中藥制劑分析第四章、中藥制劑的含量測(cè)定.ppt

1、第四章 中藥制劑的含量測(cè)定,內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院 藥物分析教研室,教學(xué)基本要求 掌握中藥制劑含量測(cè)定中樣品處理的方法 掌握可見(jiàn)-紫外光譜法的基本原理；熟悉運(yùn)用雙波長(zhǎng)測(cè)定法、三波長(zhǎng)測(cè)定法、差示光譜法進(jìn)行中藥成分定性、定量的原理和方法，了解導(dǎo)數(shù)光譜法的原理和操作。,掌握薄層色譜法的基本原理，定性、定量方法；掌握高效液相色譜法的基本原理，定性、定量方法；掌握各類高效液相色譜法分離條件的選擇；了解高效液相色譜儀的組成及應(yīng)用；了解液相色譜的新進(jìn)展。,掌握氣相色譜法的基本原理，定性、定量方法； 熟悉氣相色譜分離條件的選擇；了解氣相色譜儀的工作原理，了解檢測(cè)器的類型。 熟悉熒光分析法的基本原理及定性、定量方法；了解

2、庫(kù)侖電量法、離子選擇電極、原子吸收光譜及冷原子技術(shù)。,中藥制劑的含量測(cè)定是質(zhì)量控制的一項(xiàng)中藥指標(biāo)。 含量測(cè)定是研究某種成分的含量高低是否符合規(guī)定來(lái)判斷藥物的優(yōu)劣。 含量測(cè)定已成為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制中必不可少的一個(gè)項(xiàng)目。,第一節(jié) 含量測(cè)定樣品的處理,作用,1.將被測(cè)成分從樣品中釋放出來(lái) 2.除去雜質(zhì)，純化樣品 3.富集濃縮或進(jìn)行衍生化 4.使試樣的形式及所用溶劑符合分析測(cè)定的要求,一、樣品的粉碎 目的： 一是保證含量測(cè)定所取樣品均勻而又代表性提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度 二是使樣品中的被測(cè)組分能更快的提取出來(lái)。,二、樣品的提取,方法,1.冷浸法 2.回流提取法 3.連續(xù)回流提取法 4.超聲提取法 5.

3、超臨界流體提取法,三、樣品的分離凈化,方法,1.沉淀法 2.蒸餾法 3.液-液萃取法法 4.色譜法 5.固相微萃取技術(shù) 6.消化法,第二節(jié) 測(cè)定方法的驗(yàn)證,分析方法驗(yàn)證的目的是證明采用的方法是否適合于相應(yīng)檢測(cè)要求。在建立中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，分析方需經(jīng)驗(yàn)證；在處方、工藝等變更或改變?cè)治龇椒〞r(shí)，也需對(duì)分析方法進(jìn)行驗(yàn)證。方法驗(yàn)證過(guò)程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草說(shuō)明或修訂說(shuō)明中。,驗(yàn)證內(nèi)容有： 準(zhǔn)確度 精密度(包括重復(fù)性,中間精密度,重現(xiàn)性) 專屬性、 檢測(cè)限、定量限、 線性、范圍 耐用性。,一、準(zhǔn)確度 準(zhǔn)確度系指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的

4、范圍內(nèi)測(cè)試。用于定量測(cè)定的分析方法均需做準(zhǔn)確度驗(yàn)證。,1、測(cè)定方法的準(zhǔn)確度 可用已知純度的對(duì)照品做加樣回收測(cè)定，即于已知被測(cè)成分含量的供試品中再精密加入一定量的已知純度的被測(cè)成分對(duì)照品，依法測(cè)定。用實(shí)測(cè)值與供試品中含有量之差，除以加入對(duì)照品量計(jì)算回收率。,在加樣回收試驗(yàn)中須注意對(duì)照品的加入量與供試品中被測(cè)成分含有量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)；加入的對(duì)照品的量要適當(dāng)，過(guò)小則引起較大的相對(duì)誤差，過(guò)大則干擾成分相對(duì)減少，真實(shí)性差。 回收率%=（C-A）/B100%,2、數(shù)據(jù)要求 在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度的供試品，用6個(gè)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，或設(shè)計(jì)3個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度各分別制備3份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定

5、，用9個(gè)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，一般中間濃度加入量與所取供試品含量之比控制在1：1左右。,二、精密度 精密度系指在規(guī)定的測(cè)試條件下，同一個(gè)均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。 精密度包含重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性。,三、專屬性 專屬性系指在其他成分可能存在的條件下，采用的方法能夠正確測(cè)定出被測(cè)成份的特征。 考察一個(gè)分析樣品的專屬性時(shí)，應(yīng)著重考察共存組分是否對(duì)被測(cè)組分的測(cè)定有干擾。,四、線性 線性系指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi),測(cè)試結(jié)果與供試品中被測(cè)物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。 應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系。可用一貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一

6、系列供試品的方法進(jìn)行測(cè)定，至少制備5個(gè)濃度的供試品。以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)作為被測(cè)物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。,五、范圍 系指能達(dá)到一定精密度,準(zhǔn)確度和線性,測(cè)試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。 范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果及要求確定。對(duì)于有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分，其范圍應(yīng)大于被限定含量的區(qū)間。,六、耐用性 系指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，為使方法用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)，開(kāi)始研究分析方法時(shí)，就應(yīng)考慮其耐用性。 經(jīng)試驗(yàn)，應(yīng)說(shuō)明小的變動(dòng)能否通過(guò)設(shè)計(jì)的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，以確保方法有效。,第三節(jié) 常用定量分析方法,一、

7、化學(xué)分析法,包括重量分析和滴定分析 所用儀器簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，主要用于制劑中含量較高的一些成分或礦物藥 制劑中的無(wú)機(jī)分析 靈敏度低，操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，專屬性不高，對(duì)微量成分測(cè)定的準(zhǔn)確性不理想,（一）重量分析法 分為揮發(fā)法，萃取法和沉淀法 揮發(fā)法：測(cè)定具有揮發(fā)性或定量轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性物質(zhì)的組分含量 萃取法：根據(jù)被測(cè)組份在互不相溶的兩相中溶解度不同，達(dá)到分離的目的 沉淀法：將被測(cè)組份定量專為難溶性化合物，測(cè)定其含量的方法，適用于制劑中純度較高的成分。,（二）滴定分析法 分為酸堿滴定，沉淀滴定，配位滴定，氧化還原滴定等 酸堿滴定法適用于中藥制劑中所含的生物堿，有機(jī)酸組分的含量 沉淀法分為銀量法，四苯硼鈉法

8、和亞鐵氰化鉀法等，中藥用于測(cè)定生物堿，生物堿的氫鹵酸鹽以及含鹵素的其他有機(jī)成分的含量。,常用的配位滴定法包括EDTA法和硫氫酸銨法，用于測(cè)定鞣質(zhì)、生物堿及含有Ca2+、Mg2+、Fe3+，Hg2+等礦物類制劑的含量 氧化還原滴定法適用于測(cè)定具有氧化還原性的物質(zhì)。,是中藥及其制劑含量測(cè)定的常用方法，具有靈敏度高，精度好，造作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。 要求被測(cè)組分本身或其顯色產(chǎn)物對(duì)可見(jiàn)-紫外光具有選擇性吸收。 按測(cè)定波長(zhǎng)不同可分為單波長(zhǎng)光度法和計(jì)算分光光度法。,二、可見(jiàn)-紫外分光光度法,（一）單波長(zhǎng)光度法 測(cè)定前，必須經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶崛?，凈化，或采用專屬的顯色反應(yīng)等步驟來(lái)排除干擾。 選擇max進(jìn)行定量分析，而共存

9、組分在此波長(zhǎng)處基本無(wú)吸收 吸收度讀數(shù)控制在0.3-0.7之間,1. 吸收系數(shù)法 按各品種項(xiàng)下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計(jì)算含量。用本法測(cè)定時(shí)，吸收系數(shù)通常應(yīng)大于100，并注意儀器的校正和檢定。,2 對(duì)照品比較法 按各品種項(xiàng)下的方法，分別配制供試品溶液和對(duì)照品溶液，對(duì)照品溶液中所含被測(cè)成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測(cè)成分規(guī)定量的10010,所用溶劑也應(yīng)完全一致。,3.標(biāo)準(zhǔn)曲線法 先配制一系列濃度不同濃度的對(duì)照品溶液,在相同條件下測(cè)定吸收度,繪制A/C曲線或求出其回歸直線方程（r0.999）,即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下測(cè)定供試品的吸光度,求得供試

10、品中被測(cè)組分的濃度或含量. 在比色法中最常用.,（二）計(jì)算分光光度法 供試液中若有兩種（兩種或兩種以上）組分共存，其紫外光譜彼此發(fā)生不同程度的重疊時(shí)，則可通過(guò)測(cè)定多個(gè)波長(zhǎng)處的吸收度，根據(jù)吸收度的加和性，采用適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)處理方式進(jìn)行多組分的同時(shí)測(cè)定，或者用其排除共存組分的干擾，測(cè)定其中某個(gè)組分。,三.薄層色譜掃描法 系指用一定波長(zhǎng)的光照射在薄層板上，對(duì)薄層色譜中可吸收紫外光或可見(jiàn)光的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)用于藥品的鑒別、檢查或含量測(cè)定。,同HPLC相比：具有實(shí)驗(yàn)成本低，流動(dòng)相的選擇與更換方便等優(yōu)點(diǎn) 是藥物制劑中常用的分析方法之一 2005版中國(guó)藥典中

11、有35中中成藥的含量測(cè)定才有薄層掃描法,（一）基本原理 一般是指波層色譜斑點(diǎn)的色譜掃描 固定波長(zhǎng)，斑點(diǎn)移動(dòng)，測(cè)定A-l或F-l曲線 根據(jù)波層掃描的測(cè)定方式可分為薄層吸收掃描法和薄層熒光掃描法,1.薄層吸收掃描法 適用于在可見(jiàn)、紫外區(qū)有吸收的物質(zhì)，及通過(guò)色譜前或色譜后衍生成上述化合物的樣品組分，可分別以氘燈和鎢燈為光源，在200-800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)選擇合適波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。 斑點(diǎn)中物質(zhì)的濃度與吸光度的關(guān)系需要用Kubelka-Munk理論及曲線來(lái)描述,Kubelka-Munk理論以斑點(diǎn)的相對(duì)反射率和相對(duì)透光率表示薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度，說(shuō)明了固定相的散射參數(shù)SX對(duì)斑點(diǎn)中物質(zhì)的濃度與吸收度間關(guān)系的影響

12、，從而獲得不同散射參數(shù)SX時(shí)斑點(diǎn)的A-KX理論曲線，即Kubelka-Munk曲線。 Kubelka-Munk曲線時(shí)薄層掃描法進(jìn)行定量分析的理論依據(jù),2.薄層熒光掃描法 適用于本身具有熒光或經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理后可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的測(cè)定，光源用訕燈或汞燈，采用直線式掃描。 專屬性強(qiáng)，靈敏度比吸收法高1-3個(gè)數(shù)量級(jí)，最低可測(cè)到10-50pg樣品，但使用范圍窄,當(dāng)溶液濃度很稀時(shí)(ECl0.05)，熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)I0及物質(zhì)的濃度C的關(guān)系為 F=2.3KI0ECl 或F=KC K為常數(shù)（與熒光效率有關(guān)），L為薄層板厚度，E為吸光系數(shù),Kubelka-Munk理論不適用于薄層熒光掃描，無(wú)需進(jìn)行曲線校直 用薄層

13、熒光掃描進(jìn)行定量分析時(shí)，用斑點(diǎn)熒光強(qiáng)的的積分值與斑點(diǎn)中組分的含量代替上式中的F與C進(jìn)行運(yùn)算。,（二）定量分析方法 1.方法學(xué)考察 （1）工作曲線 目的是： 檢驗(yàn)所選擇的散射參數(shù)SX是否合適 考察工作曲線是否通過(guò)原點(diǎn)，以便確定采用一點(diǎn)法或兩點(diǎn)法定量 確定點(diǎn)樣量的線性范圍,（2）分離度： 用于限量檢查和含量測(cè)定時(shí)，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，分離（R）的計(jì)算公式為： R=2（d2-d1）/(W1+W2) 式中：d2為相鄰兩峰中后一峰與原點(diǎn)的距離；d1為相鄰兩峰中前一峰與原點(diǎn)的距離； W1及W2為相鄰兩峰各自的峰寬。 除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.0。,（3）重復(fù)性 同一供試品溶液在同一薄

14、層板上平行點(diǎn)樣的待測(cè)成分的峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于3.0%；需顯色后測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5.0%。,（4）準(zhǔn)確度考察 常用加樣回收率來(lái)衡量，其值應(yīng)在95%-105%之間，測(cè)定數(shù)據(jù)一般為5-6個(gè) （5）統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn) 包括F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn),2.定量方法,（1）外標(biāo)法 （2）內(nèi)標(biāo)法 （3）回歸曲線定量法,外標(biāo)一點(diǎn)法 外標(biāo)兩點(diǎn)法,四、氣相色譜法 （一）基本原理 氣化后的試樣被載氣帶入色譜柱，由于各組分在兩相間的作用不同，在色譜柱中移動(dòng)有快有慢，經(jīng)一定柱長(zhǎng)后得到分離，以此被載氣帶入檢測(cè)器，將各組分濃度或質(zhì)量變化轉(zhuǎn)化為電信號(hào)變化記錄為色譜圖，利用色譜峰保留值進(jìn)行定性分析，利用峰面積或峰高進(jìn)行定量分析。,(1) 色譜柱的理論板數(shù)(n),n,（ ）,tR,=5.54,tR,W1/2,=16,（ ）,tR,W,（ ）,2.速率理論,H=A+B/u+Cu,3.分離度,2(tR2tR1) R W1W2,4.系統(tǒng)適應(yīng)性 （1）色譜柱的理論塔板數(shù) （2）分離度 R1.5 （3）重復(fù)性 2.0% （4）拖尾因子 0.95-1.05,（二）實(shí)驗(yàn)條件的選擇 1.固定相的選擇 2.柱溫的選擇 3.載氣的選擇 4.其他條件的選擇 5.檢測(cè)器,（三）定量分析方法,（1）內(nèi)標(biāo)法加校正因子 （