實(shí)驗(yàn)五：ELISA法檢查乙肝表面抗原(HBsAg)PPT幻燈片

1、實(shí)驗(yàn)五：ELISA法檢測(cè)乙肝表面抗原（HBsAg）,主講人：季煜華 2014年11月,免疫標(biāo)記技術(shù),定義： 將抗原-抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，用放射性同位素、酶或熒光素標(biāo)記的已知抗體或抗原，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物，間接測(cè)定未知的抗原或抗體。 分類： 放射免疫測(cè)定法：131I，32P 免疫熒光技術(shù)：FITC，PE 免疫酶測(cè)定法：HRP，AP,用標(biāo)記物標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)借以提高免疫學(xué)診斷的敏感性,熒光素 ：異硫氰酸熒光素（黃綠色熒光）、藻紅蛋白、 羅丹明（紅色熒光）,放射性同位素： 125I、131I,酶：辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶,免疫熒光檢測(cè)法（IFA）,放射免疫檢測(cè)法（RIA）,酶免疫檢

2、測(cè)法（EIA）,免疫標(biāo)記技術(shù),免疫酶測(cè)定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA),用酶標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。 辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶(AP) 特點(diǎn)： 高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)的特異性 高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，pg水平微量檢測(cè) 定性定量檢測(cè)：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值 分類： 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：可溶性抗原或抗體 酶免疫組化法： 組織中或細(xì)胞表面的抗原。,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,簡(jiǎn)稱E

3、LISA，它是實(shí)驗(yàn)室最常用的檢測(cè)方法，用酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液體（血液、細(xì)胞液）中未知抗體或抗原。ELISA具有準(zhǔn)確性高、檢測(cè)時(shí)間短、價(jià)格低廉、判斷結(jié)果有客觀標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果便于記錄和保存等優(yōu)點(diǎn)，適合于大批標(biāo)本的檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)、醫(yī)療檢測(cè)以及免疫實(shí)驗(yàn)分析等領(lǐng)域。,1.簡(jiǎn)介,(1).抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性。例如：蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與聚苯乙烯表面的疏水基團(tuán)能產(chǎn)生互作用而吸附。 (2).抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性； (3).酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有

4、免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，由此進(jìn)行定性或定量分析。,2、ELISA基本原理,3、ELISA基本的實(shí)驗(yàn)過(guò)程,包被：將已知抗原或抗體通過(guò)物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化； 抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標(biāo)本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定； 酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色。,ELISA的試劑,ELISA中有3個(gè)是必要的試劑：免疫吸附劑、標(biāo)記物和顯色劑。 （1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）； （聚苯乙烯板：具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性

5、） （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）； （3）酶作用的底物（顯色劑）； （4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品； （5）樣品及標(biāo)準(zhǔn)本的稀釋液； （6）洗滌液； （7）酶反應(yīng)終止液,ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體，根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法，主要類型有 雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法等。,4、ELISA類別,雙抗體夾心法,間接法,5、操作步驟（以雙抗體夾心法ELISA為例）：,清洗,清洗,清洗,終止反應(yīng)，底物顯色深淺與待檢抗原量成正比。 利用已知濃度的抗原制成標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋為梯度濃度，對(duì)其最終OD值與濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，那么樣品的

6、濃度可以根據(jù)最終的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 雙抗體夾心法測(cè)定乙肝表面抗原（HBsAg）定性定量檢測(cè),1、掌握ELISA（雙抗體夾心法）的原理 2、熟悉ELISA實(shí)驗(yàn)操作方法，并了解其應(yīng)用,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)材料,HBsAg酶聯(lián)免疫分析試劑盒 HBsAg陽(yáng)性品，陰性對(duì)照品 移液槍，槍頭 濕盒 酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀 一次性手套 記號(hào)筆 計(jì)時(shí)器,實(shí)驗(yàn)步驟,結(jié)果判定,定性測(cè)定 定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出“有”或“無(wú)”的回答，分別用“陽(yáng)性”、“陰性”表示。在這種半定量測(cè)定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性更具定量意義。 待測(cè)孔（P）與對(duì)照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者為陽(yáng)性，N為陰性對(duì)照孔。 定量測(cè)定：酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品抗原的濃度。,預(yù)期結(jié)果,陽(yáng)性：顯色為黃色 陰性：無(wú)色,1 2 3 4,陰性,陰性,陽(yáng)性,陽(yáng)性,ELISA注意事項(xiàng),加樣應(yīng)加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，避免產(chǎn)生氣泡并迅速完成；一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。 洗滌必須徹底，防止產(chǎn)生假陽(yáng)性； 溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4等。37是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原