植物組培快繁程序

1、第三章 植物組培快繁程序,植物快速繁殖就是應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù),快速繁殖名優(yōu)特新品物，使其在較短時(shí)間內(nèi)繁衍較多的植株?？旆笔钱?dāng)前植物細(xì)胞組織培養(yǎng)中應(yīng)用最廣泛，又最有效的方法之一。,一、供體植株的培養(yǎng)與取材 二、外植體的滅菌與接種 三、培養(yǎng) 四、馴化移栽 五、組培快繁計(jì)劃安排與實(shí)施,主要內(nèi)容,一、供體植株的培養(yǎng)與取材 一般來說，無論何種類型的細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)，起始階段均涉及外植體取材、滅菌與接種培養(yǎng)等基本過程。 外植體來源的環(huán)境以及外植體的類型，均會影響將來培養(yǎng)的效果，而滅菌、接種和培養(yǎng)條件的選擇與控制，也與外植體的來源和類型有關(guān)。,1、外植體的來源 -生長在自然環(huán)境下的植物 -有目的地培育在溫室控

2、制條件下生長的植物 -無菌環(huán)境下已經(jīng)過離體培養(yǎng)的植物 自然環(huán)境中生長的植株，一般帶有微生物，甚至與某些微生物具有寄生關(guān)系，使植株具有內(nèi)生菌。取自這些植物的外植體，在培養(yǎng)過程中會有微生物滋生，從而影響培養(yǎng)效果。,自然環(huán)境生長植株,溫室控制條件下生長植株,已離體培養(yǎng)植株,在多數(shù)情況下，應(yīng)盡量使用溫室或人工氣候室控制培養(yǎng)的植物材料作為外植體來源，減少培養(yǎng)過程中的微生物感染概率。同時(shí)，生長在控制條件下的植物可以保持培養(yǎng)材料間的一致性，提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，也便于培養(yǎng)技術(shù)的規(guī)范。,某些多年生植物或特殊材料，必須取自自然生長的植物，就需要盡可能避免使用那些生長過于潮濕和不潔凈環(huán)境中的植物。對于培養(yǎng)過程中可能

3、出現(xiàn)內(nèi)生菌污染的材料，應(yīng)盡量取生長旺盛期的生長點(diǎn)部位作為起始培養(yǎng)的材料。,2、供體植株的管理 取自室外的外植體材料，供體植株的管理十分重要，這與外植體培養(yǎng)時(shí)的污染率密切相關(guān)。植株管理中應(yīng)注意： 避免昆蟲危害 許多昆蟲如蚜蟲、螨類和飛虱是許多植物病蟲害的傳播媒介，會引起植物組織的潛在感染。,注意防病 尤其是真菌和細(xì)菌病害的侵染，取自感病植株的外植體，在培養(yǎng)中的污染率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于來自健康植株的外植體，必要時(shí)需使用化學(xué)藥劑防治病害。 控制濕度 給供體植株澆水時(shí)應(yīng)從根部給水，避免從上部澆水，以免上部形成易于病原侵染的濕度環(huán)境；盡可能降低溫室濕度；取材前盡可能保持植株干爽。,3、材料取材 材料選擇 培養(yǎng)材料

4、應(yīng)選擇有代表性的主要植物、選擇性狀優(yōu)良的種質(zhì)或特殊的基因型。 快速繁殖時(shí)應(yīng)在植株生長的最適時(shí)期取材，如花藥培養(yǎng)應(yīng)在花粉發(fā)育到單核期取材。,取材 從生長健壯的無病蟲害的植株上選取發(fā)育正常的器官和組織。最好采用莖尖，后代性狀較穩(wěn)定，攜帶細(xì)菌較少。 選取材料的大小一般在0.5-1.0cm之間。胚胎培養(yǎng)或脫毒在0.5cm以下。材料太大易污染，材料太小難于成活。,1、預(yù)處理 先對植物材料進(jìn)行修剪整理，去掉不需要部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料（外植體）在流水中沖洗20-60分鐘，備用。如特別不潔的外植體，可先用加有洗滌劑的水清洗10-15分鐘，再用流水沖洗干凈。,二、外植體的滅菌與接種,2、表面滅菌 （1）操

5、作人員穿戴滅過菌的工作服、口罩。進(jìn)入接種室前雙手用洗滌劑清洗干凈，操作前再用70%酒精或消毒劑擦洗雙手。 （2）操作期間雙手和臺面常用70%酒精或消毒劑擦拭。超凈工作臺使用前必須用紫外燈照射殺菌，然后開啟風(fēng)機(jī)。,（3）接種用工具（解剖刀、剪刀、鑷子）可放入70-75%酒精中，使用時(shí)需火焰灼燒滅菌，冷卻后使用。 （4）外植體放入超凈工作臺內(nèi)，置70-75%酒精中5-60 秒，0.1氯化汞6-10分鐘，或10%的漂白粉上清液中10-15分鐘，然后用無菌水沖洗3-5次。滅菌時(shí)需進(jìn)行攪動。,常用滅菌藥劑的使用和效果,（1）材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈睢Ｈ缛~片切成0.

6、5cm見方的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要剝成只含l2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。 （2）解開包口紙，將培養(yǎng)瓶口幾乎水平拿著，避免灰塵落入瓶中。使瓶囗靠近酒精燈火焰，并將瓶口在火焰上方轉(zhuǎn)動，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。,3、外植體的接種,（3）迅速用鑷子夾取切割分離下的所需組織、細(xì)胞、器官，送入培養(yǎng)容器內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放13塊為宜。接完種后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘。然后及時(shí)蓋上瓶蓋或封口。,注意： 所有操作均應(yīng)嚴(yán)格保持瓶口在操作區(qū)以內(nèi)，且不遠(yuǎn)離酒精燈；工具用后應(yīng)及時(shí)滅菌，避免交叉污染；工作人員操作時(shí)禁止不必要的談話。,

7、三、培養(yǎng),指把離體植物材料放在培養(yǎng)室(有光照、溫度條件)里，使之生長，分裂和分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程。,1、培養(yǎng)含義,2、培養(yǎng)方法,(1)固體培養(yǎng)法 即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在最常用的方法。 (2)液體培養(yǎng)法 即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。,培養(yǎng)步驟,初代培養(yǎng),繼代培養(yǎng),生根培養(yǎng),3、培養(yǎng)步驟,（1）初代培養(yǎng),目的：獲得無菌材料和無性繁殖系。無性繁殖系：是指由一個(gè)外植體繼代增殖，繁殖出的具有相同遺傳物質(zhì)的植株群體。包括：芽叢、不定芽、胚狀體、原球莖等。,培養(yǎng)基：誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基中CTK多，IAA少。,類型（根據(jù)發(fā)育方向）： 叢生

8、芽增殖型器官發(fā)生型 胚狀體發(fā)生型 原球莖發(fā)生型,根、芽,胚狀體,根、芽,愈傷組織,芽,根,芽,外植體,試管苗,原球莖,根、芽,外植體成苗途徑,根,頂芽,腋芽,叢生芽增殖型,微型扦插,頂芽,CTK刺激,帶芽的莖切段,側(cè)芽,接種培養(yǎng),形成的莖梢節(jié)長，直立向上呈小灌木叢狀,獲得較多嫩莖梢,莖段培養(yǎng)繼代擴(kuò)繁,試管苗,生根培養(yǎng),無愈傷組織產(chǎn)生,初代,繼代,叢生芽增殖型,器官發(fā)生型,脫分化,分化,愈傷組織,芽、芽叢,切割芽叢 繼代培養(yǎng),大量芽叢,試管苗,生根培養(yǎng),外植體,初代,繼代,器官發(fā)生型,愈傷組織培養(yǎng),愈傷組織,具分裂能力的細(xì)胞,已分化細(xì)胞,脫分化,繼 代,愈傷組織,分 裂,誘導(dǎo)期,分裂期,分化期,

9、愈傷組織誘導(dǎo), 雙子葉植物單子葉植物和裸子植物, 幼年細(xì)胞和組織成年細(xì)胞和組織, 二倍體細(xì)胞單倍體細(xì)胞, 根據(jù)培養(yǎng)目的選取外植體,愈傷組織誘導(dǎo), 外植體大小一般為0.5cm的圓柱形或方形塊, 添加植調(diào)劑和天然提取物利于誘導(dǎo)和維持, 生長旺盛的愈傷組織一般呈乳黃色或白色或淺綠色或綠色，老化的多為黃色或褐色,脫分化因植物種類、器官及生理狀況有大差異：,禾谷類植物脫分化較難。,細(xì)嫩組織脫分化較易；成熟組織較難。,花器脫分化較易；莖葉難。,誘導(dǎo)期,誘導(dǎo)期長短與植物種類、生理狀態(tài)有關(guān)。,誘導(dǎo)期長短與環(huán)境因素有關(guān)。,母株生長在弱光下的外植體易于誘導(dǎo)，分裂頻率高。,增加O2和迅速釋放CO2利于細(xì)胞分裂。,添

10、加植調(diào)劑誘導(dǎo)分裂效果好。,合成代謝迅速。,分裂期,特征： 細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，顏色淺而透明。,分化期,特征： 形成瘤狀結(jié)構(gòu)的外表和內(nèi)部分化；出現(xiàn)多種類型的細(xì)胞。,石龍芮下胚軸培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體過程,體細(xì)胞胚狀體發(fā)生型,外 植 體,愈傷組織,小孢子,游離單細(xì)胞,器官,胚 狀 體,試 管 苗,體細(xì)胞胚狀體發(fā)生型,胚狀體形成植株的特征：,1.具兩極性,2.胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系,3.胚狀體的維管組織的分布是獨(dú)立的“Y”形,4.數(shù)量多，速度快，結(jié)構(gòu)完整，成苗率高,原球莖：縮短的、呈珠粒狀的、由胚性細(xì)胞組成的、類似嫩莖的器官。,原球莖發(fā)生型,1.初代培養(yǎng)時(shí)外

11、植體發(fā)育途徑有幾條？ 2.正常的愈傷組織一般為何種顏色？其誘導(dǎo)有何特點(diǎn)？,思考題：,目的：擴(kuò)繁無根苗（生產(chǎn)上邊擴(kuò)繁邊生根）。,擴(kuò)繁方法：以幾何級數(shù)增加，可切割莖段，分離芽叢、胚狀體、原球莖。,培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基或分化培養(yǎng)基,實(shí)質(zhì)：增殖培養(yǎng)物。,（2）繼代培養(yǎng),（3）壯苗和生根培養(yǎng),生根培養(yǎng)基：12或14MS基本培養(yǎng)基；不加或少加CTK，適量添加NAA；糖濃度1-1.5%。,培養(yǎng)條件：增加光強(qiáng)，達(dá)3000-10000lx。,壯苗,生根方法與途徑,新梢基部浸入50或100ppmIBA液48h；,在含IAA類培養(yǎng)基中培養(yǎng)46d；,移入含活性碳的生根培養(yǎng)基培養(yǎng)。,其它方法,生根困難的則在培養(yǎng)基中搭濾紙

12、橋或按,生根其它方法,延長在增殖培養(yǎng)時(shí)間,降低增殖倍率，減少CTK用量,對易生根植物，切割粗壯嫩枝在營養(yǎng)缽中直接生根,胚狀體發(fā)育成小苗不經(jīng)生根階段，但需壯苗生根,接種只是完成了離體培養(yǎng)的第一步，植物離體培養(yǎng)和栽培植物一樣，生長過程中也受到各種環(huán)境因素的影響。培養(yǎng)條件是離體培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。在培養(yǎng)基條件適宜的基礎(chǔ)上，影響試管苗生長的主要因素有光照、溫度、濕度、氧氣。,（4）培養(yǎng)條件,光照,1）光強(qiáng) 影響外植體細(xì)胞的增殖、組織和器官的分化。一般培養(yǎng)室的光照強(qiáng)度要求10005000lx。,愈傷組織的誘導(dǎo)有的在光照下有促進(jìn)作用；光照強(qiáng)，幼苗生長健壯；光照弱，幼苗生長弱小，容易徒長。,不同波長的光對細(xì)

13、胞的分裂和器官的 分化有影響。,2）光質(zhì),白光促進(jìn)小花天竺葵愈傷組織 的生長，藍(lán)光則無作用。,如：紅光促進(jìn)楊樹愈傷組織的生長，藍(lán)光阻礙其生長。,3）光照時(shí)間,根據(jù)植物生物學(xué)特性決定； 光照長短對試管內(nèi)花的形成是個(gè)重要影響因素，一般給予周期性光照比較好。多數(shù)植物8-10小時(shí)黑暗為宜。光周期長短因植物種類而異。在胡蘿卜組織培養(yǎng)中隨著日照長度的增加，而促進(jìn)生長。,1）大多數(shù)植物23-32，一般控制在252C。低于15C或高于35C，對生長都是不利的。 2）植株種類及外植體的不同，其最適溫度也是不同的。如百合20；月季2527；番茄28。,溫度,濕度,1）瓶內(nèi)的濕度： 一般為100，主要受到培養(yǎng)基含水

14、量和封口膜透性的影響。如培養(yǎng)基過硬，則不利于外植體接觸和插入培養(yǎng)基，導(dǎo)致生長遲緩；封口膜過于透氣，也會使瓶內(nèi)濕度下降。,濕度過低會使培養(yǎng)基喪失大量水分，滲透勢升高，影響材料對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，也會阻礙外植體的生長。濕度過高會造成雜菌滋長，導(dǎo)致大量污染。一般為7080%。,2）環(huán)境濕度：,1）培養(yǎng)基適宜pH值5-6.5，一般為5.8，調(diào)整用0.1M的NaOH和HCl溶液 。,pH值,2）H影響培養(yǎng)基的硬度。 H 6.5 培養(yǎng)基會變硬； H 5.0 培養(yǎng)基不易凝固。,3）滅菌之前，培養(yǎng)基的pH要比標(biāo)準(zhǔn)提高0.20.3個(gè)單位。,氣體(必要條件),1）培養(yǎng)瓶內(nèi)氧氣的充足與否與封口材料有關(guān)。 可用棉塞或特

15、制的封口塑料。通氣最好的是棉塞，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥，夏季易引起污染。,2）培養(yǎng)基內(nèi)氧氣充足與否與培養(yǎng)基的種類和培養(yǎng)方式有關(guān)。 固體培養(yǎng)基可加進(jìn)活性炭來增加 通氣度,以利于發(fā)根。 液體培養(yǎng)時(shí)，可考慮采取振蕩培 養(yǎng)的方式，以增加通氣性。,2）個(gè)大氣壓以上就對生長有阻礙作用，5個(gè)大氣壓生長就完全停止，個(gè)大氣壓細(xì)胞就不能生存。,滲透壓,1）1-2個(gè)大氣壓促進(jìn)生長。,復(fù)習(xí)思考題： 1.繼代培養(yǎng)有何意義？其目的和實(shí)質(zhì)是什么? 2.組培苗生根方法有哪些？ 3.外植體成苗途徑有幾條？,四、馴化移栽,高溫且恒溫 高濕 弱光 無菌,1、試管苗生態(tài)環(huán)境與自然環(huán)境的差異,2、試管苗的特點(diǎn),生長細(xì)弱，角質(zhì)層不發(fā)達(dá) 光

16、合作用差 葉片氣孔數(shù)少，活性差 根吸收功能弱 對逆境的適應(yīng)性和抵抗能力較差,3、試管苗的馴化,目的：提高試管苗的適應(yīng)性，促其健壯，最終提高移栽成活率 原則： 從溫、光、濕度及有無雜菌等環(huán)境因素考慮。 馴化開始數(shù)天內(nèi)，與培養(yǎng)環(huán)境條件相似；后期與預(yù)計(jì)栽培條件相似，逐步適應(yīng)。 方法：即煉苗。不開口自然光下2-3天，然后開口1-2天。,試管苗的移栽方法,組培馴化移栽常用基質(zhì),組培馴化移栽用穴盤,試管苗的移栽方法,試管苗的移栽,移栽方法：取出試管苗，全部輕洗去培養(yǎng)基栽入基質(zhì)(事先澆透水)后，栽后輕澆薄水， 移入高濕環(huán)境(90%以上)。 移栽場所：日光溫室塑料大棚馴化室 注意： 1.保持小苗水分供需平衡

17、2.防止菌類滋生 3.給予一定溫光條件 4.注意基質(zhì)配比并保持適當(dāng)?shù)耐庑?1）保持小苗水分供需平衡,1周內(nèi)： 環(huán)境高濕，遮光。,1周后：,小苗生長后逐漸降濕，拱棚兩端通風(fēng)。,半個(gè)月后：,揭膜，控水，增加光強(qiáng)。,2）防止菌類滋生,基質(zhì)高壓滅菌或3h烘烤滅菌或太陽能滅菌。 適當(dāng)使用殺菌劑、消毒劑。 移栽時(shí)少傷苗。 噴水加0.1%尿素或1/2MS大量元素液追肥，加快苗生長。,3）給予一定溫光條件,適宜生根溫度：1820，溫度低可加地?zé)峋€。 移栽初期弱光，后逐漸加強(qiáng)光照，過渡到自然光照。,保持基質(zhì)通氣性： 選顆粒狀基質(zhì)，澆水勿多。,4）注意基質(zhì)配比并保持適當(dāng)?shù)耐庑?基質(zhì)配比： 珍：蛭：草( 腐殖土

18、)=1：1：0.5 珍：草(腐殖土)=1：1,提高試管苗移栽成活率的途徑？ 1、壯苗移栽比弱苗移栽成活率高 2、生長素（NAA）利于生根 3、低無機(jī)鹽濃度生根效果好 4、活性炭利于嫩莖生根 5、避免太陽直射，溫度25-30，濕度在85%以上 6、使試管苗逐漸從無菌向有菌過渡,組織培養(yǎng)工廠化育苗生產(chǎn)流程簡圖,五、組培快繁計(jì)劃安排與實(shí)施,商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的確定應(yīng)以市場需求為標(biāo)準(zhǔn)，否則試管苗難以銷售，造成經(jīng)濟(jì)損失。 外植體的入瓶；器官形成及增殖；試管小植株出瓶等試管苗生產(chǎn)過程均是在無菌條件下進(jìn)行的，因此，試管苗生產(chǎn)規(guī)?？梢杂脽o菌工作臺的數(shù)量來衡量的。,1.試管苗生產(chǎn)規(guī)模的確定,一般一個(gè)單人無菌工作臺可

19、年生產(chǎn)10萬15萬株苗，一個(gè)1.2m0.6m2.0m的6層培養(yǎng)架可年繁殖1.5萬2萬株試管苗。年產(chǎn)100萬株的組培苗生產(chǎn)工廠，需810個(gè)無菌工作臺，培養(yǎng)架4050個(gè)。接種室面積應(yīng)為4050m2，培養(yǎng)室面積則為100120m2。 培養(yǎng)容器的數(shù)量取決于生產(chǎn)規(guī)模，一個(gè)6層培養(yǎng)架(1.2mX0.6mX2.0m)可放置900個(gè)左右三角瓶或360個(gè)左右蘭花瓶，還需增加1015的周轉(zhuǎn)用培養(yǎng)容器。,馴化室可內(nèi)裝噴灌設(shè)施和可移動苗床。每平方米苗床可栽種800株試管苗，一茬苗的過渡周期為30d，年產(chǎn)100萬株苗的過渡培養(yǎng)室，建造面積應(yīng)為400600m2。,2.試管苗增殖率的估算,Y=xn,年增殖率,全年增殖周期數(shù)n=365/每周期天數(shù),每周期增殖倍數(shù),例如：增殖周期為1個(gè)月，增殖倍數(shù)為3， 則