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1、第三章 植物組培快繁程序,植物快速繁殖就是應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù),快速繁殖名優(yōu)特新品物,使其在較短時(shí)間內(nèi)繁衍較多的植株??旆笔钱?dāng)前植物細(xì)胞組織培養(yǎng)中應(yīng)用最廣泛,又最有效的方法之一。,一、供體植株的培養(yǎng)與取材 二、外植體的滅菌與接種 三、培養(yǎng) 四、馴化移栽 五、組培快繁計(jì)劃安排與實(shí)施,主要內(nèi)容,一、供體植株的培養(yǎng)與取材 一般來說,無論何種類型的細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù),起始階段均涉及外植體取材、滅菌與接種培養(yǎng)等基本過程。 外植體來源的環(huán)境以及外植體的類型,均會影響將來培養(yǎng)的效果,而滅菌、接種和培養(yǎng)條件的選擇與控制,也與外植體的來源和類型有關(guān)。,1、外植體的來源 -生長在自然環(huán)境下的植物 -有目的地培育在溫室控
2、制條件下生長的植物 -無菌環(huán)境下已經(jīng)過離體培養(yǎng)的植物 自然環(huán)境中生長的植株,一般帶有微生物,甚至與某些微生物具有寄生關(guān)系,使植株具有內(nèi)生菌。取自這些植物的外植體,在培養(yǎng)過程中會有微生物滋生,從而影響培養(yǎng)效果。,自然環(huán)境生長植株,溫室控制條件下生長植株,已離體培養(yǎng)植株,在多數(shù)情況下,應(yīng)盡量使用溫室或人工氣候室控制培養(yǎng)的植物材料作為外植體來源,減少培養(yǎng)過程中的微生物感染概率。同時(shí),生長在控制條件下的植物可以保持培養(yǎng)材料間的一致性,提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性,也便于培養(yǎng)技術(shù)的規(guī)范。,某些多年生植物或特殊材料,必須取自自然生長的植物,就需要盡可能避免使用那些生長過于潮濕和不潔凈環(huán)境中的植物。對于培養(yǎng)過程中可能
3、出現(xiàn)內(nèi)生菌污染的材料,應(yīng)盡量取生長旺盛期的生長點(diǎn)部位作為起始培養(yǎng)的材料。,2、供體植株的管理 取自室外的外植體材料,供體植株的管理十分重要,這與外植體培養(yǎng)時(shí)的污染率密切相關(guān)。植株管理中應(yīng)注意: 避免昆蟲危害 許多昆蟲如蚜蟲、螨類和飛虱是許多植物病蟲害的傳播媒介,會引起植物組織的潛在感染。,注意防病 尤其是真菌和細(xì)菌病害的侵染,取自感病植株的外植體,在培養(yǎng)中的污染率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于來自健康植株的外植體,必要時(shí)需使用化學(xué)藥劑防治病害。 控制濕度 給供體植株澆水時(shí)應(yīng)從根部給水,避免從上部澆水,以免上部形成易于病原侵染的濕度環(huán)境;盡可能降低溫室濕度;取材前盡可能保持植株干爽。,3、材料取材 材料選擇 培養(yǎng)材料
4、應(yīng)選擇有代表性的主要植物、選擇性狀優(yōu)良的種質(zhì)或特殊的基因型。 快速繁殖時(shí)應(yīng)在植株生長的最適時(shí)期取材,如花藥培養(yǎng)應(yīng)在花粉發(fā)育到單核期取材。,取材 從生長健壯的無病蟲害的植株上選取發(fā)育正常的器官和組織。最好采用莖尖,后代性狀較穩(wěn)定,攜帶細(xì)菌較少。 選取材料的大小一般在0.5-1.0cm之間。胚胎培養(yǎng)或脫毒在0.5cm以下。材料太大易污染,材料太小難于成活。,1、預(yù)處理 先對植物材料進(jìn)行修剪整理,去掉不需要部分,將準(zhǔn)備使用的植物材料(外植體)在流水中沖洗20-60分鐘,備用。如特別不潔的外植體,可先用加有洗滌劑的水清洗10-15分鐘,再用流水沖洗干凈。,二、外植體的滅菌與接種,2、表面滅菌 (1)操
5、作人員穿戴滅過菌的工作服、口罩。進(jìn)入接種室前雙手用洗滌劑清洗干凈,操作前再用70%酒精或消毒劑擦洗雙手。 (2)操作期間雙手和臺面常用70%酒精或消毒劑擦拭。超凈工作臺使用前必須用紫外燈照射殺菌,然后開啟風(fēng)機(jī)。,(3)接種用工具(解剖刀、剪刀、鑷子)可放入70-75%酒精中,使用時(shí)需火焰灼燒滅菌,冷卻后使用。 (4)外植體放入超凈工作臺內(nèi),置70-75%酒精中5-60 秒,0.1氯化汞6-10分鐘,或10%的漂白粉上清液中10-15分鐘,然后用無菌水沖洗3-5次。滅菌時(shí)需進(jìn)行攪動。,常用滅菌藥劑的使用和效果,(1)材料吸干后,一手拿鑷子,一手拿剪子或解剖刀,對材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈睢H缛~片切成0.
6、5cm見方的小塊;莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要剝成只含l2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械,防止交叉污染。 (2)解開包口紙,將培養(yǎng)瓶口幾乎水平拿著,避免灰塵落入瓶中。使瓶囗靠近酒精燈火焰,并將瓶口在火焰上方轉(zhuǎn)動,使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。,3、外植體的接種,(3)迅速用鑷子夾取切割分離下的所需組織、細(xì)胞、器官,送入培養(yǎng)容器內(nèi),輕輕插入培養(yǎng)基。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上,以放13塊為宜。接完種后,將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘。然后及時(shí)蓋上瓶蓋或封口。,注意: 所有操作均應(yīng)嚴(yán)格保持瓶口在操作區(qū)以內(nèi),且不遠(yuǎn)離酒精燈;工具用后應(yīng)及時(shí)滅菌,避免交叉污染;工作人員操作時(shí)禁止不必要的談話。,
7、三、培養(yǎng),指把離體植物材料放在培養(yǎng)室(有光照、溫度條件)里,使之生長,分裂和分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程。,1、培養(yǎng)含義,2、培養(yǎng)方法,(1)固體培養(yǎng)法 即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在最常用的方法。 (2)液體培養(yǎng)法 即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。,培養(yǎng)步驟,初代培養(yǎng),繼代培養(yǎng),生根培養(yǎng),3、培養(yǎng)步驟,(1)初代培養(yǎng),目的:獲得無菌材料和無性繁殖系。無性繁殖系:是指由一個(gè)外植體繼代增殖,繁殖出的具有相同遺傳物質(zhì)的植株群體。包括:芽叢、不定芽、胚狀體、原球莖等。,培養(yǎng)基:誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基中CTK多,IAA少。,類型(根據(jù)發(fā)育方向): 叢生
8、芽增殖型器官發(fā)生型 胚狀體發(fā)生型 原球莖發(fā)生型,根、芽,胚狀體,根、芽,愈傷組織,芽,根,芽,外植體,試管苗,原球莖,根、芽,外植體成苗途徑,根,頂芽,腋芽,叢生芽增殖型,微型扦插,頂芽,CTK刺激,帶芽的莖切段,側(cè)芽,接種培養(yǎng),形成的莖梢節(jié)長,直立向上呈小灌木叢狀,獲得較多嫩莖梢,莖段培養(yǎng)繼代擴(kuò)繁,試管苗,生根培養(yǎng),無愈傷組織產(chǎn)生,初代,繼代,叢生芽增殖型,器官發(fā)生型,脫分化,分化,愈傷組織,芽、芽叢,切割芽叢 繼代培養(yǎng),大量芽叢,試管苗,生根培養(yǎng),外植體,初代,繼代,器官發(fā)生型,愈傷組織培養(yǎng),愈傷組織,具分裂能力的細(xì)胞,已分化細(xì)胞,脫分化,繼 代,愈傷組織,分 裂,誘導(dǎo)期,分裂期,分化期,
9、愈傷組織誘導(dǎo), 雙子葉植物單子葉植物和裸子植物, 幼年細(xì)胞和組織成年細(xì)胞和組織, 二倍體細(xì)胞單倍體細(xì)胞, 根據(jù)培養(yǎng)目的選取外植體,愈傷組織誘導(dǎo), 外植體大小一般為0.5cm的圓柱形或方形塊, 添加植調(diào)劑和天然提取物利于誘導(dǎo)和維持, 生長旺盛的愈傷組織一般呈乳黃色或白色或淺綠色或綠色,老化的多為黃色或褐色,脫分化因植物種類、器官及生理狀況有大差異:,禾谷類植物脫分化較難。,細(xì)嫩組織脫分化較易;成熟組織較難。,花器脫分化較易;莖葉難。,誘導(dǎo)期,誘導(dǎo)期長短與植物種類、生理狀態(tài)有關(guān)。,誘導(dǎo)期長短與環(huán)境因素有關(guān)。,母株生長在弱光下的外植體易于誘導(dǎo),分裂頻率高。,增加O2和迅速釋放CO2利于細(xì)胞分裂。,添
10、加植調(diào)劑誘導(dǎo)分裂效果好。,合成代謝迅速。,分裂期,特征: 細(xì)胞分裂快,結(jié)構(gòu)疏松,缺少有組織的結(jié)構(gòu),顏色淺而透明。,分化期,特征: 形成瘤狀結(jié)構(gòu)的外表和內(nèi)部分化;出現(xiàn)多種類型的細(xì)胞。,石龍芮下胚軸培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體過程,體細(xì)胞胚狀體發(fā)生型,外 植 體,愈傷組織,小孢子,游離單細(xì)胞,器官,胚 狀 體,試 管 苗,體細(xì)胞胚狀體發(fā)生型,胚狀體形成植株的特征:,1.具兩極性,2.胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系,3.胚狀體的維管組織的分布是獨(dú)立的“Y”形,4.數(shù)量多,速度快,結(jié)構(gòu)完整,成苗率高,原球莖:縮短的、呈珠粒狀的、由胚性細(xì)胞組成的、類似嫩莖的器官。,原球莖發(fā)生型,1.初代培養(yǎng)時(shí)外
11、植體發(fā)育途徑有幾條? 2.正常的愈傷組織一般為何種顏色?其誘導(dǎo)有何特點(diǎn)?,思考題:,目的:擴(kuò)繁無根苗(生產(chǎn)上邊擴(kuò)繁邊生根)。,擴(kuò)繁方法:以幾何級數(shù)增加,可切割莖段,分離芽叢、胚狀體、原球莖。,培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基或分化培養(yǎng)基,實(shí)質(zhì):增殖培養(yǎng)物。,(2)繼代培養(yǎng),(3)壯苗和生根培養(yǎng),生根培養(yǎng)基:12或14MS基本培養(yǎng)基;不加或少加CTK,適量添加NAA;糖濃度1-1.5%。,培養(yǎng)條件:增加光強(qiáng),達(dá)3000-10000lx。,壯苗,生根方法與途徑,新梢基部浸入50或100ppmIBA液48h;,在含IAA類培養(yǎng)基中培養(yǎng)46d;,移入含活性碳的生根培養(yǎng)基培養(yǎng)。,其它方法,生根困難的則在培養(yǎng)基中搭濾紙
12、橋或按,生根其它方法,延長在增殖培養(yǎng)時(shí)間,降低增殖倍率,減少CTK用量,對易生根植物,切割粗壯嫩枝在營養(yǎng)缽中直接生根,胚狀體發(fā)育成小苗不經(jīng)生根階段,但需壯苗生根,接種只是完成了離體培養(yǎng)的第一步,植物離體培養(yǎng)和栽培植物一樣,生長過程中也受到各種環(huán)境因素的影響。培養(yǎng)條件是離體培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。在培養(yǎng)基條件適宜的基礎(chǔ)上,影響試管苗生長的主要因素有光照、溫度、濕度、氧氣。,(4)培養(yǎng)條件,光照,1)光強(qiáng) 影響外植體細(xì)胞的增殖、組織和器官的分化。一般培養(yǎng)室的光照強(qiáng)度要求10005000lx。,愈傷組織的誘導(dǎo)有的在光照下有促進(jìn)作用;光照強(qiáng),幼苗生長健壯;光照弱,幼苗生長弱小,容易徒長。,不同波長的光對細(xì)
13、胞的分裂和器官的 分化有影響。,2)光質(zhì),白光促進(jìn)小花天竺葵愈傷組織 的生長,藍(lán)光則無作用。,如:紅光促進(jìn)楊樹愈傷組織的生長,藍(lán)光阻礙其生長。,3)光照時(shí)間,根據(jù)植物生物學(xué)特性決定; 光照長短對試管內(nèi)花的形成是個(gè)重要影響因素,一般給予周期性光照比較好。多數(shù)植物8-10小時(shí)黑暗為宜。光周期長短因植物種類而異。在胡蘿卜組織培養(yǎng)中隨著日照長度的增加,而促進(jìn)生長。,1)大多數(shù)植物23-32,一般控制在252C。低于15C或高于35C,對生長都是不利的。 2)植株種類及外植體的不同,其最適溫度也是不同的。如百合20;月季2527;番茄28。,溫度,濕度,1)瓶內(nèi)的濕度: 一般為100,主要受到培養(yǎng)基含水
14、量和封口膜透性的影響。如培養(yǎng)基過硬,則不利于外植體接觸和插入培養(yǎng)基,導(dǎo)致生長遲緩;封口膜過于透氣,也會使瓶內(nèi)濕度下降。,濕度過低會使培養(yǎng)基喪失大量水分,滲透勢升高,影響材料對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,也會阻礙外植體的生長。濕度過高會造成雜菌滋長,導(dǎo)致大量污染。一般為7080%。,2)環(huán)境濕度:,1)培養(yǎng)基適宜pH值5-6.5,一般為5.8,調(diào)整用0.1M的NaOH和HCl溶液 。,pH值,2)H影響培養(yǎng)基的硬度。 H 6.5 培養(yǎng)基會變硬; H 5.0 培養(yǎng)基不易凝固。,3)滅菌之前,培養(yǎng)基的pH要比標(biāo)準(zhǔn)提高0.20.3個(gè)單位。,氣體(必要條件),1)培養(yǎng)瓶內(nèi)氧氣的充足與否與封口材料有關(guān)。 可用棉塞或特
15、制的封口塑料。通氣最好的是棉塞,但棉塞易使培養(yǎng)基干燥,夏季易引起污染。,2)培養(yǎng)基內(nèi)氧氣充足與否與培養(yǎng)基的種類和培養(yǎng)方式有關(guān)。 固體培養(yǎng)基可加進(jìn)活性炭來增加 通氣度,以利于發(fā)根。 液體培養(yǎng)時(shí),可考慮采取振蕩培 養(yǎng)的方式,以增加通氣性。,2)個(gè)大氣壓以上就對生長有阻礙作用,5個(gè)大氣壓生長就完全停止,個(gè)大氣壓細(xì)胞就不能生存。,滲透壓,1)1-2個(gè)大氣壓促進(jìn)生長。,復(fù)習(xí)思考題: 1.繼代培養(yǎng)有何意義?其目的和實(shí)質(zhì)是什么? 2.組培苗生根方法有哪些? 3.外植體成苗途徑有幾條?,四、馴化移栽,高溫且恒溫 高濕 弱光 無菌,1、試管苗生態(tài)環(huán)境與自然環(huán)境的差異,2、試管苗的特點(diǎn),生長細(xì)弱,角質(zhì)層不發(fā)達(dá) 光
16、合作用差 葉片氣孔數(shù)少,活性差 根吸收功能弱 對逆境的適應(yīng)性和抵抗能力較差,3、試管苗的馴化,目的:提高試管苗的適應(yīng)性,促其健壯,最終提高移栽成活率 原則: 從溫、光、濕度及有無雜菌等環(huán)境因素考慮。 馴化開始數(shù)天內(nèi),與培養(yǎng)環(huán)境條件相似;后期與預(yù)計(jì)栽培條件相似,逐步適應(yīng)。 方法:即煉苗。不開口自然光下2-3天,然后開口1-2天。,試管苗的移栽方法,組培馴化移栽常用基質(zhì),組培馴化移栽用穴盤,試管苗的移栽方法,試管苗的移栽,移栽方法:取出試管苗,全部輕洗去培養(yǎng)基栽入基質(zhì)(事先澆透水)后,栽后輕澆薄水, 移入高濕環(huán)境(90%以上)。 移栽場所:日光溫室塑料大棚馴化室 注意: 1.保持小苗水分供需平衡
17、2.防止菌類滋生 3.給予一定溫光條件 4.注意基質(zhì)配比并保持適當(dāng)?shù)耐庑?1)保持小苗水分供需平衡,1周內(nèi): 環(huán)境高濕,遮光。,1周后:,小苗生長后逐漸降濕,拱棚兩端通風(fēng)。,半個(gè)月后:,揭膜,控水,增加光強(qiáng)。,2)防止菌類滋生,基質(zhì)高壓滅菌或3h烘烤滅菌或太陽能滅菌。 適當(dāng)使用殺菌劑、消毒劑。 移栽時(shí)少傷苗。 噴水加0.1%尿素或1/2MS大量元素液追肥,加快苗生長。,3)給予一定溫光條件,適宜生根溫度:1820,溫度低可加地?zé)峋€。 移栽初期弱光,后逐漸加強(qiáng)光照,過渡到自然光照。,保持基質(zhì)通氣性: 選顆粒狀基質(zhì),澆水勿多。,4)注意基質(zhì)配比并保持適當(dāng)?shù)耐庑?基質(zhì)配比: 珍:蛭:草( 腐殖土
18、)=1:1:0.5 珍:草(腐殖土)=1:1,提高試管苗移栽成活率的途徑? 1、壯苗移栽比弱苗移栽成活率高 2、生長素(NAA)利于生根 3、低無機(jī)鹽濃度生根效果好 4、活性炭利于嫩莖生根 5、避免太陽直射,溫度25-30,濕度在85%以上 6、使試管苗逐漸從無菌向有菌過渡,組織培養(yǎng)工廠化育苗生產(chǎn)流程簡圖,五、組培快繁計(jì)劃安排與實(shí)施,商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的確定應(yīng)以市場需求為標(biāo)準(zhǔn),否則試管苗難以銷售,造成經(jīng)濟(jì)損失。 外植體的入瓶;器官形成及增殖;試管小植株出瓶等試管苗生產(chǎn)過程均是在無菌條件下進(jìn)行的,因此,試管苗生產(chǎn)規(guī)??梢杂脽o菌工作臺的數(shù)量來衡量的。,1.試管苗生產(chǎn)規(guī)模的確定,一般一個(gè)單人無菌工作臺可
19、年生產(chǎn)10萬15萬株苗,一個(gè)1.2m0.6m2.0m的6層培養(yǎng)架可年繁殖1.5萬2萬株試管苗。年產(chǎn)100萬株的組培苗生產(chǎn)工廠,需810個(gè)無菌工作臺,培養(yǎng)架4050個(gè)。接種室面積應(yīng)為4050m2,培養(yǎng)室面積則為100120m2。 培養(yǎng)容器的數(shù)量取決于生產(chǎn)規(guī)模,一個(gè)6層培養(yǎng)架(1.2mX0.6mX2.0m)可放置900個(gè)左右三角瓶或360個(gè)左右蘭花瓶,還需增加1015的周轉(zhuǎn)用培養(yǎng)容器。,馴化室可內(nèi)裝噴灌設(shè)施和可移動苗床。每平方米苗床可栽種800株試管苗,一茬苗的過渡周期為30d,年產(chǎn)100萬株苗的過渡培養(yǎng)室,建造面積應(yīng)為400600m2。,2.試管苗增殖率的估算,Y=xn,年增殖率,全年增殖周期數(shù)n=365/每周期天數(shù),每周期增殖倍數(shù),例如:增殖周期為1個(gè)月,增殖倍數(shù)為3, 則
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