鋅指蛋白的設(shè)計(jì)與利用.ppt

1、鋅指蛋白的設(shè)計(jì)與利用,生物技術(shù)三班 蔣新培 郵箱:,摘要：人工設(shè)計(jì)的鋅指蛋白一般包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和效應(yīng)結(jié)構(gòu)域。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域主要采用對(duì)DNA序列特異識(shí)別結(jié)合的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域，而功能結(jié)構(gòu)域常常采用某些轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域或某些酶的活性結(jié)構(gòu)域。這樣進(jìn)行設(shè)計(jì)的鋅指蛋白就可以在特定的核酸序列上行使相應(yīng)的功能，這對(duì)于目的基因的表達(dá)調(diào)控及蛋白質(zhì)與核酸的相互作用研究提供了新的思路。,主要內(nèi)容,鋅指結(jié)構(gòu) 鋅指的設(shè)計(jì)篩選 多鋅指之間連接區(qū)的設(shè)計(jì) 人工鋅指蛋白的應(yīng)用 展望,鋅指結(jié)構(gòu),具有重復(fù)結(jié)構(gòu)的氨基酸模式，每個(gè)重復(fù)的“指”狀結(jié)構(gòu)約含23個(gè)氨基酸殘基，鋅以4個(gè)配價(jià)鍵與4個(gè)半胱氨酸

2、、或2個(gè)半胱氨酸和2個(gè)組氨酸相結(jié)合。 相隔特定距離的半胱氨酸結(jié)合鋅指，能與某些RNA/DNA 結(jié)合。,鋅指結(jié)構(gòu),在1989年Lee等揭示鋅指立體結(jié)構(gòu)具有保守型，每個(gè)鋅指均是由1對(duì)反平行的折疊和一個(gè)螺旋組成，每一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)都形成獨(dú)立的包含鋅原子的小結(jié)構(gòu)域,它通過(guò)2個(gè)保守的His和2個(gè)Cys螯合一個(gè)鋅因子,從而使結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。 鋅指結(jié)構(gòu)的共同特征是通過(guò)肽鏈中氨基酸殘基的特征集團(tuán)與Zn2+的結(jié)合來(lái)穩(wěn)定一種很短的，可自我折疊成“手指”形狀的的多肽空間構(gòu)型。,鋅指蛋白,213個(gè)手指，各由23氨基酸組成，并由78個(gè)氨基酸連接；與 DNA大溝結(jié)合并環(huán)繞DNA分子，大溝與特異DNA堿基互作。 鋅指蛋白大多都是

3、與基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)的功能蛋白。,鋅指的設(shè)計(jì)篩選,在鋅指結(jié)構(gòu)中，只有-螺旋中的幾個(gè)氨基酸殘基對(duì)DNA的特異性識(shí)別有作用。因此通過(guò)構(gòu)建鋅指的噬菌體展示庫(kù)，從中可篩選與特定DNA序列有高特異性與高度和力的鋅指。 Rebar和Choo就分別建立了鼠轉(zhuǎn)錄因子Zif268的第二個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)中-螺旋殘基的隨機(jī)肽展示庫(kù)4，5。，用隨機(jī)三聯(lián)體堿基進(jìn)行三輪篩選，得到了與不同三連體堿基對(duì)相應(yīng)結(jié)合的64個(gè)鋅指序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：-螺旋的三個(gè)主要位（-1、+3、+6位）和一個(gè)輔助位+2位與DNA的識(shí)別密切相關(guān)。,Zif268,Zif268是Milbrandt及Lim等分別于1987年克隆發(fā)現(xiàn)的. 其包括一內(nèi)含子序列和兩個(gè)外

4、顯子序列，基因全長(zhǎng)為3.8 kb. Zif268編碼一分子質(zhì)量為61 ku的蛋白質(zhì)Zif268.,鋅指的設(shè)計(jì)篩選,Isalan等又建立起一種非常快速和簡(jiǎn)便的方法稱(chēng)之為兩部分法。以Zif268的三個(gè)鋅指為基本框架，把三個(gè)鋅指拆分成兩部分，建立了兩個(gè)噬菌體展示庫(kù)。從兩個(gè)庫(kù)中篩選出對(duì)HIV-1的-80位到+60位啟動(dòng)子序列特異性特別的7個(gè)三鋅指，并據(jù)此設(shè)計(jì)了7個(gè)三鋅指肽，研究表明，這7個(gè)鋅指肽與對(duì)應(yīng)的DNA序列有很好的親和力與特異性。 該方法充分考慮到第二個(gè)鋅指的-螺旋的第2位氨基酸殘基與第一個(gè)鋅指-螺旋的第6位對(duì)DNA的識(shí)別有協(xié)同作用。,多鋅指之間連接區(qū)的設(shè)計(jì),（1）采用具有柔韌性的連接區(qū)，使鋅指

5、對(duì)所結(jié)合DNA親和力與特異性有所提高 。 （2）把天然轉(zhuǎn)錄因子的二聚化區(qū)域作為連接區(qū)。 總之設(shè)計(jì)多鋅指蛋白時(shí)應(yīng)考慮到鋅指之間的連接區(qū)，這對(duì)于鋅指蛋白對(duì)所結(jié)合DNA特異性與親和力是重要的。,人工鋅指蛋白的應(yīng)用,（1）人工設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄抑制 （2）轉(zhuǎn)錄激活子 （3）人工限制性?xún)?nèi)切酶,人工設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄抑制子,人工設(shè)計(jì)的鋅指蛋白可以通過(guò)以下方式抑制基因的轉(zhuǎn)錄： （1）特異性的鋅指與轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域相連形成的融合蛋白。 （2）設(shè)計(jì)靶向轉(zhuǎn)錄區(qū)域的鋅指蛋白，抑制轉(zhuǎn)錄的延伸；,人工設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄抑制子,（3）設(shè)計(jì)靶向轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的人工鋅指蛋白，阻斷或抑制轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的裝配； （4）靶向目的基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子結(jié)合的區(qū)域設(shè)計(jì)的鋅指蛋白，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。,人工轉(zhuǎn)錄激活子,主要通過(guò)以下兩種方式實(shí)現(xiàn)： （1）鋅指與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域連接形成融合蛋白，通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的裝配激活基因的轉(zhuǎn)錄。 （2）通過(guò)與轉(zhuǎn)錄抑制子對(duì)基因上游結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)，從而激活基因的轉(zhuǎn)錄。,人工限制性?xún)?nèi)切酶,把多個(gè)鋅指與限制性?xún)?nèi)切酶的切割結(jié)構(gòu)域相連，可以設(shè)計(jì)人工限制限制性?xún)?nèi)切酶，研究表明構(gòu)建人工限制性酶用以切開(kāi)特定序列DNA雙鏈?zhǔn)强尚械?。,展望,C2H2型鋅指為DNA序列特異性鋅指蛋白的設(shè)計(jì)提供了一個(gè)很好的框架，通