流式細(xì)胞術(shù)原理及應(yīng)用

1、流式細(xì)胞術(shù)原理及應(yīng)用,一、什么是流式細(xì)胞術(shù)？ 流式細(xì)胞儀的構(gòu)造 二、怎樣設(shè)計(jì)流式實(shí)驗(yàn)？ 三、流式實(shí)驗(yàn)中涉及到的關(guān)鍵步驟 四、常見流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用,一、流式細(xì)胞術(shù)基本概念,流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）是對(duì)于處在快速直線流動(dòng)中的細(xì)胞和生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析和分選技術(shù). 研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等。 對(duì)生物顆粒的物理參數(shù)及生物學(xué)特性進(jìn)行定性和定量分析。,流式細(xì)胞儀構(gòu)造圖,流式細(xì)胞儀五大系統(tǒng),流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) 激光光源及光束成形系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng) 信號(hào)檢測(cè)與分析系統(tǒng) 細(xì)胞分選系統(tǒng),流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng),流動(dòng)室，430180um,鞘液,1.空氣加壓進(jìn)樣

2、 2.蠕動(dòng)泵精確定量進(jìn)樣,激光光源與光束成形系統(tǒng),1.氬離子氣體激光器，2266um 2.固體激光器,405nm, 488nm,561nm,635nm,光學(xué)系統(tǒng),透鏡、濾光片、小孔； lp：long-pass filter sp：short-pass filter bp：band-pass filter,信號(hào)檢測(cè)與分析系統(tǒng),物理參數(shù) fsc：前向角散色光， 代表細(xì)胞大小 ssc：側(cè)向角散色光，代表細(xì)胞顆粒度,粒細(xì)胞,單核細(xì)胞,淋巴細(xì)胞,紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片,實(shí)驗(yàn)中，常利用fsc和ssc這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。,閾值：溶液中的雜質(zhì)或者死細(xì)胞，很容易

3、產(chǎn)生微小的干擾信號(hào)，所以必須設(shè)置閾值，排除雜質(zhì)、細(xì)胞碎片或體積較小的死細(xì)胞。 fsc反映細(xì)胞體積的大小，fcm應(yīng)用時(shí)常選取fsc設(shè)定閾值。,5%,32%,默認(rèn)閾值,升高閾值后,熒光信號(hào) 細(xì)胞自發(fā)熒光 特異熒光素標(biāo)記激發(fā)的熒光信號(hào) 熒光信號(hào)的線性測(cè)量和對(duì)數(shù)測(cè)量-光電倍增管 1）檢測(cè)光子，轉(zhuǎn)換成電信號(hào) 2）將電信號(hào)等比例的放大 熒光信號(hào)的面積、寬度和高度,由于光信號(hào)比較弱，需將其等比例放大，方便計(jì)算機(jī)分析處理，一般信號(hào)的放大可以使用線性或?qū)?shù)兩種方式。 一般fsc和ssc變異范圍較小，故使用線性放大；熒光信號(hào)變異范圍較大，多使用對(duì)數(shù)放大。,線性測(cè)量：dna含量、rna含量、總蛋白含量 對(duì)數(shù)測(cè)量：細(xì)

4、胞膜表面抗原檢測(cè),直方圖（distribution histogram） 橫坐標(biāo)：道數(shù) 縱坐標(biāo)：細(xì)胞數(shù),散點(diǎn)圖（dot plot） 橫坐標(biāo)：某細(xì)胞參數(shù)相對(duì)含量 縱坐標(biāo)：該細(xì)胞另一參數(shù)含量,等高線圖（contour plot）,細(xì)胞分選系統(tǒng),macs 技術(shù)：magetic activated cell sorting 免疫學(xué)+細(xì)胞生物學(xué)+磁力學(xué),電荷式分選 超聲振動(dòng)器(15-100khz) 液流充電系統(tǒng) 高壓偏轉(zhuǎn)板 收集裝置(流式管、離心管、培養(yǎng)板、載波片等),二、熒光素,熒光的概念：,激發(fā)波長(zhǎng) excitation wavelength,發(fā)射波長(zhǎng)(熒光波長(zhǎng)) emission waveleng

5、th,激發(fā)光譜：特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光 發(fā)射光譜：某一波長(zhǎng)激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的熒光,熒光素（fitc/pe/percp/apc等) 抗體偶聯(lián)熒光素； 分子探針結(jié)合熒光素annexin v-fitc； 熒光染料/熒光化合物 pi、7-aad等插入核酸鏈中； cfse和蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合； 熒光蛋白-如gfp、rfp、yfp、cfp、mcherry、dsred等，自身發(fā)熒光。,常用熒光素,常用熒光染料,pi（碘化丙啶 535, 623） 可選擇性的插入核酸雙螺旋堿基對(duì)中。常用于dna分析，需要用rnase處理細(xì)胞排除rna對(duì)dna熒光定量的影響；pi不能透過活細(xì)胞膜，常用于鑒定死

6、細(xì)胞。 7-aad（7-氨基放線菌素d 545, 647 ） 以插入的方式與dna鏈的g-c堿基對(duì)結(jié)合，不能透過活細(xì)胞膜，常用于鑒定死細(xì)胞。 dapi（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式與dna鏈上的a-t堿基對(duì)特異性結(jié)合。變異系數(shù)明顯小于其他染料，一種理想的dna定量染料。 hoechst（343, 450）常見為hoechst33342和hoechst33258，非嵌入的方式與dna鏈上的a-t堿基對(duì)結(jié)合。能對(duì)活細(xì)胞染色，用于活細(xì)胞dna定量分析，如精子分選；還用于側(cè)群細(xì)胞的分選。 py（派若寧 560, 573） rna染料，能進(jìn)入活細(xì)胞。 ao（吖啶橙 5

7、09, 525） dna、rna染料，染色后dna呈黃綠色熒光，rna呈橙黃色熒光，可進(jìn)行dna/rna雙參數(shù)分析。,三、如何設(shè)計(jì)流式實(shí)驗(yàn),確定實(shí)驗(yàn)要檢測(cè)的marker 選擇合適的熒光素標(biāo)記的抗體 選擇合適的同型對(duì)照抗體,細(xì)胞處理（全血，培養(yǎng)的細(xì)胞） 染色（室溫，20min） 離心洗滌（全血裂紅） 上機(jī)檢測(cè),準(zhǔn)備工作：,實(shí)驗(yàn)步驟：,a、根據(jù)機(jī)器配置選擇熒光素 多色標(biāo)記熒光素搭配原則：每個(gè)通道只能選擇一種熒光素；各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配。 facscalibur常用四色搭配：fitc、pe、percp、apc。,1)熒光素的選擇：,b、根據(jù)抗原表達(dá)強(qiáng)弱合理分配熒光素,熒光素的強(qiáng)度： 染色

8、指數(shù) stain index,stain index = d/w,cd4,高表達(dá)的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的熒光素分配給表達(dá)低的抗原： cd4-fitc、cd25-apc、foxp3-pe,fsc,ssc,cd4 fitc,ssc,cd25 apc,foxp3 pe,盡量選擇光譜重疊小的熒光素，如fitc/pe-cy7； 選擇不同激光激發(fā)的熒光素，如fitc/apc，pe/apc；,c、選擇光譜重疊小的染料,d、盡量避免偶聯(lián)染料使用帶來的假陽性,0 hour,2 hours,22.5 hours,pe,cd3 pe-cy5,cd8 pe-cy7,樣本曝光時(shí)間,3）流式試驗(yàn)對(duì)照設(shè)置,a

9、、空白對(duì)照 negative control 細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)自身也發(fā)出熒光，能被fcm靈敏的檢測(cè)到，這種未染色的細(xì)胞自身發(fā)出的一些熒光稱為自發(fā)熒光。 設(shè)置空白對(duì)照（未染色的細(xì)胞），用以區(qū)分細(xì)胞的自發(fā)熒光和特異性熒光，避免假陽性的結(jié)果。,流式結(jié)果中熒光強(qiáng)弱是一個(gè)相對(duì)值，光電倍增管電壓越大，電子信號(hào)越強(qiáng)；電壓越小，信號(hào)越弱。 通過調(diào)節(jié)電壓，使陰性對(duì)照管的熒光強(qiáng)度處于陰性的位置，實(shí)驗(yàn)組的熒光值都是相對(duì)對(duì)照組。,001,001,002,同型對(duì)照抗體：與實(shí)驗(yàn)染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型 （fc段相同，f（ab）2段不同） 與染色的單克隆抗體： 相同種屬來源 相同免疫球蛋白及亞型 相同熒光素標(biāo)記

10、 相同劑量和濃度 但由未免疫動(dòng)物血清純化而來 用此消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面fc受體而產(chǎn)生的背景染色,b、同型對(duì)照 isotype control,c、陽性對(duì)照 positive control,設(shè)置陽性對(duì)照是為了檢測(cè)熒光抗體是否有效，并不是每次分析時(shí)都必須設(shè)置： 使用新的熒光素抗體時(shí)； 使用存儲(chǔ)時(shí)間較長(zhǎng)的熒光素抗體時(shí)。 設(shè)置陽性對(duì)照的方法： 用肯定表達(dá)有該抗原的細(xì)胞來檢測(cè)； 已經(jīng)證明有效的、偶聯(lián)其他熒光素的該抗原的抗體。,什么是熒光補(bǔ)償？糾正熒光素發(fā)射光譜重疊 為什么要進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)？,520,400,500,600,700,575,665,fitc,pe,pc5,laser,d、 單

11、標(biāo)對(duì)照 single staining control,補(bǔ)償調(diào)節(jié)方法：,fl2 - %fl1,fl-1(fitc),fl-2(-),fl-1(-),fl-2(pe),fl1 - %fl2,before compensation,after compensation,fitc 單標(biāo),pe 單標(biāo),什么樣的補(bǔ)償最合適？,單染管的陰性群體和陽性群體在所需調(diào)節(jié)通道的熒光median值相等時(shí)為最合適的補(bǔ)償。,uncompensated,compensated,fl1-fitc stain,fl2-no stain,fl1-fitc stain,pe-medianneg pe-medianpos,pe-me

12、dianneg= pe-medianpos,pe-medianneg pe-medianpos,fl1-fitc stain,overcompensated,準(zhǔn)確補(bǔ)償?shù)闹匾?補(bǔ)償調(diào)節(jié)要合適,未補(bǔ)償,正確補(bǔ)償,fitc-pe補(bǔ)償太大,pe-fitc補(bǔ)償太大,使用單種熒光素標(biāo)記的單克隆抗體和其余熒光素對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照抗體分別染色 n色分析就要制備n 個(gè)補(bǔ)償對(duì)照管,舉例：雙染實(shí)驗(yàn),設(shè)門與數(shù)據(jù)分析,門(gate，簡(jiǎn)寫g)是流式細(xì)胞術(shù)中的一個(gè)重要術(shù)語，fcm數(shù)據(jù)分析過程實(shí)際上就是選門和設(shè)門的過程。,流式結(jié)果,十字門,線性門,細(xì)胞功能 細(xì)胞表面、胞漿、核的特異性抗原 細(xì)胞活性 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子 酶活性 細(xì)胞

13、受體 細(xì)胞內(nèi)鈣離子,流式細(xì)胞儀檢測(cè)范圍,hiv免疫分型，cd4絕對(duì)計(jì)數(shù) 白血病和淋巴瘤的免疫分型 腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析 網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè) 干細(xì)胞計(jì)數(shù) 殘量白血病細(xì)胞檢查 hla-b27檢查 血小板功能及相關(guān)疾病,醫(yī)學(xué)應(yīng)用,科研應(yīng)用,在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用: 鑒定免疫細(xì)胞類型 抗原特異性t細(xì)胞研究 細(xì)胞因子分泌細(xì)胞研究 全血細(xì)胞研究 凋亡檢測(cè) 細(xì)胞增殖檢測(cè) 干細(xì)胞向免疫細(xì)胞分化的研究 轉(zhuǎn)染熒光蛋白細(xì)胞系研究 稀有細(xì)胞檢測(cè) 。,在神經(jīng)生物學(xué)研究中的應(yīng)用： 神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的特性研究； 不同類型的神經(jīng)細(xì)胞的鑒定和功能研究； 星形膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定和功能研

14、究； 檢測(cè)細(xì)胞活性，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期； 神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過程研究 干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化研究 。,在腫瘤研究中的應(yīng)用： 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)； 細(xì)胞周期分析； 細(xì)胞增殖研究； 熒光蛋白分析； 腫瘤干細(xì)胞的鑒定和功能分析； 循環(huán)腫瘤細(xì)胞的鑒定和功能分析； 實(shí)體瘤細(xì)胞的檢測(cè)分析（腫瘤組織解離成單細(xì)胞后）； 腫瘤細(xì)胞系表型分析； 細(xì)胞活性的檢測(cè)； 。,在細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用： 檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率； 檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率； 分析細(xì)胞中熒光蛋白的表達(dá)； 分析蛋白蛋白之間的相互作用（fret） 分析細(xì)胞活性，細(xì)胞凋亡，和細(xì)胞周期； 研究細(xì)胞的分化過程； 研究細(xì)胞增殖； 。,在高通量檢測(cè)和新藥研發(fā)中的應(yīng)用： 細(xì)胞

15、功能變化的研究； 細(xì)胞周期和活性； 細(xì)胞凋亡； 細(xì)胞增殖； 新藥研發(fā)； 培養(yǎng)基研發(fā)； 。,海洋生物學(xué) 富集和分析細(xì)菌，藻類，浮游植物等 微生物學(xué) 細(xì)菌和酵母檢測(cè)； 熒光蛋白檢測(cè)。 生物燃料 bodipy和/或 nile red中脂類的定量 藻類，藍(lán)藻細(xì)菌，酵母和細(xì)菌等生物的富集,4.1 細(xì)胞周期檢測(cè),處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞dna含量不同，g0/g1期細(xì)胞含有二倍體量的dna，g2/m期細(xì)胞含有四倍體量的dna，而s期細(xì)胞dna含量處于二倍體和四倍體量之間。 dna熒光染料能與dna結(jié)合，dna含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度反應(yīng)了dna吸收熒光分子的多少。通過流式檢測(cè)就能反映細(xì)胞內(nèi)

16、dna的含量，區(qū)分細(xì)胞周期的g0/g1期、s期和g2/m期細(xì)胞比例。,四、常見流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用,細(xì)胞周期分析核酸染料 細(xì)胞膜非通透性染料：pi(碘化丙啶)、eb(溴化乙啶)，不能進(jìn)入完整細(xì)胞膜，標(biāo)記時(shí)需要通過固定等方法增加細(xì)胞膜的通透性。 細(xì)胞膜通透性染料：hoechst、dpai等能染活細(xì)胞的dna，但需紫外激光激發(fā)。 pi標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞周期 需要乙醇固定增加細(xì)胞膜的通透性； 需要加rnase，去除rna對(duì)dna的干擾。,pi法檢測(cè)細(xì)胞周期一般步驟： 收集單細(xì)胞懸液(1 106個(gè))，緩慢加入1 ml預(yù)冷的70乙醇，于4固定過夜，或-20長(zhǎng)期固定。 離心收集細(xì)胞，再以1ml pbs徹底洗去乙醇；

17、 去上清后加入染色液(包含50ug/ml pi，100ug/ml rnase a，0.2% triton x-100)，37 染色30min后上機(jī)檢測(cè)。,細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果,通過流式檢測(cè)，能得出g0/g1期、s期和g2/m期細(xì)胞比例。 增殖指數(shù)(proliferous index, pi)：指處于s期和g2/m期細(xì)胞之和占總細(xì)胞的比例，反映了細(xì)胞的增殖能力。 cv值(變異系數(shù))：衡量?jī)x器測(cè)量分辨率和精度的指標(biāo)。,脾臟細(xì)胞,培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞,dna倍體檢測(cè),病變腫瘤細(xì)胞常出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和染色體異常，流式檢測(cè)dna含量能反映異倍體情況。 dna指數(shù)(dna index, di)：(樣本的g0/g1期峰平均熒光

18、道數(shù))/(正常二倍體細(xì)胞g0/g1期峰平均熒光道數(shù))。 倍體(ploidy)：染色體數(shù)目。二倍體 di=1；四倍體 di=2；二倍體四倍體之外統(tǒng)稱異倍體。,二倍體,四倍體,異倍體,小鼠精子單倍體細(xì)胞,亞二倍體(sub-g1)峰的檢測(cè),凋亡細(xì)胞核小體崩解，dna含量減少，加之由于dna的降解，與熒光染料的結(jié)合減少，因此dna染料的著色能力下降，熒光強(qiáng)度降低，表現(xiàn)在g1峰前出現(xiàn)亞二倍體峰，即亞g1峰(凋亡峰)。,細(xì)胞凋亡峰 sub-g1,四倍體峰,二倍體峰,pi,number,4.2 annexin v/pi雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,正常細(xì)胞膜是不對(duì)稱性的，胞漿面含有帶負(fù)電的磷脂(如磷脂酰絲氨酸, ps)。早期凋亡時(shí)，細(xì)胞表面不對(duì)稱性發(fā)生改變，ps外翻到胞外側(cè) annexin v是一種ca2+依賴性的對(duì)ps有高度親和力的磷脂結(jié)合蛋白，可作為探針識(shí)別膜表面是否有ps，從而識(shí)別凋亡細(xì)胞。,pi常用于鑒別死細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然是完整的，所以pi不能進(jìn)入早期凋亡細(xì)胞核內(nèi)。,annexin v-fitc,pi,活