定情況下使用,公式,特點(diǎn)：,Ai Ci % = 100 % Ai ,1、無需做校正，簡(jiǎn)便，快速,2、進(jìn)樣量不嚴(yán)格要求,3、要求所有組分都流出并且被檢測(cè)到,4、要求所有組分的響應(yīng)因子相當(dāng),外標(biāo)法,濃度,C1,A2,C2,面積,A1,A4,A3,A2,A1,A4,C4,C1,C2,C3 濃度,C4,峰面積,標(biāo)準(zhǔn)曲線,A3,C3,外標(biāo)法,C i = f i Ai,fii 組分工作曲線的斜率,實(shí)驗(yàn)室最常用的定量方法，定量結(jié)果準(zhǔn)確,特點(diǎn)：,1、不需所有峰都流出或被檢測(cè)到，只對(duì)目

43、標(biāo)組分作校正,2、需要標(biāo)準(zhǔn)樣品,3、進(jìn)樣量必須準(zhǔn)確,4、儀器必須有良好的穩(wěn)定性,單點(diǎn)校正法,當(dāng)被測(cè)試樣中各組分濃度變化范圍不大時(shí)，可不必繪制多點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn) 曲線，而用單點(diǎn)校正法（比較法）。配制一個(gè)和被測(cè)組分含量接近的標(biāo) 準(zhǔn)溶液，定量進(jìn)樣，根據(jù)被測(cè)組分和外標(biāo)組分峰面積比或峰高比計(jì)算被 測(cè)組分的含量。,wi Ai = ws As,當(dāng)方法存在較大的系統(tǒng)誤差, 單點(diǎn)校正法的誤差較大。,內(nèi)標(biāo)法,濃度,目標(biāo) 內(nèi)標(biāo),C1,CIS,A2 AIS,C2,CIS,A3 AIS,C3,CIS,A4 AIS,C4,CIS,C1/CIS C2 /CIS C3 /CIS C4 /CIS,濃度比: 目標(biāo) / 內(nèi)標(biāo),面積,A1

44、AIS,A4 /AIS,A3 /AIS,A2 /AIS,A1/AIS,面積比: 目標(biāo)/ 內(nèi)標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)曲線,內(nèi)標(biāo)法,試樣配制：準(zhǔn)確稱取一定量的試樣Wi，加入一定量?jī)?nèi)標(biāo)物WS,計(jì)算公式：,wi = f i Ai,ws = f s As,f i AiAi wi =ws = f i ws f s AsAs,fi為待測(cè)組分 (i) 對(duì)內(nèi)標(biāo)物 (s) 的質(zhì)量相對(duì)校正因 子,內(nèi)標(biāo)法特點(diǎn),多用在國際標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)定比較嚴(yán)格的方法中,特點(diǎn)：,1、進(jìn)樣量不嚴(yán)格要求,2、只對(duì)所測(cè)組分作校正,3、必須在樣品中加一內(nèi)標(biāo)組分,4、操作較為繁瑣,5、選擇內(nèi)標(biāo)物比較困難,選擇內(nèi)標(biāo)物應(yīng)注意,1、理化性質(zhì)與待測(cè)物相近,2、在樣品中不存在

45、且不與樣品中組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng),3、內(nèi)標(biāo)物與待測(cè)物響應(yīng)相近,4、與待測(cè)物有良好的分離，但又不能相距太遠(yuǎn),5、與待測(cè)物的峰面積比為0.7-1.3最好，因此要根據(jù)待測(cè)物 的 濃度確定內(nèi)標(biāo)物的添加量,標(biāo)準(zhǔn)加入法,當(dāng)難以選擇合適的內(nèi)標(biāo)物或無空白樣品時(shí)，以欲測(cè)組分的純物 質(zhì)為內(nèi)標(biāo)物加入到待測(cè)樣品中，然后在相同的色譜條件下，測(cè)定加 入欲測(cè)組分前后的峰面積，從而計(jì)算待測(cè)組分的含量。,wi = f i Ai,wi + wi = f i Ai ,wi + wi Ai = wiAi,fi = fi ,wi wi = Ai 1 Ai,標(biāo)準(zhǔn)加入法特點(diǎn),1、不需另外選擇內(nèi)標(biāo)物,2、進(jìn)樣量不必十分準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單,3、兩次色

46、譜條件完全相同以保證校正因,子完全相等,定量計(jì)算常用術(shù)語,Integration parameters ：積分參數(shù)，規(guī)定計(jì)算出峰面積的方法,Identification ：,定性參數(shù)，保留時(shí)間及允許誤差,Quantification method： 定量方法，選擇定量方法(外標(biāo)法,內(nèi)標(biāo)法等),Curve fit Type：,Compound table：,曲線擬合類型，包括線性、二次方程等,化合物表，定義要進(jìn)行定量計(jì)算的組分，其中,包括定性和定量參數(shù),1) Type： 組分類型，指組分的分析類別 Target：要計(jì)算的目標(biāo)組分 ISTD：指該組分為添加的內(nèi)標(biāo)組分 Reference： 指該組分

47、為參比組分，用來對(duì)目標(biāo)組分進(jìn)行確認(rèn) ISTD&Ref.： 指該組分既是內(nèi)標(biāo)組分，又是參比組分 2) Conc： 濃度，指目標(biāo)組分的計(jì)算結(jié)果,定量計(jì)算常用術(shù)語,Sample Type ：樣品類型，規(guī)定該數(shù)據(jù)的計(jì)算類別,Standard ：標(biāo)樣， 濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)品，用來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,Unknown ：未知樣，濃度待測(cè)的目標(biāo)組分,Sample Amt.：樣品量, 待測(cè)樣品的原始稱樣量, 在計(jì)算結(jié)果中會(huì)除以該數(shù)值,Dil. Factor ：稀釋因子,待測(cè)樣品的稀釋倍數(shù)，在計(jì)算結(jié)果中會(huì)乘以該數(shù)值,ISTD Amt. ：內(nèi)標(biāo)量，內(nèi)標(biāo)組分的添加量,Level ：樣品濃度水平，規(guī)定數(shù)據(jù)的濃度級(jí)別， Unkno

48、wn為0，,Standard為整數(shù)，濃度由低到高依次為1、2、3、4、5 ,Peak Table ：,峰表，所有積分結(jié)果的列表,數(shù)據(jù)處理參數(shù),積分參數(shù)：（Width, Slope, Drift, T.DBL等）,定性參數(shù)：保留時(shí)間及允許誤差（時(shí)間窗，時(shí)間帶）,定量參數(shù)：,1) 定量方法：外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法、面積歸一法等,2) 曲線點(diǎn)數(shù)：一點(diǎn)或多點(diǎn),3) 曲線擬合：線性、折線、曲線,積分參數(shù),積分參數(shù),基本積分參數(shù),Channel：通道，指定檢測(cè)器檢測(cè)信號(hào)的通道,Width ：半峰寬，峰的半高寬，排除峰寬小于最小峰寬的峰,Slope ：斜率，用來判斷出峰起點(diǎn)、終點(diǎn)以及濾除低平噪聲,Drift ：漂移

49、，判斷相鄰峰的積分方式,設(shè)定值為0時(shí)，積分儀將自動(dòng)判斷,如Drift與基線至峰谷連線較接近時(shí)，積分面積值可能變化較,大,T.DBL ：時(shí)間變參，根據(jù)時(shí)間自動(dòng)改變峰寬和斜率,Minimum area：最小峰面積，排除面積小于該值的峰,Slope的設(shè)定,Slope,Slope,Slope峰斜率，作為峰計(jì) 算,Slope,Slope峰斜率，作為噪聲濾除,Slope,Slope峰斜率，積分不穩(wěn)定，須手動(dòng)設(shè) 定,Drift值的設(shè)定(手動(dòng)校正),Drift,Drift,Drift,Drift,Drift,Drift,注：1) 設(shè)定值為0時(shí)，積分儀將自動(dòng)判斷 2) 如Drift與基線至峰谷連線較接近時(shí)，積分

50、面積值可能變化較大,Drift值的設(shè)定(自動(dòng)校正),谷寬半峰高寬度 T2T1,谷寬半峰高寬度 T2T1,.DBL的設(shè)定,T.DBL：時(shí)間變參，根據(jù)時(shí)間自動(dòng)改變峰寬和斜率,等度洗脫時(shí)，出峰時(shí)間越長(zhǎng)，峰越寬 設(shè)定值為0時(shí)，根據(jù)寬度自動(dòng)判斷 默認(rèn)值為1000，此時(shí)該參數(shù)不起作用,在實(shí)際使用中，一般使用默認(rèn)設(shè)定,積分鎖定,Integration Off to On：鎖定某一時(shí)間范圍的峰，使之不計(jì)算積分,mAU (x10) 2.5 202nm4nm (1.00),2.0,1.5,1.0,0.5,0.0,0.0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,min,Integra

51、tion Off to On,定性參數(shù),定性參數(shù),絕對(duì)保留時(shí)間,相對(duì)保留時(shí)間,保留時(shí)間允許誤差,時(shí)間窗：相對(duì)允差, 一般設(shè)為5% 時(shí)間帶：絕對(duì)允差, 一般設(shè)為0.050.25 min,定量參數(shù),定量參數(shù),定量方法： 面積歸一法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法等,工作曲線的制作： 曲線點(diǎn)數(shù)：一點(diǎn)、兩點(diǎn)及多點(diǎn) 曲線計(jì)算：線性、折線、二次曲線、三次曲線,影響定量結(jié)果的因素,保留時(shí)間的重現(xiàn)性（對(duì)GPC影響很大）,樣品問題（雜質(zhì)、溶劑、穩(wěn)定性、配制）,進(jìn)樣問題（準(zhǔn)確度和精密度）,檢測(cè)器的性能（影響線性、檢出限、靈敏度）,方法的可靠性,積分參數(shù)的設(shè)定,第四部分,維護(hù)基礎(chǔ)知識(shí),日常維護(hù),目的：維持儀器處于正常運(yùn)作狀態(tài)，有效

52、的降低儀器發(fā)生故障的 頻率，延長(zhǎng)儀器的使用壽命。,準(zhǔn)備工作： 使用&維護(hù)日志 設(shè)備的耗材和備件 維護(hù)工具盒 試劑（甲醇、異丙醇、稀硝酸等） 超聲波清洗機(jī),液相系統(tǒng)維護(hù)流程圖,線路過濾器,單向閥,色譜柱,柱塞密封圈,進(jìn)樣器,檢測(cè)器,吸濾頭,輸液系統(tǒng)日常維護(hù)部件,排液閥,清洗流路密封圈,柱塞,保險(xiǎn)絲,柱塞密封圈,吸濾頭,主進(jìn)口單向閥 線路過濾器,輔助進(jìn)口單向閥,管線選擇,材料 不銹鋼 特氟隆 (Teflon) 聚醚醚酮 (PEEK),尺寸,不銹鋼材質(zhì)管路,0.1 mm I.D. x 1.6 mm O.D.,0.3 mm I.D. x 1.6 mm O.D.,0.5 mm I.D. x 1.6 mm

53、 O.D.,0.8 mm I.D. x 1.6 mm O.D.,0.13 mm I.D. x 1.6 mm O.D.,0.25 mm I.D. x 1.6 mm O.D.,PEEK材質(zhì)管路,管線材料,不銹鋼 (可用于所有連接) 能承受幾百M(fèi)Pa 壓力 酸性或高濃度鹽環(huán)境中易腐蝕 (尤其在pH小于2時(shí)) PEEK (可用于所有連接) 能承受高達(dá) 25 MPa壓力 可在整個(gè)pH范圍(pH 1-14)內(nèi)使用,不適用高溶解性溶劑如三氯甲烷、四氫呋喃等 Teflon (用于柱后阻尼管、反應(yīng)管和排液管) 化學(xué)惰性大 僅能承受 0.5 MPa壓力,管線材料,使用高溶解性溶劑如氯仿、THF等,當(dāng)ID.0.25

54、 mm或0.13 mm、氯仿、THF 25 %以下，10 MPa以下的使用,條件時(shí)，在實(shí)際應(yīng)用中一般沒有問題。,特氟隆材質(zhì)管路,作為廢液管的時(shí)候，請(qǐng)勿隨意增長(zhǎng)或縮短其長(zhǎng)度。增長(zhǎng)管路，會(huì)提高,背壓，有損壞檢測(cè)器的危險(xiǎn)；縮短管路，容易使得檢測(cè)器內(nèi)產(chǎn)生氣泡,。,接頭,不銹鋼接頭 / 墊圈,主要用于輸液泵、進(jìn)樣器的管路連接,能承受 40 MPa以上的壓力,一旦固定，墊圈不可再動(dòng),墊圈,不銹鋼接頭,PEEK接頭,主要用于色譜柱、檢測(cè)器的管路連接,易于安裝 能承受 25 MPa的壓力,容易產(chǎn)生死體積,PEEK接頭,死體積,產(chǎn)生原因：由于管路連接不好產(chǎn)生的額外體積,死體積可能會(huì)引起分離度下降和重現(xiàn)性變差等問

55、題,色譜柱,公螺母,死體積,管線,好的連接,差的連接,吸濾頭,材料：不銹鋼燒結(jié)(或陶瓷），孔徑 10 m,功能：防止較大固體不溶物進(jìn)入液相色譜,系統(tǒng),日常維護(hù)：定期使用異丙醇（或5稀硝酸）,清洗,故障：吸濾頭堵塞,現(xiàn)象：管路中不斷有氣泡生成,措施：用異丙醇（或5稀硝酸）浸泡并進(jìn)行超聲波浴清洗，再用蒸,餾水清洗至中性,LC-20AT,選配件支 架,壓力傳感器,泵頭固定座 泵頭,輔助進(jìn)口單向閥,主進(jìn)口單向閥,LC-20AT,LC-20AD,選配件支架,出口單向閥,壓力傳感器,泵頭,泵頭固定座,進(jìn)口單向閥,進(jìn)液口,LC-20AD,單向閥結(jié)構(gòu),注意：,請(qǐng)不要分解閥心A和閥心B,重新組裝后性能不被保證，

56、輸液可能不穩(wěn)定,單向閥故障處理,故障：寶石球或球座受污導(dǎo)致密封不好,表現(xiàn)：系統(tǒng)壓力波動(dòng)大,措施：,1）打開排液閥，用泵輸送或用注射針打入異丙醇進(jìn)行清洗,2）拆下單向閥，放入異丙醇中，超聲波浴清洗,注意：超聲波清洗時(shí)開口端向上放置。,單向閥故障處理,故障：寶石球粘附于墊片,表現(xiàn)：泵無法吸液或排液，流路不通,措施：1）用針筒抽出口單向閥，利用產(chǎn)生的負(fù)壓使寶石球,與墊片分開。,2）拆下單向閥，放入異丙醇或水中，用超聲波浴清洗。,柱塞密封圈,柱塞密封圈,LC-20AD LC-20AB LC-10ADvp,部件號(hào)228-35146,取下和安裝 柱塞密封圈工具,柱塞密封圈,LC-20AT LC-10ATv

57、p,部件號(hào)：228-35145,柱塞密封圈故障處理,密封圈,故障：密封圈磨損導(dǎo)致密封不良,現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動(dòng)大或漏液,措施：更換密封圈,注意： 拆卸泵頭前，必須將柱塞桿復(fù)位 （儀器面板上的P-SET界面）,柱塞桿,泵頭清洗管路,流動(dòng)相,線路過濾器,排液閥,壓力傳感器,故障：堵塞,現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力偏高,判斷依據(jù)：關(guān)閉排液閥，斷開出口管路，,設(shè)定流速1mL/min，如壓力0.3 MPa，,可以判定為線路過濾器堵塞。,措施：以異丙醇(或5稀硝酸)為清洗劑，超聲波浴清洗。,再用水洗至中性。,線路過濾器,流動(dòng)相,過濾器的更換,如果清洗無法解決故障，需要更換線路過濾器。,舊過濾器的取出,新過濾器的安裝,新型

58、號(hào)線路過濾器,部件號(hào)：228-35871-99,混合器,混合器不同體積的連接方法,混合器故障處理,常見故障：堵塞 混合器堵塞往往是由于混合,器過濾組件堵塞引起的。,處理方法： 按圖中結(jié)構(gòu)卸下過濾組件， 5%稀硝酸或其他溶劑超聲波浴 清洗或更換新的組件。,標(biāo)準(zhǔn)或半微量混合器用 部件號(hào)：228-18872-93,LC-20AT 各部件定期檢查和維護(hù)清單,檢查/維護(hù)項(xiàng)目,更換柱塞密封圈,清洗并檢查（更換） 柱塞,更換清洗流路密封 圈,檢查（更換）輔助 進(jìn)口單向閥并做超 聲波浴清洗,檢查（更換）主進(jìn) 口單向閥并做超聲 波浴清洗,檢查（更換）并清 洗線路過濾器,檢查（更換）并清 洗吸濾頭,更換排液閥,6

59、個(gè)月,1年,2年,3年,備注,LC-20AD 各部件定期檢查和維護(hù)清單,檢查/維護(hù)項(xiàng)目,更換柱塞密封圈,清洗并檢查（更換） 柱塞,檢查（更換）膜片,檢查（更換）出口 單向閥并做超聲波 浴清洗,檢查（更換）進(jìn)口 單向閥并做超聲波 浴清洗,檢查（更換）并清 洗線路過濾器,檢查（更換）并清 洗吸濾頭,更換排液閥,泵組件潤(rùn)滑,請(qǐng)咨詢島津各辦事處維修部,6個(gè)月,1年,更換柱塞時(shí)同時(shí)更換,2年,3年,備注,手動(dòng)進(jìn)樣器,手動(dòng)進(jìn)樣器操作注意事項(xiàng),針頭密封墊,1. 進(jìn)樣請(qǐng)使用液相色譜專用平頭進(jìn)樣針,2. 進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣針應(yīng)插入針導(dǎo)管到底,3. 清洗請(qǐng)使用專用進(jìn)樣口清洗器,不銹鋼套 4. 樣品溶液pH小于10， 常用密封墊的Vespel材質(zhì) 彈簧 （適用pH10），否則換Tefzel或PEEK材質(zhì)的 轉(zhuǎn)子 密封墊（pH 0-14） 定子,5. 不使用手動(dòng)進(jìn)樣器時(shí)將針頭留在進(jìn)樣器內(nèi),手動(dòng)進(jìn)樣器維護(hù)要點(diǎn),1. 將附件進(jìn)樣口清洗器裝在注射器上,2. 用注射器吸入清洗液 （試樣溶液或者不含 鹽的流動(dòng)相等）,3. 在進(jìn)樣（INJECT）狀態(tài)下，將進(jìn)樣口清洗 器壓接在針導(dǎo)管上，注入清洗液約1mL,4. 使用緩沖溶