ELISA原理、方法、操作及注意事項(xiàng)ppt課件.ppt

1、ELISA,原理,方法,操作,注意事項(xiàng),4,1,2,3,1,1.ELISA的原理,ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性

2、或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。,2,2.ELISA的類(lèi)型,ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲(chóng)病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來(lái)測(cè)定抗體，而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。,3,根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的情況以

3、及檢測(cè)的具體 條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類(lèi)型的檢測(cè)方法,用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類(lèi)型：,雙抗體夾心法測(cè)抗原,雙抗原夾心法測(cè)抗體,間接法法測(cè)抗體,競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體,捕獲包被法測(cè)抗體,ABS-ELISA法,競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原,4,雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法,雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。,5,雙抗體夾心法測(cè)抗原,6,間接法測(cè)抗體 間接法測(cè)抗體主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。,7,間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時(shí)用

4、粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗(yàn)的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過(guò)E.Coli感染者血液中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng)。抗原中也不能含有與酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來(lái)自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗(yàn)中也發(fā)生假陽(yáng)性反應(yīng)。另外如抗原中含有無(wú)關(guān)蛋白也會(huì)因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?8,間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性IgG 。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng)，非特異IgG可直接吸附到

5、固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉固相上的空余間隙。另外，在檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)本須先行稀釋?zhuān)?:401:200），以避免過(guò)高的陰性本底影響結(jié)果的判斷。,9,間接法測(cè)抗體,10,雙抗原夾心法測(cè)抗體 雙抗原夾心法與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。,Title in here,11,雙抗原夾心法測(cè)抗體,Title in here,

6、12,Title in here,競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗體 當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)特異性抗體。,13,競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體,Title in here,14,競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體,Title in here,15,競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。小分子激素 、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。,16,競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原,Title in here,17,捕獲包被法 在臨床檢驗(yàn)中測(cè)定抗體IgM時(shí)多采用捕獲包被法。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定 IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，

7、后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到固相上。,Title in here,18,捕獲包被法測(cè)抗體,Title in here,19,ABS-ELISA法,ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語(yǔ)。生物素與親和素的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性，其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于一個(gè)親和素可與4個(gè)生物素分子結(jié)合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素（LAB）法和橋聯(lián)親和素-生物素（ABC）法兩種類(lèi)型。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體（抗原）。,20,ABS-ELISA法,Tit

8、le in here,21,3. ELISA的操作,在臨床檢驗(yàn)中一般采用商品試劑盒進(jìn)行測(cè)定。 完整的ELISA試劑盒包含以下各組分： （1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）； （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）； （3）酶的底物； （4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清 （定量測(cè)定中）； （5）標(biāo)本的稀釋液； （6）洗滌液； （7）酶反應(yīng)終止液。,22,一、加樣 在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。有的測(cè)定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在

9、微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成。,23,（1） 標(biāo)本 可用作ELISA測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛，大部分ELISA檢測(cè)均以血清為標(biāo)本。血清標(biāo)本按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。,24,血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。如在冰箱中保存過(guò)久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法 ELISA中可使本底加深。 一般說(shuō)來(lái)，在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4， 超過(guò)一周測(cè)定的需低溫冰存。凍結(jié)血清

10、融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和 ，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾，澄清后再檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無(wú)菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。,25,（2） 酶 ELISA中所用的酶要求純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專(zhuān)一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來(lái)源豐富、價(jià)格不貴、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在與標(biāo)記酶相同的酶。另外它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定，光吸收高。,26,在ELIS

11、A中，常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少數(shù)商品ELISA試劑中，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 國(guó)產(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制備結(jié)合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（ 酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶無(wú)色糖蛋白在275nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵 卟啉環(huán)，在403nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰。HRP的純度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意為純度數(shù)）表示，是4

12、03nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ3.0。,27,（3） 酶的底物HRP的底物 HRP催化過(guò)氧化物的氧化反應(yīng)，最具代表性的過(guò)氧化物為H2O2，在ELISA中，DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測(cè)定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O- phenylenediamine, OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine, TMB)和ABTS2,2-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)。,28,OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏

13、度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物 。OPD本身難溶于水，OPD2HCL為水溶性。曾有報(bào)道OPD有致異變性，操作時(shí)應(yīng)予注意。OPD見(jiàn)光易變質(zhì)，與過(guò)氧化氫混 合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過(guò)氧化氫則配入底物緩沖液中，有制 成易保存的濃縮液，使用時(shí)用蒸餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA試劑盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。,29,TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對(duì)比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑

14、，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無(wú)致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或H 2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為405nm。,30,酶反應(yīng)終止液 常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。,31,二、保溫 在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation)。 ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為

15、例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗體結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。,32,溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELI SA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗(yàn)在43進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4更

16、為徹底，在放射免疫測(cè)定中多使反應(yīng)在冰箱中過(guò)夜，以形成最多的沉淀。但因所需時(shí)間太長(zhǎng)，在ELISA中一般不予采用。,33,保溫一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī) 定的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此。無(wú)論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限

17、制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求控制溫育。室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。,34,三、洗滌 洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。 通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。可以說(shuō)在ELISA操作

18、中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。,35,（1）浸泡式a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液；b.用洗滌液過(guò)洗一遍（將洗滌液注滿(mǎn)板孔后，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿(mǎn)板孔，放置1-2分 鐘，間歇搖動(dòng)，浸泡時(shí)間不可隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體。吸干應(yīng)徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙 上拍干；e.重復(fù)操作c和d，洗滌3-4次（或按說(shuō)明規(guī)定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長(zhǎng)浸泡時(shí)間。,36,（2）流水沖洗式流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來(lái)水。洗滌時(shí)附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動(dòng)

19、淋洗 ，持續(xù)沖洗2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、 快速。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時(shí)設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果 更佳。,37,微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán) 和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗

20、滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體溶解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。,38,四、顯色和比色顯色 顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測(cè)定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測(cè)定的顯色可在室溫進(jìn)行，時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制，有時(shí)可根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，及時(shí)判斷。,39,OPD底物顯色一般在室溫或37反應(yīng)20-30

21、分鐘后即不再加深，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì)自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行，顯色反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入終止液終止反應(yīng)。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。,40,TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)邊觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至 2小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類(lèi)終止劑尚能使藍(lán)色維持較長(zhǎng)時(shí)間（12-24小時(shí)）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類(lèi)酸性終止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色

22、，此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)（450nm）測(cè)讀吸光值。,41,比色 比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗(yàn)，需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。最好在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可完全平妥坐入座架中。比色時(shí)應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過(guò)程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（ab

23、sorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫(xiě)于A字母的右下角， 如OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm，表示方法為A492nm或OD492nm。,42,酶標(biāo)比色儀 酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標(biāo)儀，通常指專(zhuān)用于測(cè)讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計(jì)。針對(duì)固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。舉例說(shuō)，若某孔測(cè)得的A值為1.083，則該孔相對(duì)于空氣的真實(shí)A值應(yīng)為1.083 0.01(1.0731.093），重復(fù)測(cè)定數(shù)次，其A

24、值均應(yīng)1.0830.05（1.0781.088）在之間。酶標(biāo)儀的可測(cè)范圍視各酶標(biāo)儀的性能而不同。普通的酶標(biāo)儀在0.0002.000，新型號(hào)的酶標(biāo)儀上限拓寬達(dá)2.900，甚至更高。超 出可測(cè)上限的A值常以“*”或“over”或其它符號(hào)表示。應(yīng)注意可測(cè)范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可測(cè)范圍，比如某一酶標(biāo)儀的可測(cè)范圍為0.0002.900，而其線性范圍僅0.0002.000，這在定量ELISA中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)予注意。,43,酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)室溫宜在1530，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。 測(cè)讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長(zhǎng)。

25、有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀，即每孔先后測(cè)讀兩次，第一次在最適波 長(zhǎng)（W1），第二次在不敏感波長(zhǎng)（W2），兩次測(cè)定間不移動(dòng)ELISA板的位置。例如OPD用492nm為W1，630nm為W 2，最終測(cè)得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長(zhǎng)式測(cè)讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。,44,結(jié)果判斷 定性測(cè)定 定性測(cè)定的結(jié)果判斷是對(duì)受檢標(biāo)本中是否含有待測(cè)抗原或抗體作出“有”或“無(wú)”的簡(jiǎn)單回答，分別用“陽(yáng)性”、“陰性”表示?！瓣?yáng)性”表示該標(biāo)本在該測(cè)定系統(tǒng)中有反應(yīng)。“陰性”則為無(wú)反應(yīng)。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果，即用滴度來(lái)表示反應(yīng)的強(qiáng)度，其實(shí)質(zhì)仍是一個(gè)定性試驗(yàn)。在這種半定量測(cè)定中，將標(biāo)本作一系

26、列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性更具定量意義。 在間接法和夾心法ELSIA中，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。兩類(lèi)反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。,45,（1） 間接法和夾心法這類(lèi)反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。目視標(biāo)本也無(wú)色或近于無(wú)色者判為陰性，顯色清晰者為陽(yáng)性。但在ELSIA中，正常人血清反應(yīng)后?？沙霈F(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實(shí)驗(yàn)的條件不同而異，因此實(shí)驗(yàn)中必須加測(cè)陰性對(duì)照。陰性對(duì)照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類(lèi)似物。在用肉眼判

27、斷結(jié)果時(shí)，更宜用顯色深于陰性對(duì)照作為標(biāo)本陽(yáng)性的 指標(biāo)。目視法簡(jiǎn)捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應(yīng)該用比色計(jì)測(cè)定吸光值，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標(biāo)本（sample，S）、陽(yáng)性對(duì)照（P）、和陰性對(duì)照（N）的吸光值，然后進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算方法有多種，大致可分為陽(yáng)性判定值法和標(biāo)本與陰性對(duì)照比值法兩類(lèi)。,46,a 陽(yáng)性判定值陽(yáng)性判定值（cut-off value）一般為陰性對(duì)照A值加上一個(gè)特定的常數(shù)，以此作為判斷結(jié)果陽(yáng)性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。用此法判斷結(jié)果要求實(shí)驗(yàn)條件十分恒定，試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化，陽(yáng)性和陰性的對(duì)照品應(yīng)符合一定的規(guī)格，須配用精密的儀器，并嚴(yán)格按 規(guī)定操作。陽(yáng)性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的

28、系統(tǒng)中通過(guò)對(duì)大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)而得到的。現(xiàn)舉某種檢測(cè)HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對(duì)照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿，陽(yáng)性對(duì)照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=92ng /ml。每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照。測(cè)得A值后，先計(jì)算陰性對(duì)照A值的平均數(shù)（NCX）和陽(yáng)性對(duì)照A值的平均數(shù)（PCX），兩個(gè)平均數(shù)的差（P-N）必須大于一個(gè)特定的數(shù)值（例0.400），試驗(yàn)才有效。3個(gè)陰性 對(duì)照A值均應(yīng)0.5NCX，并1.5NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個(gè)陰性對(duì)照重新計(jì)算NCX；如有兩個(gè)陰性對(duì)照A值超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無(wú)效。陽(yáng)性判定值按下式計(jì)算：陽(yáng)性判定值=NCX+0.05標(biāo)本A值

29、陽(yáng)性判定值的為陽(yáng)性，小于陽(yáng)性判定值的為陰性。應(yīng)注意的是，式中0.05為該試劑盒的常數(shù)，只適合于該特定條件下，而不是 對(duì)各種試劑均可通用。根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照也起到試驗(yàn)的質(zhì)控作用，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會(huì)產(chǎn)生試驗(yàn)無(wú)效的后果。,47,b.標(biāo)本/陰性對(duì)照比值在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（S）和陰性對(duì)照（N）的A值后，計(jì)算S/N值。也有寫(xiě)作P/N的，這里的P不代表陽(yáng)性(positive)，而是病人（pati ent）的縮寫(xiě)，不應(yīng)誤解。為避免混淆，更宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)多為

30、 各種測(cè)定所沿用。實(shí)際上每一測(cè)定系統(tǒng)應(yīng)該用實(shí)驗(yàn)求出各自的S/N的閾值。更應(yīng)注意的是，N所代表的陰性對(duì)照是不含受檢物質(zhì)的人血 清。有的試劑盒中所設(shè)陰性對(duì)照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液，以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此 ，這類(lèi)試劑盒規(guī)，如N0.05（或其他數(shù)值），則按0.05計(jì)算，否則將出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。,48,競(jìng)爭(zhēng)法 在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。陰性呈色的強(qiáng)度取決于反應(yīng)中酶結(jié)合物的濃度和加入競(jìng)爭(zhēng)抑制物的量，一般調(diào)節(jié)陰性對(duì)照的吸光 度在1.0-1.5之間，此時(shí)反應(yīng)最為敏感。 競(jìng)爭(zhēng)法ELISA不易用自視判斷結(jié)果，因肉眼很難辨別弱陽(yáng)性反應(yīng)與陰性對(duì)照的顯色差異

31、，一般均用比色計(jì)測(cè)定，讀出S、P和N的吸光值。 計(jì)算方法主要也有兩種，即陽(yáng)性判定值法和抑制率法。,49,a. 陽(yáng)性判定值法 與間接法和夾心法中的陽(yáng)性判定值法基本相同，但在計(jì)算公式中引入陽(yáng)性對(duì)照A值，現(xiàn)舉某種檢測(cè)抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對(duì)照為不含抗HBc的復(fù)鈣人血漿，陽(yáng)性對(duì)照中抗HBc含量為1251 00u/ml。每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照。測(cè)得A值后，先計(jì)算陰性對(duì)照A值的平均值（NCX）和陽(yáng)性對(duì)照A值的平均數(shù)（PCX），兩個(gè)平均數(shù)的差（N-P）必須大于一個(gè)特定的數(shù)值（例如0.300）,試驗(yàn)才有效。3個(gè)陰 性對(duì)照A值均應(yīng)小于2.000，而且應(yīng)0.5NCX并1.5NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而以另2個(gè)陰性對(duì)照重新計(jì)算NCX；如有2個(gè)陰性對(duì)照A超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無(wú)效。陽(yáng)性判定值按下式計(jì)算：陰性判定值=0.4NCX+0.6PCX標(biāo)本A值陽(yáng)性判定值的反應(yīng)為陽(yáng)性，A陽(yáng)性判定