《DNA的粗提取與鑒定》課件.ppt

1、DNA的粗提取與鑒定,討論2：如何證明他們是遺傳物質(zhì)？,討論3：怎樣才能將細(xì)胞內(nèi)的這些物質(zhì)分離出來？,討論1：構(gòu)成生物體的遺傳物質(zhì)是什么？,1、提取生物大分子的基本思路 選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子,2、生物大分子 主要指蛋白質(zhì)、酶和核酸,3、提取DNA的基本思路 利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分,（一）提取DNA的方法,實(shí)驗(yàn)原理,1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是隨著NaCl的濃度的變化而改變的。當(dāng)NaCl的物質(zhì)的量濃度為0.14 molL時(shí),DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使溶解在NaCl溶

2、液中的DNA析出。 2.DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精溶液。利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA。 3.DNA遇二苯胺（沸水?。?huì)染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。,1、 在沸水浴中， DNA遇二苯胺會(huì)染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑,（二）DNA的鑒定,2、甲基綠 （綠色）,（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取,1、材料：魚卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。（從中選取23種實(shí)驗(yàn)材料）,2、原則：選用DNA含量相對較高、容易提取的生物組織。,雞血,3、合適的材料：,動(dòng)物細(xì)胞的破

3、碎較易，例如，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水 ，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可,（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液,1、動(dòng)物細(xì)胞,答：蒸餾水對于雞血細(xì)胞來說是一種低滲溶液，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，從而釋放出DNA。,討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？,2、植物細(xì)胞 植物細(xì)胞需要先用一定的洗滌劑和食鹽溶解細(xì)胞膜,實(shí)例：提取洋蔥DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液,討論：加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？,答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解,討論：

4、如果研磨不充分，會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？,具體做法。10mL雞血20mL蒸餾水同方向攪拌3層尼龍布過濾濾液,答：研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等,為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì),（三）去除濾液中的雜質(zhì),答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽溶液中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽溶液使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì),方案一、在濾液中加入NaCl，使NaCl溶液濃度為2mol/L，過濾除去不溶的雜質(zhì)，再加入蒸餾水，調(diào)

5、節(jié)NaCl溶液濃度為0.14mol/L，析出DNA，過濾除去溶液中的雜質(zhì)，在用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。,討論：方案二與方案三的原理有什么不同？,答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離,方案二、直接在濾液中加入嫩肉粉，反應(yīng)1015分鐘。 方案三、將濾液放在60750C的恒溫水浴箱中保溫1015分鐘。,為了純化提取的DNA需要將濾液作進(jìn)一步處理,討論：此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？,答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì),具體做法: 方案一：30mL濾液35gNaCl

6、同方向攪拌，DNA溶解加入蒸餾水DNA析出過濾得到過濾物放到2mol/LNaCl溶液中溶解DNA-NaCl溶解液 方案二：30mL濾液嫩肉粉（木瓜蛋白酶）靜置1015分鐘DNA濾液 方案三：30濾液6075處理過濾獲得DNA濾液,（四） DNA的析出與鑒定,DNA的析出用的是與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95 ） ，靜置23min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水。,1、DNA的析出,鑒定DNA時(shí)在試管中先加入物質(zhì)的量的濃度為2mol/L 的NaCl溶液5ml于兩只試管中，其中一只加入DNA絲狀物，各加入二苯胺4m

7、l 試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min,待試管冷卻后，比較兩只試管中溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否有藍(lán)色,2、 DNA的鑒定,1、以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100ml血液中需要加入3g檸檬酸鈉，防止血液凝固。 2、加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟的操作。加入酒精和玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。 3、二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)影響鑒定的效果。,制備雞血細(xì)胞液加檸檬酸鈉，靜置或離心 破碎細(xì)胞，釋放DNA 加蒸餾水，同一方向快速通方向攪拌 過濾，除去細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等。 溶解核內(nèi)DNA 加入NaCl至2mol/L，同一方向緩慢攪拌 DNA析出加