詳細介紹抗體的生產(chǎn)制備

1、2016.12.05,抗體的生產(chǎn)制備,10/1/2020,2,特異性抗體的制備與純化技術,多克隆抗體（抗血清） 單克隆抗體（雜交瘤技術）,單克隆抗體與多克隆抗體,10/1/2020,3,10/1/2020,4,抗體發(fā)展史,抗體制備技術主要經(jīng)歷了三代： 第一代抗體是傳統(tǒng)的抗體制備方法即利用抗原免疫動物后獲得抗體，稱為多克隆抗體（polyclonal antibody）； 第二代抗體是通過雜交瘤技術制備出針對抗原中某一抗原決定簇的抗體稱為單克隆抗體（monoclonal antibody,McAb）； 第三代抗體是利用基因工程技術制備而來，稱為基因工程抗體（genetic engineering

2、antibody）。,第一節(jié) 多克隆抗體的制備與純化,10/1/2020,5,克?。╟lone）:是指無性繁殖細胞系，是由單一個祖先細胞分裂繁殖而形成的一簇細胞純系。在這個家族的所有成員中，如無突變發(fā)生，其基因是完全相同的。 多克隆抗體（polyclonal antibody , pAb）：用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫細胞，可刺激多個B細胞克隆產(chǎn)生針對多個抗原表位的不同抗體。多獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物，即多克隆抗體。 單克隆抗體（monoclonal antibody, mAb）:由一個識別一種抗原表位的B細胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強、效價高、少或無交叉反

3、應性。,10/1/2020,6,多克隆抗體（抗血清）的制備流程,10/1/2020,7,（一）抗原的制備 （二）免疫動物 （三）免疫血清的收集、分離和保存 （四）抗體的純化 （五）免疫血清的鑒定,（六）免疫失敗的可能原因及應采取的措施,10/1/2020,8,（一）抗原的制備,免疫原（immunogen）指能刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細胞；抗原最重要的性質是免疫原性（immunogenicity） 免疫原天然抗原、人工合成抗原； 蛋白質、多糖、脂類、核酸抗原；,免疫原的分類： （一）細胞性抗原制備： 綿羊紅細胞（SRBC）- 溶血素； 細菌- 抗菌抗體（動物免疫血清） （二）可溶

4、性抗原制備： 指蛋白質、多糖和脂類等。,10/1/2020,9,細胞性抗原：主要包括人、動物的細胞，還有細菌、螺旋體及寄生蟲等。 如菌體（O）抗原的制備：選擇標準菌株，接種于斜面或平板培養(yǎng)基表面；置溫箱37 培養(yǎng)24h，用適量的無菌生理鹽水刮下菌苔，移入無菌含有玻璃珠的三角瓶中，充分搖勻菌體；100 水浴22.5h殺菌并破壞鞭毛抗原。取處理過的菌液，檢測有無活菌的存在，合格后用無菌生理鹽水稀釋成每毫升8億10億個細菌，加入苯酚（石炭酸）至最終濃度為5，即為O抗原。,1）細胞性抗原或顆粒性抗原,2）可溶性抗原,10/1/2020,10,可溶性抗原主要包括蛋白質、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、酶、補體、

5、細菌外毒素、核酸等。它們大多數(shù)來源組織細胞，成分復雜。制備這類抗原時，首先需將組織和細胞破碎，然后再從組織和細胞勻漿中提取目的成分，提純后的抗原需鑒定后才能用做免疫原。 （1）組織勻漿的制備：所有的組織必須是新鮮的或低溫保存的。器官或組織獲得后立即去除表面的包膜或結締組織以及大血管，在4 水浴或冰浴中將洗凈的組織剪成小塊，加入適量生理鹽水，裝入搗碎機破碎制成組織勻漿。 （2）細胞破碎：提取細胞可溶性抗原，需將細胞破碎，常用方法有冷熱交替法、超聲破碎法，反復凍融法、自溶法和酶處理法等。,（3）蛋白提純,10/1/2020,11, 超速離心法：常用密度梯度介質有蔗糖、甘油； 選擇性沉淀法（鹽析沉淀

6、法）：其原理是根據(jù)蛋白質理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質抗原成分沉淀，從而達到純化的目的。如選用3350飽和度的硫酸胺收集沉淀物；,10/1/2020,12, 凝膠層析法（分子篩層析）：蛋白質分子按大小被分離； 離子交換層析；帶電的生物大分子和離子交換色譜填料上的離子基團進行交換而被分離純化。以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離； 親和層析：利用生物大分子的生物特異性如抗原抗體、激素受體、IgG和葡糖球菌蛋白A（SPA）； 制備電泳技術。,10/1/2020,13, 其它,聚丙烯酰胺凝膠膠內(nèi)蛋白 可將抗

7、原所在的電泳條帶（或蛋白點）切下,研磨后直接用以動物免疫。 NC膜結合蛋白 將含目的分子的蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉移至NC膜上，麗春紅顯色至清晰顯示目的條帶，取目的條帶置于加有PBS的1.5ml離心管中，用PBS洗至無色，繼而剪碎、研磨，用于動物免疫。,10/1/2020,14,分離純化方法的比較,（4）純化抗原的鑒定,10/1/2020,15,含量測定：采用常規(guī)蛋白或糖類濃度測定法，一般采用分光光度計測量法； 相對分子量的鑒定：一般采用SDS-PAGE電泳法； 純度鑒定：常用區(qū)帶電泳法鑒定。,3）半抗原,10/1/2020,16,半抗原物質多數(shù)為低分子質量的物質，如：多糖、多肽、甾體

8、激素、脂肪胺、類脂質、核酸、某些藥物及其它化學藥品； 常用載體：蛋白質類如：牛血清白蛋白、人血清清蛋白、兔血清清蛋白等。多肽聚合物：如多聚Lys（賴氨酸） 大分子聚合物：如羥甲基纖維素； 半抗原載體連接方法：常用物理法和化學法。 物理吸附的載體有羥甲基纖維素等，其借助電荷和微孔吸附半抗原； 化學法則是利用某些功能基團把半抗原連接到載體上。,10/1/2020,17,某些物質與抗原一起或先于抗原注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應答或改變免疫應答類型，此類物質稱為免疫佐劑(immunoadjuvant)，簡稱佐劑。,四）免疫佐劑,良好的佐劑應當具備以下條件： 增加抗原的表面積，并改變抗原的

9、活性基團構型，從而增強抗原的免疫原性； 佐劑與抗原混合能延長抗原在局部組織的存留時間，降低抗原的分解速度，使抗原緩慢釋放至淋巴系統(tǒng)中，持續(xù)刺激機體產(chǎn)生高滴度的抗體； 佐劑可以直接或間接激活免疫活性細胞并使之增生，從而增強了體液免疫； 具有無毒性或副作用低的特點。,10/1/2020,18,佐劑一般包括以下幾類： 無機佐劑：如氫氧化鋁、明釩等 生物性佐劑：如結核分枝桿菌、卡介苗、小棒狀桿菌、百日咳桿菌、革蘭陰性桿菌內(nèi)毒素、霍亂毒素的B亞單位、胞壁酰二肽和細胞因子等； 人工合成佐劑： 如雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、雙鏈多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）； 油劑：如弗氏完全佐劑、

10、花生油乳劑等； 納米佐劑,1、佐劑的種類,10/1/2020,19,應用最多的是弗氏佐劑和細胞因子佐劑 弗氏佐劑： 不完全佐劑:液體石蠟+羊毛脂 完全佐劑:液體石蠟+羊毛脂+卡介苗 弗氏佐劑：抗原=1：1 乳化成“油包水”乳液 （乳化方法主要有研磨法和注射器混合法）。 完全佐劑一般不連續(xù)2次使用 細胞因子佐劑： IL-2 IL-1 IFNr（羊痘病毒干擾素受體） CSF（集落刺激因子）等,10/1/2020,20,增強抗原免疫原性：使無或微弱免疫原性的物質變成持久或強的免疫原； 增強機體對抗原刺激的反應性：提高初次應答和再次應答所產(chǎn)生的抗體滴度； 改變抗體類型：使產(chǎn)生抗體由IgM型轉變?yōu)镮gG

11、型； 引起或增強遲發(fā)性超敏反應。,2、 佐劑的免疫生物學作用,10/1/2020,21,佐劑的作用機制歸納起來主要有如下幾種： 可增強抗原的表面積和改變抗原活性基團構型，從而增強抗原的免疫原性。 佐劑與抗原混合一起注入機體，可改變抗原的物理性狀，形成抗原儲存庫，延長抗原在局部組織的滯留時間，有利于抗原的緩慢釋放。 增強吞噬細胞的吞噬作用（被佐劑吸附的抗原易被吞噬細胞吞噬），促進對抗原的處理，刺激淋巴細胞增生，從而增強和擴大免疫應答的效應。,3、佐劑的作用機制,二、動物免疫,10/1/2020,22,選擇動物時應考慮以下因素： 抗原來源與動物種屬的關系?？乖膩碓磁c免疫動物種屬差異越遠，其免疫源

12、性越強，免疫效果越好，而同種系或親緣關系越近，免疫效果越差。 動物個體的選擇。適齡、健康、體重符合要求的正常動物（以雄性為佳）；抗體需要量少時，選用家兔、豚鼠和雞等小動物；抗體需要量大時，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大動物。,（一）免疫動物的選擇,10/1/2020,23,選定動物后，在免疫過程中應考慮免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、免疫間隔等因素。 1、免疫原的劑量：免疫原的接種劑量按免疫原性的強弱、動物的個體狀態(tài)和免疫時間來確定。首次免疫時，劑量不宜過大，以免產(chǎn)生免疫麻痹。,（二）免疫方法,免疫途徑通常有皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結等，視不同的免疫方案而異。對于不易獲取的寶貴抗原可采用

13、淋巴結免疫法。 免疫間隔時間是影響抗體產(chǎn)生的重要因素，其中首次與第二次免疫的間隔時間尤為重要，一般以1020天為佳，二次后間隔時間一般為710天，若間隔時間太長，則刺激減弱，抗體效價不高。,2、免疫途徑與免疫間隔時間,10/1/2020,24,（三）免疫血清的收集,1）采血前測抗體效價 在第2次加強免疫后2周，從兔耳緣靜脈取23ml血，制備血清，檢測抗體效價。如未達到預期效價，需再進行加強免疫，直到滿意時為止。當抗體效價達到預期水平時，即可放血制備抗血清。 抗血清的效價：就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用的是放射免疫法，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)

14、生的抗體，可用雙向擴散等方法測定。前者測定的效價極為精確。而后者則粗糙得多。,10/1/2020,25,放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質標記抗原（放射性核素標記）混合，孵育24h后，測定其結合率（用液體閃爍計數(shù)儀測定Ag*Ab或游離Ag*）。通常以結合率為50%的血清稀度為效價。如某抗血清的結合率為50%時的稀釋度為1：15000，則該血清的效價就是1：15000?？寡宓男r，除由抗血清本身的性質決定外，還受標記抗原的質量、孵育時間，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。,10/1/2020,26,雙向擴散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴散，兩者在相交處產(chǎn)

15、生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。瓊脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65左右時，加入疊氮鈉（NaN3），使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50l），周圍各孔內(nèi)分別加入50l 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37下孵育24h，觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度。,2）抗血清的采集,10/1/2020,27,采集：頸動脈放血、心臟采血、靜脈采血

16、分離：室溫自然凝固12h，然后放4冰箱過夜，待血塊收縮后分離血清，有些血清須經(jīng)5630min 使補體滅活。 保存：4保存存放3個月至半年 低溫保存（-70 -20 ）2至3年，忌反復凍融 真空干燥保存4-5年,注意：保存前需經(jīng)除菌 保存液含防腐劑 避免反復凍融（分裝）,10/1/2020,28,（四）、抗體的純化,1、目的：盡量除去抗血清中與目的抗體不相關的成分 2、純化方法 1）單價特異性抗血清的純化 單價特異性是指抗血清只與其特異性抗原發(fā)生反應。 去除雜抗體主要方法：親和層析法（將引起交叉反應的共同抗原交聯(lián)到Sepharose 4B柱上，把要處理的抗血清通過親和層析柱，共同抗體吸附在柱上，

17、洗脫液則含有特異性抗體）； 吸附法（指將非特異性抗原液與戊二醛制備成固相吸附劑按1：10直接加到免疫血清中去除雜抗體）,2）特異性IgG類抗體的純化,10/1/2020,29,硫酸銨鹽析：先用50%飽和度去除白蛋白，再用2次33%飽和度沉淀免疫球蛋白。 離子交換層析：常用的離子交換劑有DEAE纖維素和QAE纖維素。以QAE-Sephadex最理想。能吸附血清中多種蛋白質，但不能吸附IgG. 親和層析法：將純抗原交聯(lián)到Sepharose4B，裝柱后，將抗血清通過親和層析柱，特異性吸附IgG。 凝膠過濾法：分子篩層析,10/1/2020,30,（五）免疫血清的鑒定,1. 效價的測定：顆粒性抗原可采

18、用凝集試驗，可溶性抗原常用雙向免疫擴散試驗、ELISA等方法。,2. 特異性的鑒定：抗體特異性鑒定常用雙向免疫擴散法、免疫電泳法。 3. 純度的鑒定： 抗體純度的鑒定可采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、雙向擴散試驗、免疫電泳等方法。 IgG含有重鏈和輕鏈，純IgG的SDS-PAGE結果應有兩條蛋白電泳帶（分子量約53kD和22kD），若出現(xiàn)多條電泳帶則表明制備的抗體混有雜蛋白，需進一步純化。 4. 親和力的鑒定：測定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、ELISA或RIA（放射免疫技術）競爭結合試驗等。,第二節(jié) 單克隆抗體的制備和應用,10/1/2020,31,第二節(jié) 單克隆抗體的

19、制備和應用,10/1/2020,32,單克隆抗體的優(yōu)點,單特異性和均一性,無限供應,用混合的抗原制備出識別一個抗原決定簇的抗體,10/1/2020,33,雜交細胞（hybrid cell） 在外界某些條件干預下（如PEG、電穿孔），當兩個細胞緊密地接觸的時候,其細胞膜可能發(fā)生融合，產(chǎn)生具有原來兩個細胞染色體/基因的單個細胞，稱為雜交細胞。,10/1/2020,34,雜交瘤細胞（Hybridomas） 若用一種腫瘤細胞與另一種體細胞（如淋巴細胞）融合，所形成的雜交細胞稱為雜交瘤細胞，簡稱雜交瘤。其既具有腫瘤細胞無限增殖的能力，也具有淋巴細胞的一些特性。 B淋巴細胞雜交瘤 骨髓瘤細胞與免疫B細胞融

20、合所產(chǎn)生的雜交瘤細胞。,10/1/2020,35,雜交瘤細胞,單克隆抗體的制備,10/1/2020,36,10/1/2020,37,抗原制備 免疫動物 骨髓瘤細胞及飼養(yǎng)細胞的制備 細胞融合 雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng) 雜交瘤細胞的篩選及克隆化 單克隆抗體的鑒定 單克隆抗體的制備,單克隆抗體制備的主要步驟,一、抗 原,10/1/2020,38,細胞、細菌和病毒等，一般具有較強的免疫原性，可不加佐劑。例如，直接腹腔注射12107個細胞。,顆粒性抗原：,可溶性抗原的來源主要是天然純化，或者用目的基因在原核或真核細胞內(nèi)表達?？扇苄钥乖枧c弗氏完全或不完全佐劑混勻，進行免疫。,可溶性抗原：,10/1/2020

21、,39,B淋巴細胞在目的抗原刺激下增殖、分化，形成能分泌特異性抗體的B淋巴細胞，有利于細胞融合形成分泌特異性抗體的雜交瘤細胞。多次免疫可通過抗體親和力成熟機制，使B細胞分泌高親和力抗體，由此形成的雜交瘤往往可分泌高親和力抗體，有更高的應用價值。,二、免疫動物,免疫目的：,10/1/2020,40,采用與骨髓瘤供體同一品系的動物 免疫動物品系（脾細胞供體）和骨髓瘤細胞在種系發(fā)生上距離越遠則產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定，獲得的雜交瘤不能在該品系小鼠體內(nèi)誘生腹水。,動物的選擇：,動物對抗原刺激易產(chǎn)生免疫應答反應,8 12周齡雌性小鼠（最常用BALB/c）,10/1/2020,41,10/1/2020,42,

22、10/1/2020,43,三、骨髓瘤細胞及飼養(yǎng)細胞的制備,骨髓瘤細胞系的選擇要點：,自身不產(chǎn)生免疫球蛋白的重鏈與輕鏈 所選擇的骨髓瘤細胞應與提供免疫脾細胞的動物 品系相同,對氨基碟呤敏感,與免疫脾細胞融合后產(chǎn)生穩(wěn)定分泌Ig雜交瘤細胞,10/1/2020,44,飼養(yǎng)細胞的作用：,小鼠腹腔巨噬細胞 小鼠脾細胞,飼養(yǎng)細胞（feeder cell）：,增加細胞密度，滿足新生的雜交瘤細胞對細胞密 度的要求 吞噬清除死亡的細胞 分泌生長刺激因子促進雜交瘤細胞的生長,飼養(yǎng)細胞的種類和制備方法：,10/1/2020,45,四、細胞融合,融合前的準備工作,準備HAT、HT培養(yǎng)液、融合劑PEG 準備飼養(yǎng)細胞 準備

23、骨髓瘤細胞 準備免疫脾細胞,10/1/2020,46,拉頸處死小鼠 無菌操作取出脾臟 清洗、研磨 收集細胞 離心洗滌 細胞計數(shù),脾細胞的準備,10/1/2020,47,收集細胞 離心洗滌 活細胞計數(shù) 調(diào)整細胞濃度,骨髓瘤細胞的準備,細胞融合,10/1/2020,48,骨髓瘤細胞與脾細胞 按一定比例混合1: 10或1: 5 加入促融劑PEG,PEG,10/1/2020,49,在聚乙二醇作用下B淋巴細胞可與 骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞,10/1/2020,50,五、雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng),HAT選擇性培養(yǎng)的原理： 細胞的DNA生物合成有主要途徑和補償途徑。當有氨基碟呤存在時，能夠阻斷DNA

24、合成的主要途徑，需通過補償途徑合成DNA，這時就需要次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT）利用次黃嘌呤合成DNA，或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶核苷合成DNA。,10/1/2020,51,10/1/2020,52,用于雜交瘤融合的骨髓細胞缺乏HGPRT和TK，在HAT培養(yǎng)液中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏HGPRT和TK ，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。 未融合的B淋巴細胞雖具有HGPRT和TK ，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。 只有骨髓瘤細胞與免疫B細胞融合的雜交瘤既有骨髓瘤細胞無限增殖的能力，又從免疫B細胞得到HGPRT和TK 的基因產(chǎn)物，因此，能夠克服氨基碟呤的阻斷作

25、用，通過次黃嘌呤的補償途徑合成DNA，而在HAT選擇培養(yǎng)液中生長繁殖。,10/1/2020,53,10/1/2020,54,融合后34天后，可見外形似骨髓瘤細胞，渾圓透亮的克隆。 融合后第79天取培養(yǎng)上清，檢測特異性抗體。,細胞生長情況,六、雜交瘤細胞的篩選及克隆化,10/1/2020,55,雜交瘤分泌單克隆抗體的檢測方法,免疫酶技術間接ELISA 包被抗原、培養(yǎng)上清、酶標抗體、加底物顯色 陰性對照：骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清 陽性對照：免疫鼠血清 免疫熒光技術,間接免疫熒光（或酶）測定法：靶細胞鋪片、 固定細胞、加待測樣品、加熒光標記抗體（或 加酶標抗體和顯色底物）、鏡檢 活細胞免疫熒光技術：流式細

26、胞術分析,10/1/2020,56,雜交瘤細胞的克隆化,在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細胞，只有少數(shù)是分泌預定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。 克隆化即把培養(yǎng)孔中的細胞從單個細胞進行培養(yǎng)繁殖，使之成為單克隆，其分泌的抗體達到均一性。,克隆化的方法主要有：有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法,10/1/2020,57,有限稀釋法,10/1/2020,58,（1）克隆前1天制備飼養(yǎng)細胞層（同細胞融合）。（2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計數(shù)。（3）調(diào)整細胞為310個細胞/ml。（4）取頭天準備的飼養(yǎng)細胞層的細胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細胞100l。孵育于37、5%CO2孵箱中 。（5）在第7天換液，以后每23天換液1次。（6）89天可見 細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。（7）將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養(yǎng)。（8）每個克隆應盡快凍存。,有限稀釋法克隆,10/1/2020,59,軟瓊脂培養(yǎng)法 以適當濃度雜交瘤細胞加入軟瓊脂培養(yǎng)基中，形成由一個細胞增殖而成的細胞集落。,雜交瘤細胞的克隆化篩選：,10/1/2020,60,10/1/2020,61,免疫球蛋白類別及亞類的鑒定,七、單克隆抗體的鑒定,小鼠免疫脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合形成的雜交瘤細胞，其分泌的特異性McAb的本質仍是小鼠的不同類型及其亞類的免疫球蛋白Ig），其中以IgG（Ig