碩士生物儀器分析之熒光.ppt

1、熒光光譜 Fluorescence,幾乎所有物質(zhì)分子都有吸收光譜，但不是所有物質(zhì)都會發(fā)熒光。 產(chǎn)生熒光必須具備以下兩個(gè)必要條件：, 該物質(zhì)的分子必須具有能吸收激發(fā)光的結(jié)構(gòu)，通常是共軛雙鍵結(jié)構(gòu)。 吸收了與本身特征頻率相同的能量之后的物質(zhì)分子，必須具有高的熒光效率。許多吸光物質(zhì)并不產(chǎn)生熒光，主要是因?yàn)樗鼈儗⑺漳芰肯挠谂c溶劑分子或其它分子之間的相互碰撞中，還可能消耗于一次光化學(xué)反應(yīng)中，因而無法發(fā)射熒光，即熒光效率很低。,某些物質(zhì)被一定波長的光照射時(shí)，會在一定時(shí)間內(nèi)發(fā)射出波長比入射光長的光，如果這個(gè)時(shí)間比較短，這種光就稱為熒光。熒光由一種能發(fā)熒光的礦物 螢石(fluospar)而得名。 我們這里

2、要介紹的熒光，是指物質(zhì)在吸收紫外光和可見光后發(fā)出的波長較長的紫外熒光或可見熒光。 除了紫外光和可見光可能激發(fā)熒光外，其它的光如紅外光、X射線也可能激發(fā)出熒光，因此除紫外熒光或可見熒光外，還有紅外熒光、X射線熒光等。,用熒光抗體染色之原生動物,澳大利亞科學(xué)家最新發(fā)現(xiàn)，一種叫“螳螂蝦”的海里動物通過發(fā)出色彩鮮艷的熒光來恐嚇警告敵對者或者吸引性配偶.,K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306,green-fluorescent protein (GFP),2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),下村修(Osamu Shimomura)1928年出生于日本京都府，1960年獲得名古屋大

3、學(xué)理學(xué)博士學(xué)位后赴美，先后在美國普林斯頓大學(xué)、波士頓大學(xué)和伍茲霍爾海洋生物實(shí)驗(yàn)所工作。他1962年從一種水母中發(fā)現(xiàn)了熒光蛋白水母素，被譽(yù)為生物發(fā)光研究第一人。,馬丁沙爾菲(Martin Chalfie)出生于1947年，現(xiàn)年61歲，是美國哥倫比亞大學(xué)生物學(xué)教授。他獲獎(jiǎng)的主要貢獻(xiàn)在于向人們展示了綠色熒光蛋白（GFP）作為發(fā)光的遺傳標(biāo)簽的作用，這一技術(shù)被廣泛運(yùn)用于生理學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。,瑞典皇家科學(xué)院2008年10月8日宣布，美籍華裔科學(xué)家錢永健、美國生物學(xué)家馬丁沙爾菲和日本有機(jī)化學(xué)家兼海洋生物學(xué)家下村修共同獲得2008年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，將均分1000萬瑞典克朗（約合140萬美元）獎(jiǎng)金。幫助他們獲獎(jiǎng)

4、的是綠色熒光蛋白。這種蛋白為生物與醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)帶來革命，它發(fā)出的熒光像一盞明燈，幫助研究人員照亮生命體在分子層面和細(xì)胞層面的諸多反應(yīng)。,由于綠色熒光蛋白用紫外線一照就發(fā)出鮮艷綠光，研究人員將綠色熒光蛋白基因插入動物、細(xì)菌或其他細(xì)胞的遺傳信息之中，讓其隨著這些需要跟蹤的細(xì)胞復(fù)制，可“照亮”不斷長大的癌癥腫瘤、跟蹤阿爾茨海默氏癥（Alzheimers Disease ）對大腦造成的損害、觀察有害細(xì)菌的生長，或是探究老鼠胚胎中的胰腺如何產(chǎn)生分泌胰島素的細(xì)胞。,蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光,蛋白質(zhì)的熒光主要是色氨酸殘基的熒光。,利用蛋白質(zhì)中的芳香組氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)具有吸收紫外區(qū)域的入射光從而發(fā)射熒光的特性，研究蛋

5、白質(zhì)在變性或復(fù)性過程中整體空間構(gòu)象的變化。,蛋白質(zhì) 變性,l max,紅移,蛋白質(zhì) 復(fù)性,l max,藍(lán)移,E.Coil,E.Coil,蛋白質(zhì)的外源熒光,核殼熒光納米顆粒與活細(xì)胞的生物親和性研究,HNE1細(xì)胞與二氧化硅殼熒光納米顆粒的生物親和性，連續(xù)培養(yǎng)10天，細(xì)胞傳代四次。（a）沒有吞噬納米顆粒的細(xì)胞；（b）吞噬納米顆粒的細(xì)胞。,結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：入射光的激發(fā)光與熒光探測方向垂直 光源：汞燈、氙燈等 (200800 nm) 測能發(fā)射熒光的物質(zhì),Fluorescence spectrometer,Fluorescence Quartz cuvette,UV-vis Quartz cuvette,熒光光

6、譜儀,X射線熒光光譜儀,Fluorescence spectrometer,熒光分光光度計(jì) 970CRT型 波長范圍：激發(fā)(EX) 200800 nm； 發(fā)射(EM) 200800 nm； 狹縫：激發(fā)(EX)2、5、10、20nm 4檔； 發(fā)射(EM)2、5、10、20、30、 40nm 6檔信號噪音比： 蒸餾水的拉曼峰S/N比大于100/高靈敏度高信號噪音比，S/N比達(dá)100以上； 雙單色器系統(tǒng)結(jié)構(gòu)； 每臺 97000.00元。,熒光輻射的波長比激發(fā)光波長長，測量到的熒光頻率與入射光的頻率不同； 熒光在各個(gè)方向上都有發(fā)射，因此可以在與入射光成直角的方向上檢測； 這樣，熒光不受來自激發(fā)光的本底

7、的干擾，靈敏度大大高于紫外-可見吸收光譜，測量用的樣品量很少，且測量方法簡便。,1. 靈敏度高,2. 能提供較多的參數(shù)，例如激發(fā)譜、發(fā)射譜、峰位、峰強(qiáng)度、熒光壽命、熒光偏振度等。,3. 還可以檢測一些紫外-可見吸收光譜檢測不到的時(shí)間過程過程。紫外和可見熒光涉及的是電子能級之間的躍遷，熒光產(chǎn)生包括兩個(gè)過程：吸收以及隨之而來的發(fā)射。,熒光光譜法的特點(diǎn),熒光光譜法在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用,1. 利用蛋白質(zhì)的天然熒光檢測蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化 2. 利用熒光探針檢測蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化 3. 測定蛋白質(zhì)的含量 4. 測定酶的活性 5. 研究小分子與蛋白質(zhì)間的相互作用,藥物與蛋白質(zhì)相互作用的熒光光譜法研究概述 槲皮素

8、和蘆丁與牛血清白蛋白相互作用研究 熒光法研究咖啡因和茶堿與牛血清白蛋白相互作用 喹諾酮類藥物對人血清白蛋白的熒光猝滅研究 熒光檢測藻藍(lán)蛋白 熒光分光光度法測定餐具洗滌劑中熒光增白劑,標(biāo)準(zhǔn)曲線法 內(nèi)標(biāo)法,Fluorescence microscope,熒光顯微鏡是以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。 熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。 細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光。 熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。,熒光顯