電泳和電色譜.ppt

1、1,9 電泳和電色譜Electrophoresis and electrophoretic chromatograph,2,電泳概念,Arne Tiselius物理化學(xué)家、諾貝爾獎(jiǎng)金獲得者 定義荷電的膠體粒子在電場(chǎng)中的移動(dòng)； 電泳決定于環(huán)繞每個(gè)離子的離子霧中的擴(kuò)散雙電層，離子尺寸越大、溶液中的離子強(qiáng)度越高時(shí)，電泳現(xiàn)象變得越明顯。 因此，電泳現(xiàn)象中的表面電勢(shì)和雙電層的因素起著決定性的作用。,3,電泳概念,電泳與色譜原理結(jié)合可以派生多種復(fù)合分離方法，如電泳色譜和電色譜。 電泳色譜：將溶質(zhì)的電動(dòng)遷移和色譜分離作用相結(jié)合 電色譜：利用 電滲作用 驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相流動(dòng)，分離作用主要源于 溶質(zhì)在色譜固定相和流動(dòng)

2、相間的分配平衡特性 多數(shù)情況下二者無嚴(yán)格區(qū)分，均稱為電色譜,4,9.1 基礎(chǔ)理論,電泳的簡(jiǎn)單原理 蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質(zhì)的H+濃度或與其它大分子的相互作用。 帶電粒子在電場(chǎng)中的遷移方式主要依據(jù)分子尺寸大小和形狀、分子所帶電荷或分子的生物學(xué)與化學(xué)特性。,5,albumin白蛋白 Globulin球蛋白 Serum血清,6,9.1.1 電泳速度,9.1.1.1 自由溶液中的電泳速度 Stokes Law（斯托克斯定律）,7,Stokes Law（斯托克斯定律）,如果把生物大分子的膠體溶液放在一個(gè)沒有干擾的電場(chǎng)中，使顆粒具有恒定遷移速率的驅(qū)動(dòng)力來自于顆粒上的

3、 有效電荷Z 和 電位梯度E，它們與介質(zhì)的摩擦阻力f相抗衡，這種抗衡服從斯托克斯定律： f = E Z e f= 6v r v是介質(zhì)粘度為中半徑為r的顆粒的移動(dòng)速度。 但實(shí)際情況中， f還取決于凝膠厚度、顆粒尺寸、甚至是介質(zhì)的內(nèi)滲等。,8,9.1.1 電泳速度,當(dāng)電場(chǎng)力和黏性阻力達(dá)到平衡時(shí)，即f =f 時(shí)，荷電溶質(zhì)恒速泳動(dòng) U0為電解質(zhì)溶質(zhì)的遷移率，是單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度（淌度）,9,雙電層厚度 帶電粒子遷移率,10,電泳遷移率,電泳遷移率（mobility）: 在電位梯度E的影響下，帶電顆粒在時(shí)間t中的遷移距離d。 其單位是cm2sec-1 V-1 電泳遷移率的不同提供了從混合物中分離不

4、同物質(zhì)的基礎(chǔ),11,9.1.1.2 凝膠中的電泳速度,聚丙烯酰胺凝膠的濃度,Tg 單位質(zhì)量分?jǐn)?shù) Cg 交聯(lián)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù) a丙烯酰胺單體質(zhì)量 b交聯(lián)劑單體質(zhì)量 m緩沖液質(zhì)量,Tg與u有關(guān),12,凝膠電泳遷移率 u p365 Ferguson線圖 當(dāng)Cg一定時(shí)，凝膠電泳遷移率lg u與Tg呈線性關(guān)系。,13,電泳的大致分類,依據(jù)電泳原理，現(xiàn)有三種形式的電泳分離系統(tǒng) 移動(dòng)界面電泳（moving boundary electrophoresis） 區(qū)帶電泳（zone electrophoresis ） 穩(wěn)態(tài)電泳（steady state electrophoresis ） 其中區(qū)帶電泳是目前常用的電泳系

5、統(tǒng)。,14,區(qū)帶電泳 表示在一個(gè)電場(chǎng)的作用下，在某一種支持介質(zhì)上（或均一的緩沖液中），能將混合物分離成若干區(qū)帶的電泳過程。 移界電泳（界面電泳）： 對(duì)物質(zhì)只起到部分分離的作用，混合物以同一界面移動(dòng)，只有最前面的成分有部分提純的，其它則相互重疊。,15,等速電泳：在電泳達(dá)到平衡后，各區(qū)帶相隨，分成清晰的界面，以等速移動(dòng)。它的區(qū)帶沒有重疊。 等電聚焦：利用各種具有不同等電點(diǎn)的載體兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)中自動(dòng)形成pH梯度，使被分離物各自移動(dòng)到其等電點(diǎn)處而聚成很窄的區(qū)帶。,16,區(qū)帶電泳的主要技術(shù),區(qū)帶電泳中的常用技術(shù) 載體電泳：粉末電泳、紙電泳、凝膠電泳、聚焦電泳 無載體電泳：自由電泳、毛細(xì)管電泳,17,

6、凝膠電泳的支持介質(zhì)： 聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel, PAG） 由丙烯酰胺和交聯(lián)劑 N，N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和增速劑的作用下，聚合而成； 瓊脂糖凝膠： 從瓊脂中精制分離出的膠狀多糖，其分子結(jié)構(gòu)大部分是由1,3連接的-D吡喃半乳糖和1,4連接的3,6脫水-D吡喃半乳糖交替形成的；,9.2 凝膠電泳,18,丙烯酰胺的聚合,丙烯酰胺的聚合通常是由化學(xué)或光化學(xué)過程完成的，通常采用過硫酸銨、過硫酸鉀或核黃素（引發(fā)劑）來引發(fā)該過程；以N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）為增速劑。 該引發(fā)-增速的催化系統(tǒng)實(shí)質(zhì)是自由基催化的氧化-還原過程。 丙烯酰胺的化學(xué)聚合是由 過硫酸銨

7、 在堿性條件下，產(chǎn)生游離 氧自由基 引發(fā)單體丙烯酰胺成為自由基狀態(tài)，經(jīng)過一系列的自由基反應(yīng)得到的聚合物；,19,影響聚合的主要因素,引發(fā)劑和增速劑的濃度： 濃度小易導(dǎo)致聚合速度慢； 濃度過大則易導(dǎo)致電泳時(shí)的燒膠以及電泳帶的畸變；一般控制使聚合過程在4060分鐘內(nèi)完成。 系統(tǒng)pH值： 酸性條件、堿性條件均可，但仍然存在一個(gè)最佳pH值，以獲得最佳的聚合結(jié)果；,20,影響聚合的主要因素,溫度：低溫下聚合導(dǎo)致凝膠變脆和混濁；適當(dāng)提高溫度可以是凝膠透明而有彈性； 分子氧：分子氧的存在會(huì)阻礙凝膠的化學(xué)聚合；抽氣 系統(tǒng)純度：金屬離子會(huì)影響凝膠的聚合；,21,聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分子篩效應(yīng),在使用凝膠介質(zhì)的

8、電泳中，由于電泳介質(zhì)具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不僅可以防止對(duì)流，而且可以把擴(kuò)散減到最小。 凝膠中的大分子分離取決于它的電荷、尺寸和形狀 凝膠的這種用于分離不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸篩分能力（Size sieving capacity），這種現(xiàn)象被稱為分子篩效應(yīng)（molecular sieving effect）,22,分子篩效應(yīng),圖中A，B，C均為陽離子，在直流電場(chǎng)作用下電泳情況示意圖 分子量大小依次為MA=MBMC，所帶電荷量相同QA=QB=QC。,23,瓊脂糖凝膠孔徑較大，0.075%瓊脂糖的孔徑為800nm，可以分析百萬道爾頓分子量的大分子，但分辨率較PAGE低。,24,電泳系

9、統(tǒng)的基本組成,電泳槽：是凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，管式電泳槽、垂直板電泳槽、水平板電泳槽 電源:聚丙烯酰胺凝膠電泳200600V，載體兩性電解質(zhì)等電聚焦電泳10002000V，固相梯度等電聚焦30008000V 外循環(huán)恒溫系統(tǒng):高電壓會(huì)產(chǎn)生高熱，需冷卻； 凝膠干燥器:用于電泳和染色后的干燥； 灌膠模具：制膠，玻璃板和梳子；,25,電泳轉(zhuǎn)移裝置：利用低電壓，大電流的直流電場(chǎng)，使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點(diǎn)轉(zhuǎn)移到特定的膜上，如PVDF膜 電泳洗脫儀：回收樣品 凝膠掃描和攝錄裝置：對(duì)電泳區(qū)帶進(jìn)行掃描，從而給出定量的結(jié)果。,26,垂直電泳槽及灌膠模具,27,電泳的一般過程,28,29,SDS-聚丙烯酰胺

10、凝膠電泳（SDS-PAGE）,使用含有十二烷基硫酸鈉（ SDS）和還原劑（通常為巰基乙醇）的樣品處理液對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行處理（一般煮沸35分鐘），通過加熱和SDS可以使蛋白質(zhì)變性，多亞基的蛋白質(zhì)也將解離為單亞基。同時(shí)還原劑可以切斷蛋白質(zhì)中的二硫鍵（使二硫鍵還原）。,30,經(jīng)過這樣處理的樣品中的肽鏈都是處于無二硫鍵連接的，分離的狀態(tài)。 由于SDS是帶有負(fù)電荷的分子，同時(shí)它有一個(gè)長(zhǎng)的疏水尾巴，SDS通過疏水尾巴與肽鏈中的氨基酸的疏水側(cè)鏈結(jié)合，結(jié)合SDS的比率大約是一個(gè)蛋白質(zhì)分子中每?jī)蓚€(gè)氨基酸殘基結(jié)合一分子的SDS。,31,垂直板電泳裝置,32,電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電

11、泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個(gè)帶孔膠粒。,混合樣品,帶孔膠,按分子大小分離,電泳方向,電泳,小分子,大分子,33,電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后的凝膠照片,34,夾在兩塊玻璃板之間的凝膠,電泳緩沖液,電泳緩沖液,加在槽中的經(jīng)SDS處理的樣品,分子量小,分子量大,電源,35,標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量,未知蛋白,在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對(duì)數(shù)與多肽鏈的相對(duì)遷移率成線性關(guān)系，所以可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽鏈分子量。,相對(duì)遷移率,36,電泳緩沖液,凝膠,水平式電泳裝置,37,常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳,原理： 由于聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是多孔介質(zhì)，不僅能防止對(duì)流，把擴(kuò)散減少到最低；而且其孔徑大小

12、與生物大分子具有相似的數(shù)量級(jí)，能主動(dòng)參與生物分子的分離，具有分子篩效應(yīng)。 因此，在使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離時(shí)，在電泳過程中不僅取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，還取決于蛋白質(zhì)的尺寸和形狀。 PAGE可以用圓盤電泳、垂直電泳或水平電泳,38,電泳前的準(zhǔn)備工作,緩沖系統(tǒng)的選擇： 作用：保證蛋白質(zhì)的溶解性能、穩(wěn)定性以及生物活性的保持； 電泳時(shí)間和分辨率：從理論上講PAGE可以在任何pH進(jìn)行，但實(shí)際上過酸或過堿的條件下將發(fā)生某種水解（脫酰胺）。因此，pH應(yīng)限制在310之間。,39,緩沖系統(tǒng)的選擇原則,是兩種標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)立權(quán)衡 如果緩沖液的pH選擇在 遠(yuǎn)離 樣品中各種蛋白的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子所帶 電荷的密

13、度大 ，電泳時(shí)間短，區(qū)帶細(xì)而窄； 如果緩沖pH選擇在 靠近 被分離樣品的一種或幾種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，則蛋白質(zhì)分子之間的電荷密度差別大，分辨率就高； 因此，常常選擇pH 8.09.5的緩沖，常用的緩沖液有Tris-甘氨酸（pH 8.39.5），Tris-硼酸(pH 8.39.3)和Tris-醋酸（pH 7.28.5）,40,離子強(qiáng)度的選擇,離子強(qiáng)度不宜過高，此時(shí)電導(dǎo)率低，產(chǎn)熱少，電泳速度快； 但也不可過低，必須具有一定的緩沖能力，過低的離子強(qiáng)度容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)絮凝。 一般選擇緩沖液的離子強(qiáng)度為0.010.1 mol/L之間,41,凝膠濃度的選擇,由于PAGE電泳分離不僅取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，而且取

14、決于分子的大小、形狀。因此，與凝膠的分子篩效應(yīng)（即凝膠的孔徑與電泳的分辨率、電泳速度）密切相關(guān)。 根據(jù)凝膠孔徑與被分離分子的大小和形狀，可以將凝膠分為： 非排阻性凝膠（unrestrictive gel）: 濃度0.7 1.0%的瓊脂糖凝膠； 排阻性凝膠（restrictive gel）：濃度大于1%的瓊脂糖凝膠和常規(guī)PAGE,42,凝膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時(shí)蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠，樣品仍留在加樣位置； 凝膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質(zhì)分子均隨緩沖液推進(jìn)，不能得到很好的分離；,43,PAGE的具體操作過程,制膠：確定凝膠配方（凝膠、引發(fā)劑、增速劑的濃度和緩沖液），使用灌

15、膠模具灌膠； 樣品準(zhǔn)備：選擇合適的樣品緩沖液、確定合適的樣品濃度（12mg/L，考染），加樣（溴酚藍(lán)）； 電泳：46小時(shí)，待溴酚藍(lán)前沿到達(dá)陽極底部； 檢測(cè)：紫外掃描或染色（考馬斯亮藍(lán)R-250、銀染色靈敏度比考染高100倍、熒光探針）； 照相、凝膠干燥： 定量測(cè)定：,44,SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳,十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE 主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)亞基分子量以及未知蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定； 特點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、測(cè)定快速、重復(fù)性高、樣品無需純化。,45,SDS-PAGE 的原理,蛋白質(zhì)分子的解聚 SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵

16、，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)； 而強(qiáng)還原劑，如二硫蘇糖醇、-巰基乙醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。,46,因此，在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，蛋白質(zhì)分子被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈與SDS結(jié)合后，形成帶負(fù)電的蛋白質(zhì)-SDS膠束，所帶電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異； 同時(shí)，蛋白質(zhì)-SDS聚合體的形狀也基本相同，這就消除了在電泳過程中分子形狀對(duì)遷移率的影響。,47,蛋白質(zhì)樣品用SDS處理后亞基的解聚和分子形狀的改變,48,未知蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定,基于上述SDS-PAGE的原理介紹，我們可以利用SDS-PAGE電泳進(jìn)行未知蛋白

17、質(zhì)的分子量測(cè)定； 以不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳得到不同標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳遷移率，制作標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，然后對(duì)未知蛋白在相同條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳，測(cè)定遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)的分子量；,49,9.2 凝膠電泳,9.2.1 凝膠電泳 以制備為目的的凝膠電泳多采用圓柱形凝膠柱，電泳后將凝膠切成圓片 連續(xù)洗脫法較為方便易行,50,凝膠電泳原理,在凝膠電泳過程中，不同分子量的荷電溶質(zhì)在遷移過程中的泳動(dòng)速度是不同的。 相對(duì)分子量較大的溶質(zhì)受凝膠阻滯作用較大，泳動(dòng)速度慢；相反，分子量小的溶質(zhì)泳動(dòng)速度較快。 經(jīng)過一定時(shí)間的電泳后，根據(jù)溶質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的不同，凝膠中形成數(shù)條含不同溶質(zhì)的區(qū)帶

18、，實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)間的分離。,51,凝膠電泳所使用的凝膠種類和濃度根據(jù)待分離料液中溶質(zhì)的相對(duì)分子量而異。 凝膠電泳的特點(diǎn)是凝膠柱中凝膠濃度和pH值均一。,52,9.2 凝膠電泳,9.2.2 不連續(xù)凝膠電泳 用濃度不同的兩層凝膠組成，上層凝膠濃度較低，孔徑較大，對(duì)溶質(zhì)的泳動(dòng)無阻滯作用，溶質(zhì)在此層得到濃縮； 下層凝膠濃度較大，各組分根據(jù)其在凝膠中的遷移率的差別得到分離。 一般上層稱為濃縮層，下層稱為分離層。上層凝膠中溶質(zhì)以等速電泳的形式泳動(dòng)，得到濃縮。,53,不連續(xù)凝膠電泳形式,不連續(xù)凝膠電泳的凝膠層由濃度不同的兩層凝膠組成。 上層凝膠濃度在2-3% Tg，其凝膠孔徑很大，凝膠對(duì)溶質(zhì)的泳動(dòng)基本上無阻滯作用

19、，表現(xiàn)為等速泳動(dòng)，溶質(zhì)在此層得到濃縮； 下層凝膠濃度在5-25% Tg ，凝膠具有一定的孔徑，各組分根據(jù)荷電量和遷移率的差別得到分離。 因此，上層稱為濃縮層或濃縮膠；下層稱為分離層或分離膠。,54,9.2 凝膠電泳,9.2.2.1 濃縮層內(nèi)的等速電泳 以陰離子型溶質(zhì)為例（溶質(zhì)向陽極移動(dòng)）,55,等速電泳的原理,在上層凝膠層中，以遷移率最大的陰離子為前導(dǎo)離子（一般為強(qiáng)電解質(zhì)離子，Cl-）； 遷移率最小的陰離子為末尾離子（一般為甘氨酸）； 電泳開始前，將含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的料液加入到前導(dǎo)離子和末尾離子之間； 料液區(qū)的pH值高于前導(dǎo)離子區(qū)的pH值；,56,在前導(dǎo)離子區(qū)，前導(dǎo)離子的濃度與反離子的濃度一定時(shí)

20、，由于pH值不變，其泳動(dòng)速度為一定值； 末尾離子根據(jù)其處位置的pH值所產(chǎn)生的解離度和離子遷移率將向陽極（帶負(fù)電荷）或陰極（帶正電荷）移動(dòng)；,57,等速電泳的原理(續(xù)),料液中移動(dòng)速度最快的組分A（pH高）首先進(jìn)入前導(dǎo)離子區(qū)，但由于前導(dǎo)離子區(qū)pH值較低，溶質(zhì)的 解離度減小（所帶負(fù)電荷變少，pH降低），泳動(dòng)速度減慢。 因此，其被排擠出前導(dǎo)離子區(qū)，從而在前導(dǎo)離子區(qū)和混合料液區(qū)交界處組分濃度增加；,58,同時(shí)，為了與反離子保持電中性，該處溶液pH值降低； 在此降低的pH值下，其它組分不能與組分A以相同的速度泳動(dòng)而拖后； 隨著時(shí)間的推移，所有的溶質(zhì)都開始形成獨(dú)自的區(qū)帶，顯示與該區(qū)帶內(nèi)的弱酸離子和反離子濃

21、度相應(yīng)的pH值。,59,等速電泳的特點(diǎn),各個(gè)組分間形成相互連接的獨(dú)自區(qū)帶，顯示各自與對(duì)離子相應(yīng)的pH值； 提高前導(dǎo)離子的濃度可以使溶質(zhì)得到濃縮； 采用適當(dāng)?shù)牡头肿觾尚噪娊赓|(zhì)，在目標(biāo)蛋白質(zhì)前后作間隔物，可使目標(biāo)蛋白與其它蛋白質(zhì)完全分離；,60,等速電泳作為獨(dú)立的電泳法主要用于成分分析，在物質(zhì)回收方面應(yīng)用極少。 主要是由于每個(gè)區(qū)帶互相連接，回收困難。 使用小分子間隔物雖然能解決這個(gè)問題但價(jià)格便宜、并且適合于用作間隔物的電解質(zhì)很難找到。 此外電泳裝置的散熱也是難于解決的工程設(shè)計(jì)問題,61,不連續(xù)凝膠的分離操作,不連續(xù)凝膠層的上部和下部分別使用pH值不同的緩沖液，其中上部緩沖液根據(jù)待分離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)選

22、定。 上層濃縮層采用pH 6.8的緩沖液，下層分離層采用pH 8.3的緩沖液； 上層中，料液中蛋白質(zhì)夾在前導(dǎo)離子和末尾離子之間在濃縮層內(nèi)等速泳動(dòng)，達(dá)到等速電泳狀態(tài)后進(jìn)入下層分離凝膠； 下層中蛋白質(zhì)受到高濃度凝膠的分子篩作用，末尾離子會(huì)超過蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)依據(jù)荷電量和分子大小分離；,62,影響不連續(xù)凝膠分離的因素,緩沖液的pH值、組成 調(diào)節(jié)pH值可以改變荷電量Z； 分離膠的濃度或交聯(lián)度 調(diào)節(jié)凝膠濃度可改變遷移率； 外加電壓：改變 泳動(dòng)速度,63,9.2 凝膠電泳,9.2.2.2 不連續(xù)凝膠電泳的數(shù)學(xué)模型 濃縮層（等速電泳） 擴(kuò)散影響可以忽略不計(jì)，用平推流模型表示等速電泳過程 電場(chǎng)強(qiáng)度 電導(dǎo)率,64

23、,9.2 凝膠電泳,9.2.2.2 不連續(xù)凝膠電泳的數(shù)學(xué)模型 分離層 用軸向擴(kuò)散模型表示分離層內(nèi)的分離過程 初始和邊界條件 分析解,65,9.2 凝膠電泳,9.2.2.3 分離操作及其特性 調(diào)節(jié)pH值可以改變荷電量，調(diào)節(jié)凝膠濃度可以改變遷移率，調(diào)節(jié)電壓可以改變泳動(dòng)速度等 蛋白質(zhì)分離程度的參數(shù) 重疊度,66,等電點(diǎn)聚焦學(xué)習(xí)要點(diǎn),理解：等電點(diǎn)聚焦的原理及特點(diǎn),67,9.3等電聚焦電泳 isoelectric focusing electrophoresis,等電聚焦（isoelectrofocusing）, IEF 利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電點(diǎn)不同，在一個(gè)穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度中進(jìn)

24、行蛋白質(zhì)的分離和分析。 利用等電聚焦技術(shù)分離、分析的對(duì)象僅限于蛋白質(zhì)和兩性分子。 根據(jù)建立pH梯度的原理不同，梯度有分為載體兩性電解質(zhì)梯度（Carrier ampholytes pH gradient）和固相梯度。,68,等電聚焦電泳 利用聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)的緩沖液在電場(chǎng)作用下沿電場(chǎng)方向在凝膠內(nèi)制造一個(gè)pH梯度。 每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的pI 相一致的pH處。,69,等電聚焦電泳進(jìn)行過程中,等電聚焦電泳結(jié)束后,（）,（）,（）,（）,高pH,高pH,低pH,低pH,70,工作原理,蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)最主要的特性是它的帶電行為，它們?cè)诓煌膒H環(huán)境中帶不同數(shù)量的正電或負(fù)電，只是在某一pH時(shí)，

25、蛋白質(zhì)的凈電荷為0，此pH即為該蛋白的等電點(diǎn)（isoelectric point pI）。 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)取決于它的氨基酸組成和構(gòu)象，是一個(gè)物理化學(xué)常數(shù)。 可以利用等電點(diǎn)差異來進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離、分析,71,載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦原理,載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦是在支持介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)，通以直流電后在兩極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性的pH梯度，當(dāng)帶電的蛋白質(zhì)分子進(jìn)入該體系時(shí)，便會(huì)產(chǎn)生移動(dòng)，并聚集于相當(dāng)于其等電點(diǎn)的位置。,72,等電聚焦分離示意圖,73,常規(guī)PAGE和等電聚焦電泳的區(qū)別,74,載體兩性電解質(zhì)和pH梯度的形成,等電聚焦技術(shù)的關(guān)鍵在于pH梯度的建立 作為載體兩性電解質(zhì)應(yīng)

26、該具有以下特點(diǎn)： 應(yīng)該是兩性的，使它們?cè)诜蛛x柱中也能達(dá)到一個(gè)平衡位置； 應(yīng)該可以作為“載體”，兩性電解質(zhì)不能用于等電聚焦，只有載體兩性電解質(zhì)，即具有好的導(dǎo)電性和好的緩沖能力的化合物才能用于等電聚焦。,75,用于等電聚焦的主要載體兩性電解質(zhì),Ampholine(瑞典LKB公司) 由許多脂肪族的 多氨基多羧基 的異構(gòu)體和同系物組成，它們具有連續(xù)改變的氨基與羧基比 Servalyte (德國(guó)Serva 公司) 產(chǎn)品Biolyte Pharmalyte (瑞典Pharmacia 公司) 產(chǎn)品分為九種pH范圍,76,pH梯度的形成,在沒有電場(chǎng)時(shí)，載體兩性電解質(zhì)的pH值大約是該溶液pH范圍的平均值，所有載

27、體兩性電解質(zhì)分子都荷電。 當(dāng)引入電場(chǎng)時(shí)，載體兩性電解質(zhì)分子將向陰極或陽極遷移，帶有最低等電點(diǎn)的分子（荷最多負(fù)電）將最快地向陽極移動(dòng)；當(dāng)它達(dá)到凈電荷為0的位置時(shí)才停止，這個(gè)位置靠近陽極，由于它具有高的緩沖能力，使環(huán)境溶液的pH等于分子本身的pI。,77,其次，一些低pI的載體兩性電解質(zhì)（荷其次多的負(fù)電）也向陽極移動(dòng)，直到它的凈電荷減少到0才停止。同樣的，其周圍環(huán)境溶液pH值也等于它本身的pI。 依次類推，所有的載體兩性電解質(zhì)分子用增加pI級(jí)數(shù)的方法將分別在陽極、陰極之間到達(dá)它們自己的位置，從而給出一個(gè)pH梯度。,78,載體兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)中形成pH梯度的模式圖,79,水平等電聚焦電泳,制膠：溶液

28、配制（丙烯酰胺、N，N-甲叉雙丙烯酰胺、載體兩性電解質(zhì)等），灌膠； 電泳：加樣可在凝膠上的任何位置，濃度一般為0.52mg/ml； 固定： 染色： 脫色：,80,81,二維電泳學(xué)習(xí)要點(diǎn),理解：上述電泳原理和特點(diǎn) 應(yīng)用：了解上述電泳技術(shù)的適用范圍,82,二維電泳定義,二維電泳是同時(shí)利用分子的大小和等電點(diǎn)這兩種特性的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)等生物大分子的電泳分離方法。,83,二維電泳原理,在凝膠電泳槽的y方向上具有濃度分布，而在x方向上首先調(diào)配pH值梯度，使溶質(zhì)分子以等電點(diǎn)聚焦的形式泳動(dòng)到其等電點(diǎn)處。 然后將適當(dāng)pH值的緩沖液滲透到凝膠中，在y方向上加電場(chǎng)使溶質(zhì)再次泳動(dòng)。此時(shí)溶質(zhì)之間的泳動(dòng)速度受荷電量及分子

29、量的影響，直至泳動(dòng)到被高濃度凝膠所阻滯，相互之間得到進(jìn)一步分離。,二維電泳凝膠電泳等電點(diǎn)聚焦,84,二維電泳特點(diǎn),分離度高，可分離等電點(diǎn)相差0.01個(gè)pH值的蛋白質(zhì)； 處理量小，適用于分離微量的高純度目標(biāo)產(chǎn)物，用于科學(xué)研究；,85,86,87,逆向色譜電泳CACE結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和液相色譜的大處理能力，成為一種新型高效的蛋白質(zhì)分離與純化方法,9.5 逆向作用色譜電泳（自學(xué)）,88,在CACE過程中(圖1)， I區(qū)凝膠顆粒內(nèi)孔隙度小，蛋白質(zhì)能滲入的體積小，為排阻區(qū)；11區(qū)凝膠顆粒內(nèi)孔隙度大，蛋白質(zhì)能滲入的體積大，為滲入?yún)^(qū)蛋白質(zhì)隨載液流過分離柱時(shí)， I區(qū)內(nèi)流速大于區(qū)內(nèi)流速調(diào)節(jié)直流電場(chǎng)強(qiáng)度，

30、使目標(biāo)蛋白質(zhì)逆向電泳速度介于兩區(qū)流速之間， 目標(biāo)蛋白質(zhì)就在兩區(qū)交界面處富集交界面處蛋白質(zhì)濃度增加，導(dǎo)致平衡離子濃度增加，電導(dǎo)增加，電場(chǎng)強(qiáng)度下降，電泳速度下降，使目標(biāo)蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)速度為零,結(jié)果加入分離柱內(nèi)的目標(biāo)蛋白質(zhì)富集在交界面，并隨加入量的增加向 區(qū)發(fā)展,9.5 逆向作用色譜電泳,89,9.5 逆向作用色譜電泳,90,CACE利用色譜速度的梯度變化實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)在電場(chǎng)中的聚焦，集色譜柱容量大和電泳 分辨率高的特點(diǎn)與于一體，可用于間歇和連續(xù)分離過程，具有很大應(yīng)用潛力。為實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作和滿足在線檢測(cè)的需要，在分離柱中設(shè)置不含凝膠的富集區(qū)，使目標(biāo)蛋白質(zhì)在此區(qū)域內(nèi)連續(xù)富集,9.5 逆向作用色譜電泳,91,CAC

31、E不僅限于利用不同的凝膠過濾介質(zhì)實(shí)現(xiàn)色譜速度的梯度變化，也可利用其他色譜介質(zhì)（如離子交換、疏水作用等），或可利用其他作用力和方法實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)移動(dòng)速度的梯度變化。例如梯度改變柱的直徑可實(shí)現(xiàn)流動(dòng)相流速即色譜速度的梯度變化；利用密度梯度可實(shí)現(xiàn)沉降速度的梯度變化；利用磁場(chǎng)替代電場(chǎng)看進(jìn)行逆向足以色譜磁泳等。 CACE具有高分辨率、容量大的優(yōu)點(diǎn)，但由于蛋白質(zhì)的電泳遷移率較低，為提高電泳速度，必須在高電壓下操作，產(chǎn)生的熱量高。因此，為便于設(shè)備冷卻，所用柱徑很細(xì)，在一定程度上影響了CACE的分離能力。,9.5 逆向作用色譜電泳,92,9.6.1 分離裝置 毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電色譜均利用毛細(xì)管 為電泳裝置。 毛細(xì)管

32、電泳是基于電泳的差速分離方法； 毛細(xì)管電色譜是電滲流驅(qū)動(dòng)的色譜分離方法，電泳在分離過程中也會(huì)發(fā)揮一定的作用。,9.6 毛細(xì)管電泳和電色譜,93,9.6.1 分離裝置 傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬/m，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)高效毛細(xì)管電泳。,9.6 毛細(xì)管電泳和電色譜,94,毛細(xì)管材料主要有熔融石英、聚乙烯和聚四氟乙烯等。其中以石英毛細(xì)管的傳熱性最佳，應(yīng)用最多。石英毛細(xì)管外壁涂有聚酰亞胺層，以提高毛細(xì)

33、管的彈性，防止脆裂。,9.6 毛細(xì)管電泳和電色譜,毛細(xì)管結(jié)構(gòu),毛細(xì)管是CE分離的心臟。理想的毛細(xì)管必須是電絕緣、紫外/可見光透明且富有彈性的，目前可以使用的有玻璃、熔融石英或聚四氟乙烯塑料等。 毛細(xì)管內(nèi)徑一般為10100m，其截面結(jié)構(gòu)圖標(biāo)意圖如圖17.23所示。,高效毛細(xì)管電泳儀high performance capillary electrophoresis apparatus,儀器,儀器流程與主要部件 process and main assembly,電壓：030kV； 分離柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器； （可檢測(cè)到：10-1910-21 mol/L）,高壓電源,（1

34、）030 kV 穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源； （2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出； （3）電場(chǎng)強(qiáng)度程序控制系統(tǒng)； （4）電壓穩(wěn)定性：0.1%； （5）電源極性易轉(zhuǎn)換；,2. 毛細(xì)管柱 （1）材料：石英：各項(xiàng)性能好；玻璃：光學(xué)、機(jī)械性能差； （2）規(guī)格：內(nèi)徑2075m，外徑350400m；長(zhǎng)度=1m,100,紫外吸收,緩沖液池,化學(xué)惰性，機(jī)械穩(wěn)定性好； 檢測(cè)器 要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測(cè)； 檢測(cè)器、數(shù)據(jù)采集與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理一體化；,類型 檢測(cè)限/mol 特點(diǎn) 紫外-可見 10-1310-15 加二極管陣列，光譜信息 熒光 10-1510-17 靈敏度高，樣品需衍生 激光誘導(dǎo)熒光 10-1810

35、-20 靈敏度極高，樣品需衍生 電導(dǎo) 10-1810-19 離子靈敏，需專用的裝置；,102,9.6.2 分離原理 在電場(chǎng)中，毛細(xì)管內(nèi)的電解質(zhì) 因其荷電性質(zhì)而發(fā)生電泳，同時(shí)在水溶液中，石英毛細(xì)管內(nèi)表面的硅羥基解離而帶負(fù)電荷，誘導(dǎo)管內(nèi)產(chǎn)生電滲流。 電泳過程中，溶質(zhì)的移動(dòng)速度是電滲流和電泳的綜合結(jié)果。,9.6 毛細(xì)管電泳和電色譜,電滲現(xiàn)象與電滲流 electroosmosis and electroosmotic flow,當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。,當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)，這種液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。 電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體叫電滲流（electroosmotic flow ，簡(jiǎn)稱EOF）。,HPCE中的電滲現(xiàn)象與電滲流,石英毛細(xì)管柱，內(nèi)充液pH3時(shí)，表面電離成-SiO-,管內(nèi)壁帶負(fù)電荷，形成雙電層。,在高電場(chǎng)的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰極移動(dòng)，由于這些陽離子實(shí)際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度電滲流。,HPCE中電滲流的大小與方向,電滲流的大小用電滲流速度電滲流表示，取決于電滲淌度和電場(chǎng)強(qiáng)度E。即 電滲流