吸收光檢測(cè)原理及應(yīng)用

1、.吸收光檢測(cè)原理及應(yīng)用1. 檢測(cè)原理a) 布格 -朗伯 -比爾定律， 是光吸收的基本定律， 適用于所有的電磁輻射和所有的吸光物質(zhì)，包括氣體、固體、液體、分子、原子和離子。比爾 -朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和光電比色法的定量基礎(chǔ)。b) 朗伯 -比爾定律： OD = ?C 光?b吸收值（ OD）與濃度成正比c) 比爾朗伯定律數(shù)學(xué)表達(dá)式 : A=lg(1/T)=KbcA 為吸光度 ,T 為透射比 ,是透射光強(qiáng)度比上入射光強(qiáng)度K 為摩爾吸收系數(shù).它與吸收物質(zhì)的性質(zhì)及入射光的波長(zhǎng)有關(guān). c 為吸光物質(zhì)的濃度b 為吸收層厚度d)物理意義是當(dāng)一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時(shí),其吸光度A

2、 與吸光物質(zhì)的濃度c 及吸收層厚度b 成正比。2. 吸收光的應(yīng)用a) 生物大分子定量：基于 260nm、 280 吸收光檢測(cè) -核酸定量i.核酸的最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260 nm 。吸收紫外光的性質(zhì)是嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵系統(tǒng)所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它們的物質(zhì)，不論是核苷、 核苷酸或核酸都有吸收紫外光的性質(zhì)。最佳測(cè)量值的范圍為0.1 至 1.0。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50 g / mL的 dsDNA， 37 g / mL 的 ssDNA， 40 g/mL 的 RNA， 30 g/mL 的

3、寡核苷酸。ii.A280nm 是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，比值可進(jìn)行 核酸樣品純度評(píng)估：純 DNA 的 A260/A280 比值為 1.8，純 RNA 為 2.0。假如比值低， 表示受到蛋白 （芳香族）或酚類物質(zhì)的污染，需要純化樣品。iii. A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，比值可進(jìn)行 核酸樣品純度評(píng)估 ：純 DNA 和 RNA 的 A260/A230 比值為 2.5。若比值小于 2.0 表明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染，需要純化樣品。.iv.A320nm 或 A340nm為檢測(cè)溶液樣品的濁度，該值應(yīng)該接近0.0。假如不是，標(biāo)明溶液中有懸浮物，需要純化

4、樣品。v.核酸的吸光值受pH 值和緩沖液離子濃度影響。只有在一定的pH 值和低離子濃度的條件下（如10 mM Tris-HCl pH8.0 ），才能得到精確的檢測(cè)結(jié)果。b) 生物大分子定量：基于 260nm、 280 吸收光檢測(cè) -蛋白定量i. 蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵， 所以蛋白質(zhì)溶液在 275 280nm 具有一個(gè)吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度與其濃度成正比，服從朗伯 -比耳定律，因此可作定量分析。該法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度范圍為0.11.0mg/mL 。ii. 由于不同蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所處的微環(huán)境也不同，所以不同蛋白

5、質(zhì)溶液在 280nm 的光吸收值也不同。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，濃度為1.0 mg/mL 的 1800種蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)亞基在280nm 的吸光度在 0.33.0 之間，平均值為 1.25 0.51。所以此種方法測(cè)量的準(zhǔn)確度差一點(diǎn)。iii.若樣品中含有嘌呤、嘧啶等核酸類吸收紫外光的物質(zhì)，在280nm 處來測(cè)量蛋白質(zhì)含量時(shí)，會(huì)有較大的干擾。核酸在260nm 處的光吸收比280nm 更強(qiáng)，但蛋白質(zhì)卻恰恰相反，因此可利用280nm 及 260nm 的吸收差來計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。iv.常用下列經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：蛋白質(zhì)濃度（ mg/mL ） =1.45A280-0.74A260 ； (A280和A260 分別為蛋白質(zhì)溶液在

6、280nm 和 260nm 處測(cè)得的吸光度值 )v. 還可以通過下述 經(jīng)驗(yàn)公式 直接計(jì)算出溶液中的蛋白質(zhì)的含量：蛋白質(zhì)濃度（ mg/mL ） =F* A280*D*1/d ；其中 A280 為蛋白質(zhì)溶液在 280nm 處測(cè)得的吸光度值； d 為石英比色皿的厚度（ cm） ;D 為溶液的稀釋倍數(shù)； F 為校正因子c) 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) -ELISA疾-病因子，動(dòng)物疫病，食品安全i. 使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。ii. 在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體

7、按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。iii.如今 ELISA 方法已被廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌和病毒等疾病的診斷。在動(dòng)物檢疫方面，ELISA 在豬傳染性胃腸炎、牛副結(jié)核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍(lán)舌病等的診斷中已為廣泛采用的標(biāo)準(zhǔn)方法。.d) 細(xì)菌、細(xì)胞生長(zhǎng)密度及

8、生長(zhǎng)曲線繪制：基于OD600 吸光值i. 單細(xì)胞微生物的發(fā)酵具有四個(gè)階段，即調(diào)整期（延滯期）、對(duì)數(shù)期（生長(zhǎng)旺盛期）、平衡期（穩(wěn)定期）、死亡期（衰亡期）。ii. 生長(zhǎng)曲線可表示細(xì)菌從開始生長(zhǎng)到死亡的全過程的動(dòng)態(tài)。不同的微生物有不同的生長(zhǎng)曲線，同一種微生物在不同的培養(yǎng)條件下，其生長(zhǎng)曲線也不一樣。因此，測(cè)定微生物的生長(zhǎng)曲線對(duì)于了解和掌握微生物的生長(zhǎng)規(guī)律是很有幫助的。iii. 測(cè)定微生物生長(zhǎng)曲線的方法很多，有血球計(jì)數(shù)板法、平板菌落計(jì)數(shù)法、稱重法和比濁法等。本實(shí)驗(yàn) 采用比濁法測(cè)定 ，由于細(xì)菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌懸液的光密度來推知菌液的濃度。將所測(cè)得的光密度值（ OD6

9、00）與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長(zhǎng)曲線。注意，由于光密度表示的是培養(yǎng)液中的總菌數(shù)，包括活菌與死菌，因此所測(cè)定的生長(zhǎng)曲線的衰亡期不明顯。e) 細(xì)胞的毒性及增值： MTT、 XTT、CCK8i.檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臢（Z）（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臢（Z），用酶標(biāo)儀在 490nm 波長(zhǎng)處 (英文說明書寫的是 570nm ）測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT 結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測(cè)得的吸光度值（ OD 值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量，

10、 OD 值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)（如果是測(cè)藥物毒性，則表示藥物毒性越?。i. XTT 作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲臢產(chǎn)物。當(dāng) XTT 與電子偶合劑（例如 PMS）聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其所產(chǎn)生的水溶性的甲臢產(chǎn)物的吸光度與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。優(yōu)點(diǎn)： 1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞； 2、檢測(cè)快速； 3、靈敏度高，甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度； 4、重復(fù)性優(yōu)于 MTT。缺點(diǎn)： XTT 水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。iii.Cell Counting Kit 簡(jiǎn)稱 CCK試劑盒，是一種基于WST-8（化學(xué)名： 2-(2-甲氧基 -4-硝苯基 )-3-(4-硝苯基 )-5-(2,

11、4- 二磺基苯 )-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。WST-8 屬于 MTT 的升級(jí)產(chǎn)品，工作原理為：在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan ）。顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450mM 波長(zhǎng)處測(cè)定 OD 值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。CCK法應(yīng)用非常廣泛，如藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)以及生物因子的活性檢測(cè)等。.f) 報(bào)告基因： -半乳糖苷酶、 GUS等i. 報(bào)告基因 (reporter gene)是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就

12、是說，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，篩選得到轉(zhuǎn)化體。ii.半乳糖苷酶：半乳糖苷酶由大腸桿菌lacZ 基因編碼，可催化半乳糖苷水解。最大優(yōu)勢(shì)是易于用免疫組織化學(xué)法觀測(cè)其原位表達(dá)，是最常用的監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染率的報(bào)道基因之一。以鄰硝基苯 D半乳吡喃糖苷（ONPG）為底物可用標(biāo)準(zhǔn)的比色法檢測(cè)酶活性，其檢測(cè)動(dòng)力學(xué)范圍為6 個(gè)數(shù)量級(jí)。氯酚紅 D半乳吡喃糖苷（CPRG）是另一個(gè)可用比色法檢測(cè)酶活性的底物，其靈敏度比 ONPG 高近 10 倍。以 MUG 和熒光素二半乳糖苷（ FDG）為底物則可用熒光法檢測(cè)其活性。此法可檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的酶活性，并可用于流式細(xì)胞學(xué)（FACS）分析。如以二氧雜環(huán)丁烷為底物，可用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)酶活性，其檢測(cè)動(dòng)力學(xué)范圍最大，靈敏度最高，與用生物發(fā)光法檢測(cè)熒光素酶活性的靈敏度相似。iii.gus 基因存在于 E.coli 等一些細(xì)菌基因組內(nèi)，編碼-葡萄糖苷酸酶。-葡萄糖苷酸酶是一個(gè)水解酶，以 -葡萄糖苷酸酯類物質(zhì)為底物，其反應(yīng)產(chǎn)物可用多種方法檢測(cè)出來。由于絕大多數(shù)植物沒有檢測(cè)到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此這個(gè)基因被廣泛應(yīng)用于基因調(diào)控的研究中。g) 酶活性