毛細管等電聚焦【材料淺析】

1、Capillary Iso-Electric Focusing (CIEF) 毛細管等電聚焦,1,重點資料,等電點，pI 正負電荷相等時對應(yīng)的pH,兩性離子,2,重點資料,細胞色素C10.6 胰蛋白酶原9.2 鯨肌紅蛋白7.6 馬肌紅蛋白6.6 Beta-乳球蛋白 5.2 轉(zhuǎn)鐵蛋白 4.3,3,重點資料,pI7的蛋白質(zhì)在不同pH處的荷電情況,4,重點資料,等電聚焦的原理 具有一定pI的蛋白在電場中建立的pH梯度介質(zhì)中，當(dāng)所處位置的pH低于pI時帶正電荷，向負極移動；在高于pI的pH位置時帶負電，向正極移動；在等于pI處不動。不同等電點組分被聚焦在不同位置而達到聚焦和分離的目的。,5,重點資料,

2、Capillary Iso-Electric Focusing-CIEF,高分辨率（分辨率可達0.005 pH） 快速 微量 在柱檢測,6,重點資料,如何在電場方向上產(chǎn)生pH梯度？ 如何維持建立的pH梯度的穩(wěn)定？,毛細管中pH梯度的建立,7,重點資料,丙烯酸,乙烯氨,聚兩性電解質(zhì),兩性電解質(zhì)的合成,8,重點資料,兩性電解質(zhì)的電荷與pH的關(guān)系,9,重點資料,兩性電解質(zhì)中的蛋白,10,重點資料,CIEF操作過程,11,重點資料,CIEF分辨能力取決于： 擴散系數(shù) 電場強度 pH梯度 淌度的pH梯度,12,重點資料,CIEF 中的譜帶移動,正極移動：在正極加電解質(zhì)如NaCl，使聚焦后分離的譜帶向該極

3、移動 負極移動：在負極，加電解質(zhì)如NaCl，使聚焦后分離的譜帶向該極移動 壓力移動，加電壓的同時施加壓力，實現(xiàn)移動的同時保持聚焦狀態(tài) 掃描檢測分離譜帶，無需譜帶移動,13,重點資料,14,重點資料,陽極移動示意圖，陽極加入中性鹽,15,重點資料,陰極移動示意圖，陰極加入中性鹽,16,重點資料,CIEF中加電加壓轉(zhuǎn)移方法,17,重點資料,CIEF分離蛋白混合物,18,重點資料,CIEF Analysis of anti-CEA MAb,CIEF測定等電點,19,重點資料,CIEF蛋白定量分析,20,重點資料,CIEF分析過程：載入，聚焦，遷移（檢測）,21,重點資料,CIEF試驗要點,內(nèi)壁經(jīng)處理的毛細管 兩性電解質(zhì)（1）和樣品充入毛細管 電極液20 mM 磷酸為陽極液，20 mM NaOH為陰極液 加電壓聚焦，46kV，聚焦穩(wěn)態(tài)后電流下降到起始的1025 聚焦區(qū)帶的轉(zhuǎn)移和檢測,22,重點資料,操作注意事項 濃縮沉淀：由于局部高度濃縮，有可能導(dǎo)致蛋白沉淀阻塞。需要加添加劑，如PVA等對蛋白質(zhì)pI影響小的非離子表面活性劑。 檢測：因為通常所用兩性電解質(zhì)在低U