《生物化學(xué)》教學(xué)課件：基因診斷與基因治療-1-8

1、第二十八章 基因診斷與基因治療Gene Diagnosis and Gene Therapy,基因診斷學(xué)基礎(chǔ) 遺傳病的基因診斷 傳染病的基因診斷 腫瘤的基因診斷 基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 基因治療的概念及策略,主要內(nèi)容,第一節(jié) 基因診斷學(xué)基礎(chǔ)Basis of Gene Diagnostics,一、基因診斷的概念、特點及臨床意義,定義： 利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過檢測基因及基因表達(dá)產(chǎn)物的存在狀態(tài)，對人體疾病作出診斷的方法?；蛟\斷檢測的目標(biāo)分子是DNA、RNA，也可以是蛋白質(zhì)或者多肽。 1976年加州大學(xué)(UCSF)科學(xué)家 Kan YW(簡悅威)用核酸分子雜交技術(shù)首次對一例 地中海貧血進(jìn)行診斷。,

2、診斷依據(jù): 疾病發(fā)生過程中遺傳物質(zhì)的改變。 DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平變化，如病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)從無到有、癌基因表達(dá)水平從低到高； 基因結(jié)構(gòu)變化，如點突變引起基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起基因異常激活或滅活。,2. 基因診斷的特點 高特異性 高靈敏性 早期診斷性 應(yīng)用廣泛性,二、基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù),核酸分子雜交（hybridization） 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP） 限制性片段長度多態(tài)性（RFLP） DNA序列測定（DNA sequencing） 生物芯片（biochips） Western 印跡（Western blot） 免疫組織化學(xué)診斷,（一）核

3、酸分子雜交,按堿基互補原則, 利用標(biāo)記的探針進(jìn)行配對, 形成雜合雙鏈的過程。,核酸分子雜交流程,待測核酸制備,濾膜上核酸固化,雜交,去除未雜交的探針,檢測雜交信號,核酸探針制備,探針標(biāo)記,加入標(biāo)記探針,提取DNA限制性內(nèi)切酶消化DNA以產(chǎn)生特定長度的片段凝膠電泳分離 變性處理DNA轉(zhuǎn)印到膜上并使其牢固結(jié)合將標(biāo)記的探針與膜上DNA片段雜交，分析雜交信號。,1. Southern 印跡雜交,RNA經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，通過分子雜交檢測特定的mRNA分子的含量與大小。,2. Northern印跡雜交,3. 斑點雜交（dot blotting）,將RNA或DNA變性后直接點樣于硝

4、酸纖維素膜或尼龍膜上，用探針檢測, 用于基因組中特定基因及其表達(dá)產(chǎn)物的定性及定量的研究。,4. 反向斑點雜交（reverse dot blotting）,先將探針固定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，將樣品RNA或DNA標(biāo)記變性后進(jìn)行雜交。改變了傳統(tǒng)雜交方法中一次雜交只能檢測一種樣品的局限，大大提高了基因診斷的效率。,寡核苷酸中的堿基錯配會大大影響雜交分子的穩(wěn)定性，可用人工合成的針對正常和突變ASO探針進(jìn)行反向斑點雜交，檢測點突變，大大提高檢測結(jié)果的可靠性。,等位基因特異性寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO）,5. 原位分子雜交,熒光原位雜交 (flu

5、orescence in situ hybridization, FISH） 掛鎖FISH (FISH with padlock),熒光原位雜交（FISH）,6. 固相夾心雜交法(sandwich hybridization),待測靶基因序列上兩個相鄰但不重疊的DNA片段（A、B片段），分別作為捕捉探針（不標(biāo)記的A片段）和檢測探針（標(biāo)記的B片段），同時與靶基因雜交。先將捕捉探針吸附于固相支持物上，與靶基因序列A部分雜交，再加入標(biāo)記的檢測探針，檢測探針與靶基因序列B部分雜交，檢測雜交信號。,固相夾心雜交法示意圖,（二） 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction, PC

6、R）,模板 引物 dNTP Mg2+ Taq DNA聚合酶,變性,延伸,退火,PCR在基因診斷中的應(yīng)用,RT-PCR 熒光定量PCR 多重-PCR PCR-ASO PCR-SSCP PCR-RFLP,1. RT-PCR,2. 熒光定量PCR,3. 多重PCR,多重PCR示意圖 A：普通PCR；B：多重PCR,4. PCR-ASO,N：正?；?；H：雜合子基因；M：突變基因,ASO1,ASO2,N,H,M,（三）單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析,DNA的突變造成DNA片段中堿基序列不同，變性為單鏈后在中性聚丙烯酰胺凝膠中的構(gòu)象不同, 稱為單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformation p

7、olymorphism, SSCP），利用遷移率的差別可使各種序列不同的單鏈分離開來。,PCR-SSCP分析原理示意,正常人,純合突變,雜合突變,+,PCR-SSCP分析,-,（四）限制性片段長度多態(tài)性分析,由于DNA 變異產(chǎn)生新的酶切位點或原有的酶切位點消失，在用限制性核酸內(nèi)切酶消化時產(chǎn)生不同長度或不同數(shù)量的片段，稱限制性片段長度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP） 。 可借助核酸分子雜交或PCR進(jìn)行檢測。,設(shè)計適當(dāng)?shù)臄U增引物，使擴增片段包括某一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別序列，在PCR擴增后用該限制酶切割PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳

8、后酶切片段長度變化，即可作出診斷。,PCR-RFLP,GAATTC,CTTAAG,EcoR 限制性內(nèi)切酶位點的變化,（五） DNA序列測定（DNA sequencing）,32,DNA序列自動分析,ddG,紅,ddT,ddA,綠,ddC,藍(lán),橙,毛細(xì)管電泳,不同熒光素標(biāo)記,DNA合成,測序結(jié)果展示,左側(cè)：正常；右側(cè)突變,序列分析用于基因診斷研究,（六）生物芯片（biochips）,基因芯片（gene chip） 蛋白質(zhì)芯片(protein chip),基因芯片雜交流程示意圖,基因診斷中常用的分子生物學(xué)方法比較,三、 基因診斷技術(shù)路線與方法,直接診斷：直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表達(dá)是否異常。 間

9、接診斷：利用多態(tài)性遺傳標(biāo)志與致病基因進(jìn)行連鎖分析。,根據(jù)對致病基因或相關(guān)基因的了解程度決定基因診斷的技術(shù)途徑選擇。,（一）直接診斷途徑,必要條件： 被檢測基因變化與疾病發(fā)生有直接因果關(guān)系； 被檢基因正常分子結(jié)構(gòu)已被確定； 被檢基因致病的分子機制（突變位點或表達(dá)變化）已知。,5/,5/,3/,3/,RFLP,1. 點突變的檢測 （1）有限制性內(nèi)切酶位點改變,斑點雜交、反向斑點雜交 AS-PCR、PCR-SSCP、 PCR-ASO、 PCR產(chǎn)物直接測序,5/,5/,3/,3/,（2）無限制性酶切位點改變,在DNA序列上有一段較長序列的重新排布。包括數(shù)十個堿基到數(shù)千個堿基的丟失、插入、替換、重復(fù)和倒

10、位等，以及染色體突變或畸變，包括染色體的易位、缺失或染色三體（如唐氏綜合征）等。,2. 基因重排的檢測,采用核酸分子探針雜交與PCR 。,BamH I,BamH I,2,1,2,10 kb,14 kb,-珠蛋白生成障礙性貧血的直接基因診斷,-珠蛋白基因不同程度的缺失可引起 不同類型的-珠蛋白生成障礙性貧血,根據(jù)引物3端的互補與否，設(shè)計一對與正?；蛲蛔兡０迮鋵Φ奶禺愐铮M(jìn)行PCR。,等位基因特異PCR AS-PCR（allele specific PCR）,3. 基因表達(dá)異常的檢測,mRNA的相對定量分析 mRNA的絕對定量分析 mRNA長度分析,（二）間接診斷途徑,1. 采用原因：,致病基因

11、未知或基因結(jié)構(gòu)不確定 致病突變機制不清 致病位點不便檢測,DNA多態(tài)性：指群體中的DNA分子存在至少兩種不同的類型，即個體間同一染色體的相同位置上核苷酸序列存在一定的差異或變異。 多在進(jìn)化中形成，本身并不致病，只是與某些遺傳性致病基因有一定連鎖關(guān)系。,2. 遺傳標(biāo)記,間接診斷：檢測與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)記,三代遺傳標(biāo)記： RFLP（基于核酸分子雜交技術(shù)） VNTR (variable number of tandem repeats) ; STR (short tandem repeats) SNP (single nucleotide polymorphism),7.6kb,13kb,患者,

12、正常,HBS的間接基因診斷 RFLP標(biāo)記的連鎖分析,Hap,7.6kb,13kb,Southern印跡雜交,N H P,N：正常；H：雜合子；P：患者（純合子）；黃色區(qū)域為探針,第二節(jié) 遺傳病的基因診斷Gene Diagnosis of Hereditary Diseases,一、血紅蛋白?。╤emoglobinopathy） （一）鐮刀狀細(xì)胞貧血病 （二）-珠蛋白生成障礙性貧血癥 二、血友病（Hemophilia） 甲型血友病基因診斷 三、脆性X綜合征,（一）鐮狀細(xì)胞貧血病(HBS),一、血紅蛋白病,1. HBS基因診斷ASO雜交法2. HBS的限制性內(nèi)切酶譜分析3. HBS的PCR-RFL

13、P分析,正常的（N）的ASO探針： 5-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 突變的（M）的ASO探針： 5-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3,1. 鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因診斷ASO雜交法,斑點雜交結(jié)果 N：正常；M突變,鐮狀紅細(xì)胞貧血患者ASO雜交法檢測,N-ASO,M-ASO,正常 突變 突變純合子 雜合子 純合子,5,3,正?；?1.15kb,(CCT GAG G),突變基因,1.35kb,(CCT GTG G),鐮狀紅細(xì)胞貧病的限制性內(nèi)切酶譜分析,Mst酶切位點（CCTNAGG）,2. HBS的限制性內(nèi)切酶譜分析,0.2kb,1.15kb

14、,1.35kb,正常人,突變攜帶者,患者,鐮狀紅細(xì)胞貧血病的限制性內(nèi)切酶譜分析,3. HBS的PCR-RFLP分析,正常人的擴增產(chǎn)物經(jīng) Mst 消化可生成54bp和56bp兩個片段，而鐮狀細(xì)胞貧血癥患者的DNA片段不被酶切，仍為110bp，雜合子可見三條帶,正常人,雜合體,患者,Marker,1. PCR-RFLP分析 -珠蛋白17位堿基產(chǎn)生突變(A T),形成新的Mae I位點,M：pBR322 DNA/Msp I; 1: 未酶解片段； 2：bA/ bA；3：bA/ bT； 4：bT/ bT 注：由于54bp、114 bp、72 bp片段及分子量標(biāo)準(zhǔn)中低于200 bp的片段太小，在0.8的瓊

15、脂糖凝膠中不易被觀察到。,（二）-珠蛋白生成障礙性貧血癥,-珠蛋白生成障礙性貧血癥的反向斑點雜交分析 6種突變探針點在膜上，第一排為對照，第二排為檢測結(jié)果。家系分析：雙親突變與子女的可能突變預(yù)測。,2. 反向斑點雜交,將各種ASO 探針點在膜上，分別與每個樣本進(jìn)行雜交，可以 提高檢測效率。,二、血友病（Hemophilia）,甲型血友病是由于血漿凝血因子VIII（F VIII）缺陷造成。 甲型血友病的基因突變類型已有300余種，其中點突變占174種；另有部分患者是由于缺失或插入突變或內(nèi)含子22的基因倒位所致。,1. FVIII基因倒位的DNA印跡分析,將基因組DNA用Nco I，Dra I或B

16、cl I等內(nèi)切酶（酶切位點位于交換點兩側(cè)）消化，用特異探針進(jìn)行雜交分析，正常人表現(xiàn)為21.5 kb、14 kb和16 kb三種類型。I型倒位患者表現(xiàn)為20、17.5和14 kb三種類型；型倒位患者表現(xiàn)為20、16和15.5 kb三種帶型。在一些重型甲型血友病家系中還有其他異常帶型出現(xiàn)。,2. FVIII基因突變的檢測,（1）依賴于FVIII基因內(nèi)或旁側(cè)的多態(tài)性標(biāo)記的連鎖分析； （2）RFLP連鎖分析； （3）VNTR分析； （4）短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）的連鎖分析。,三、脆性X綜合征,脆性 X 智力低下基因1（FMR1）5非翻譯區(qū)遺傳不穩(wěn)定的(CGG)n 三核苷酸重復(fù)序列的異常擴增以及相鄰Cp

17、G 島的異常甲基化； 正常人中約為 850 拷貝； 男性和女性攜帶者增多到52200拷貝，相鄰的CpG 島未被甲基化，稱為前突變（premutation）； 男性患者和脆性部位高表達(dá)的女性中，達(dá)到2001000拷貝，相鄰的CpG島也被甲基化，稱為全突變（full mutation）。 全突變可關(guān)閉相鄰FMR1基因的表達(dá)，F(xiàn)MR1 mRNA在幾乎所有患者不表達(dá)或只有低表達(dá)，從而出現(xiàn)臨床癥狀。,脆性X綜合征常用基因診斷方法,1PCR-ASO 2DNA連鎖分析 3Southern印跡雜交法 4PCR擴增,第三節(jié) 傳染病的基因診斷 Gene Diagnosis of Infectious Diseas

18、es,一、病毒性疾病,甲型肝炎病毒（HAV） HAV系RNA病毒，利用RT-PCR技術(shù)可從糞便中檢測出甲型肝炎病毒的基因組RNA。 乙型肝炎病毒（HBV） 設(shè)計保守區(qū)序列引物，擴增各型HBV DNA片段；設(shè)計位于可變區(qū)的引物擴增某一亞型HBV DNA，以便分型。 丙型肝炎病毒（HCV） HCV為正鏈RNA病毒，先反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行巢式PCR檢測HCV。,二、細(xì)菌引起的疾病,結(jié)核分枝桿菌 先設(shè)計一對特異性引物，用PCR技術(shù)擴增出一383 bp序列，再用探針雜交，靈敏度可達(dá)到100個細(xì)菌水平。 幽門螺桿菌（HP） 主要采用PCR技術(shù)：檢測HP染色體DNA特異片段；檢測HP尿素酶A基因；用PC

19、R-RFLP鑒別HP菌株。,三、寄生蟲及衣原體感染,瘧原蟲 卡氏肺孢子蟲 衣原體感染 診斷方法：核酸雜交和PCR技術(shù),第四節(jié) 腫瘤的基因診斷Gene Diagnosis of Malignant Tumors,原癌基因與抑癌基因的檢測 常見腫瘤的基因診斷 乳腺癌 結(jié)腸癌,主要內(nèi)容,一、原癌基因與抑癌基因的檢測,1原癌基因的檢測 ras基因家族由H-ras、K-ras和N-ras組成。最常見的突變是第12、13、59或第61位密碼子的點突變。 胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌以K-ras突變?yōu)橹?，如?2位密碼子突變，由編碼甘氨酸的GGT突變?yōu)門GT、GTT或GAT，少數(shù)突變?yōu)镚CT。 急性淋巴細(xì)胞白血病，

20、慢性淋巴細(xì)胞白血病等以N-ras突變?yōu)橹?；泌尿系統(tǒng)腫瘤則以H-ras突變?yōu)橹鳌?PCR 及PCR-SSCP分析：擴增ras 基因第12位密碼子點突變部位，再用SSCP技術(shù)進(jìn)行分析，或者直接測序確定患者ras原癌基因的點突變。 核苷酸雜交技術(shù)（如ASO）：檢測ras基因第12位密碼子點突變。,2. 原癌基因突變常用的檢測方法,3抑癌基因p53的檢測,p53基因以密碼子第175位、第248位、第249位、第273位及 第282位點突變率最高。在結(jié)直腸癌、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌，都可見異常的p53基因蛋白。 p53的基因診斷方法有： （1）PCR-SSCP分析技術(shù) （2）DNA序列分析 （3）PCR-R

21、FLP分析,（一）乳腺癌,1乳腺癌常見基因變異 5%10%乳腺癌患者有家族遺傳性。常有抑癌基因的BRCA基因的突變。 BRCA1突變易致乳腺癌。突變分布于整個編碼序列，沒有明顯的突變簇或突變熱點。70%的缺失或插入導(dǎo)致編碼序列的框移和翻譯提前終止。BRCA1在N端的一半部位截短，與乳腺癌和卵巢癌的高風(fēng)險相關(guān)；而在C端截短則主要與乳腺癌高危有關(guān)。 BRCA2基因在30%40%的散發(fā)性乳腺癌有雜合性缺失（LOH）。突變提高乳腺癌易感性。,二、常見腫瘤的基因診斷,（1）PCR法檢測BRCA1基因突變 （2）FISH法檢測BRCA2基因擴增,2乳腺癌基因診斷方法,（二）結(jié)腸癌,1. 結(jié)腸癌常見基因變異

22、 APC是結(jié)腸癌發(fā)生過程中第一個突變基因。K-ras原癌基因突變也是結(jié)腸癌形成的早期事件。 DCC（deletion of colorectal cancer）基因失活是結(jié)腸癌發(fā)展的晚期事件。抑癌基因DPC4和MADR2也可能會因18q等位基因丟失而失活。 p53基因的突變是結(jié)腸癌發(fā)展過程的晚期現(xiàn)象。 DNA修復(fù)基因也與結(jié)腸癌有關(guān)。如hMSH2、hMLH1、hPMS1或hPMS2基因的突變與遺傳性非息肉性結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)。,（1）PCR-SSCP法：對腺瘤樣息肉病人APC基因PCR-SSCP技術(shù)進(jìn)行分析。 （2）異源雙鏈PCR法：檢測APC基因變異。 （3）蛋白質(zhì)免疫印跡法：檢測因基因突變而縮

23、短了的APC蛋白。,2結(jié)腸癌基因診斷方法,第五節(jié) 基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 Gene Diagnosis in Forensic Medicine,重復(fù)序列以各自核心序列（重復(fù)單元）首尾相連多次重復(fù)，稱為串聯(lián)重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)在人群中存在變異，形成多態(tài)性; 串聯(lián)重復(fù)序列散布于染色體上; 重復(fù)單位625 bp長，稱為小衛(wèi)星DNA,重復(fù)單位26 bp長，如（TA）n, (CGG)n 等，稱為微衛(wèi)星DNA。,一、DNA指紋與多態(tài)性遺傳標(biāo)記,可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR) 人類染色體上小衛(wèi)星DNA的高度可變區(qū)（HVR）是由頭尾相連的串聯(lián)重復(fù)序列(tandem repeat，TR）組成，TR的核心序

24、列同源性很高，等位HVR的長度由于TR的重復(fù)次數(shù)不同而有很大的差別，具高度多態(tài)性。,DNA長度多態(tài)性除可用Southern印跡雜交法檢測外，還可以通過PCR擴增后電泳來檢出。,擴增片段長度多態(tài)性 （amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）,1985年，英國遺傳學(xué)家Jeffeys等人用TR的核心序列為探針進(jìn)行RFLP分析時，檢測到許多HVR，并產(chǎn)生相應(yīng)的圖譜，所得圖譜具有高度的個體特異性，達(dá)到了如同人類指紋那樣的高度專一性，所以稱其為DNA指紋圖譜（DNA fingerprint）。,Alec John Jeffreys Oxford, U

25、nited Kingdom,人類DNA指紋圖,二、DNA指紋與法醫(yī)學(xué)診斷,個體識別和親子鑒定：DNA指紋技術(shù)是從基因水平檢測DNA的高度多態(tài)性，個體識別率高。 以往在刑事案件的法醫(yī)學(xué)鑒定中應(yīng)用的是血型、血清蛋白型、紅細(xì)胞酶型和HLA分型，個體分辨能力不夠，只能排除，不能做到統(tǒng)一認(rèn)證。,法醫(yī)案檢中的基因診斷技術(shù),VNTR（可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列/小衛(wèi)星）的核酸分子雜交分析; STR（短串聯(lián)重復(fù)序列/微衛(wèi)星）的PCR分析; SNP的基因芯片檢測。,1單位點探針檢測及PI值的計算,父權(quán)指數(shù)值 （Paternity Index，PI）、父權(quán)相對指數(shù)或親子關(guān)系概率值計算方法基本一致。 PI值表示爭議父作為

26、親父比隨機男人作為親父的可能性大多少倍，PI值大于1表示傾向肯定父子關(guān)系，數(shù)值越大，可能性越大；等于0時表示排除父子關(guān)系。,2DNA指紋圖與親權(quán)鑒定,多位點VNTR系統(tǒng)和DNA指紋圖的電泳分離后片段數(shù)目較多，各等位基因頻率分布的計算復(fù)雜，進(jìn)行親權(quán)鑒定和個體識別時匹配概率的計算影響因素較多，目前尚無一個公認(rèn)的最合理的計算方法。 目前解決親權(quán)糾紛最簡單的辦法是先在孩子DNA指紋圖中找出非母片段并計數(shù)為P，然后分析爭議父DNA指紋圖，看P條非母帶在爭議父中出現(xiàn)多少條。,親權(quán)鑒定與DNA指紋圖 由此圖可推斷出：A和C是親生女兒；B為妻子和其前夫所生；D為養(yǎng)女。,第六節(jié) 基因治療的概念及策略 Conce

27、pt and Strategy of Gene Therapy,基因治療的概念 基因治療的策略 基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 基因干預(yù) 基因治療的應(yīng)用研究 基因治療的前景與問題,內(nèi) 容,基因治療：指將目的基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)（病毒載體介導(dǎo)或者非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)）導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)，與宿主細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生整合、成為宿主基因組的一部分，目的基因表達(dá)產(chǎn)物對疾病起治療作用。,一、概 念,廣義的基因治療： 外源正常基因?qū)氩∽兗?xì)胞，產(chǎn)生正常基因的表 達(dá)產(chǎn)物以補充缺失的或失去正常功能的蛋白質(zhì)； 采用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)抑制細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)的基因； 將特定的基因?qū)敕遣∽兗?xì)胞，在體內(nèi)表達(dá)特定 產(chǎn)物； 向功能異常的細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）中

28、導(dǎo)入該細(xì)胞中 本來不存在的基因（如自殺基因），利用這些基 因的表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。,基因治療分類,體細(xì)胞(somatic cell)基因治療 生殖細(xì)胞(germline)基因治療,只限于某一體細(xì)胞的基因的改變 只限于某個體的當(dāng)代 對缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正 當(dāng)代及子代,（一）基因置換（gene replacement）,定義：指將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通過定位重組，導(dǎo)入的正常基因，以置換基因組內(nèi)原有的缺陷基因。 目的：將缺陷基因的異常序列進(jìn)行橋正。 對缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變。,二、基因治療的策略,定向整合的條件: 轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體與基因組DNA具

29、有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點，進(jìn)行部分基因序列的交換； 基因同源重組技術(shù)又稱為基因打靶； 細(xì)胞內(nèi)基因同源重組的發(fā)生率很低。,基因同源重組技術(shù),（二） 基因添加（gene augmentation）,定義: 通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身 不表達(dá)的基因。,類型: 在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正?；?，而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導(dǎo)入正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補償缺陷基因的功能； 向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。,（三）基因干預(yù)（gene interference） 定義： 采用特定的方式抑制某個基因的表達(dá)，或者通過破壞某個基因

30、的結(jié)構(gòu)而使之不能 表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。,定義：將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。 應(yīng)用：是腫瘤基因治療的主要方法之一。,（四）自殺基因治療(suicide gene therapy),自殺基因的作用機制,TK/GCV 單純皰疹病毒（herps simplex virus, HSV）型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ganciclovir, GCV）轉(zhuǎn)變成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，導(dǎo)

31、致細(xì)胞死亡。,1. 自殺基因系統(tǒng),定義: “自殺基因”導(dǎo)入后，不僅使轉(zhuǎn)導(dǎo)了“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導(dǎo)“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞也被殺死。,2. 旁觀者效應(yīng)（bystander effect）,（五）基因免疫治療,通過將抗癌免疫增強的細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng)。,二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù),基因治療的兩種途徑,載體,目的基因,in vivo,ex vivo,靶細(xì)胞,基因轉(zhuǎn)移(gene transfer)技術(shù),1. 病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 2. 非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移,1. 病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最

32、多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計，有72%的臨床實驗計劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是反轉(zhuǎn)錄病毒載體。,反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)及生活周期,（1）反轉(zhuǎn)錄病毒,兩端各有一長末端重復(fù)序列LTR。,反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點,LTR由U3、R和U5三部分組成。,病毒有三個結(jié)構(gòu)基因,5端LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列（）及剪接供體位點(SD)和剪接受體位點(SA)。,含有負(fù)鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(PBS)和正鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點。,在U3內(nèi)有增強子和啟動子； U3和U5兩端分別有病毒整合序列(IS) ； 在R內(nèi)還有poly(A)加尾信號。,gag基因，編碼核心蛋白和屬特異性抗原； po

33、l基因，編碼反轉(zhuǎn)錄酶； env基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。,反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 由兩部分組成,反轉(zhuǎn)錄病毒載體：其基因組為缺陷型，保留了病毒的包裝信號，而缺失病毒的包裝蛋白基因；它可以克隆并表達(dá)外源治療基因，但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。,輔助細(xì)胞株(如PA317)：由另一種缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒（即帶有全套病毒包裝蛋白基因，但缺失包裝信號的反轉(zhuǎn)錄病毒）感染構(gòu)建而成。能合成包裝蛋白，用于反轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝，但本身卻不能包裝成輔助病毒顆粒。,反轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點,反轉(zhuǎn)錄病毒包膜上env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動物細(xì)胞膜上的特異性受體識別，從而使反轉(zhuǎn)錄

34、病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。,反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。,前病毒通過LTR高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中的永久表達(dá)。,包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體）以出芽的方式分泌至輔助細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。,反轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點,隨機整合，有插入突變、激活癌基因的 潛在危險； 反轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7 kb以下的外源基因。,（2）腺病毒(adenovirus)載體 腺病毒是一種大分子(36 kb)雙鏈無包膜DNA病毒。它通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保

35、持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。 腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。宿主細(xì)胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細(xì)胞，如神經(jīng)元等。,腺病毒的優(yōu)點,基因?qū)胄矢?，對人類安全?宿主范圍廣；,基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無關(guān)；,重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；,腺病毒載體容量較大，可插入7.5 kb外源基因。,腺病毒載體缺點,宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腺病毒載體表達(dá)短暫。,有兩個環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒。,靶向性差。,不能整合到靶細(xì)胞的基因組DNA中。分裂增殖快的細(xì)胞，導(dǎo)入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機會增多，表達(dá)時間相對較短。,（3）腺病毒相關(guān)病毒

36、載體,一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5 kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨立復(fù)制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒等）存在時，才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。,Structure of AAV Virus Genomic DNA,REP：病毒復(fù)制基因, CAP：編碼衣殼蛋白的基因,ITR：反向末端重復(fù)序列,AAV的特點,以潛伏感染為主； 病毒基因組與細(xì)胞共存； 只要宿主細(xì)胞正常，AAV基因表達(dá)被抑制而維持潛伏狀態(tài)； 若細(xì)胞受刺激，表達(dá)應(yīng)激基因，AAV基因表達(dá)從而使AAV病毒復(fù)制； 產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新的細(xì)胞，建立新的潛伏

37、狀態(tài)。,AAV載體是目前正在研究的一類新型安全載體，它對人類無致病性。 AAV可以高效定點整合至人19號染色體的特定區(qū)域19q13.4中，并能較穩(wěn)定地存在。這種靶向定點整合可以避免隨機整合可能帶來的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險性，而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，并可受到周圍基因的調(diào)控，兼具反轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體兩者的優(yōu)點。,AAV載體的缺陷,AAV載體容量小，目前最多只能容納5 kb外源DNA片段； 感染效率比反轉(zhuǎn)錄病毒載體低, 在40% 80%的成人中存在過感染; 可能會引起免疫排斥。,常用基因治療載體, 7.5 kb,載體,（1）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

38、使用方便、成本低廉。 基本原理:利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。,2. 非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖,（2）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù),將DNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實現(xiàn)。多聚陽離子與配體共價連接后，又通過電荷相互作用與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復(fù)合物可被帶有特異性受體的靶細(xì)胞內(nèi)吞，從而將外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞。,受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)示意

39、圖,（3）基因直接注射技術(shù) 不需要進(jìn)行基因工程的繁瑣操作，將裸露DNA直接注入動物肌肉或某些器官組織內(nèi)。動物實驗表明：接受注射外源DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并能維持?jǐn)?shù)月之久。 將促進(jìn)心臟血管生長的基因直接注入實驗鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細(xì)血管增加30%40%； 將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細(xì)胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素； 肌內(nèi)注射凝血因子基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子 。,基因直接注射法的優(yōu)點,制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒DNA重組體的技術(shù)較容易； 排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用； 導(dǎo)入的基因不需整合即可表達(dá)，避免了反轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止

40、或逆轉(zhuǎn)的缺點； 基因直接注射法可反復(fù)使用，而病毒載體則可能誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答，致使反復(fù)治療效果下降。,三、基因干預(yù),反義RNA（antisense RNA） 核酶 (ribozyme) RNA 干擾,1. 反義RNA,受體介導(dǎo)的反義RNA基因治療有其自身的優(yōu)點，而在一定程度上補充了轉(zhuǎn)基因治療的不足。,（l）安全性高,（2）反義RNA設(shè)計和制備方便,（3）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng),（4）能直接作用于一些RNA病毒,2. 核酶 (ribozyme),天然核酶多為單一的RNA分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由兩個RNA分子組成。,在基因治療時，利用核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當(dāng)?shù)牟课唬纬慑N頭狀核酶結(jié)構(gòu)

41、，將靶RNA分子切斷，通過破壞靶RNA分子而達(dá)到治療疾病的目的。,通過siRNA或者miRNA起干涉基因表達(dá)的作用； 體外化學(xué)合成siRNA或者miRNA; 用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地生成siRNA或者miRNA 。,3. RNA 干擾,四、基因治療的應(yīng)用研究,(一)遺傳病的基因治療,1. 在DNA水平明確其發(fā)病原因及機制； 2. 必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳； 3. 該基因的表達(dá)不需要精確調(diào)控； 4. 該基因能在一種便于臨床操作的組織細(xì)胞中表 達(dá)并發(fā)揮其生理作用； 5. 該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴(yán)重后果(如不治療難以存活等)。可供選擇并符合上述4條以上要求的不過只有30余種遺傳病。,必須符合以下要求：,腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)缺乏癥 珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病 血友病和其他血漿蛋白缺乏癥 苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病 萊-納(Lesch-Nyhan)綜合征 家族性高膽固醇血癥 囊性纖維化病,（二）惡性腫瘤基因治療研究,（1）通過基因置換和基因補充，導(dǎo)入多種抑癌基因以抑制癌癥