seldi技術(shù)分析體外培養(yǎng)不同肝細(xì)胞株差異蛋白的表達(dá)(1)

SELDISELDI 技術(shù)分析體外培養(yǎng)不同肝細(xì)胞株技術(shù)分析體外培養(yǎng)不同肝細(xì)胞株 差異蛋白的表達(dá)差異蛋白的表達(dá)(1)(1) 作者：丁守怡，錢(qián)冬萌，牟文鳳，閆志勇，宋旭霞， 王斌 【關(guān)鍵詞】表面增強(qiáng)激光解吸/離子化/飛行時(shí)間質(zhì)譜； 蛋白質(zhì)陳列分析；肝腫瘤；腫瘤細(xì)胞,培養(yǎng)的；差異蛋白 Analysisofdifferentproteinexpressionsindifferentliv ercellstrainsinvitrousingSELDI 【Abstract】AIM:Toexaminethedifferentialexpressions ofproteinsinhepatomacellline,hepatomacelllinetransf ectedbyHBV（） comparedwithnormallivercelllinebyusingsurfaceenhanc edlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectro metry,soastoestablishafoundationforfurtherstudyingo nthemechanismofhepatomaattheproteinlevel.METHODS:Th e3typesofcellsabovementionedwereculturedasgeneralan dcollectedwhentheywereingoodconditions.Aftercelldis ruption,SELDITOFMSwasemployedtodetectthedifferentia lexpressionsofproteomesofHepG2,HepGandLO2.RESULTS:N inetyoneproteinswerecapturedbyWCX2array.Comparedwit hnormallivercelllines,inthesegmentsfromMr5000to1500 0,proteinsintheHepG2andshowedapparentchanges,inwhic h2proteinsexpressionswereincreasedincarcinomacells, theother5decreased.NineproteinsinHepG2wereincreased and10proteinsinHepGwereincreased.CONCLUSION:TheSELD IProteinChiptechnologycanbeadesiredmethodindetectin gthebiologicalmarkersintheearlierperiodofhepatoma.T hismethodisofconvenience,highsensitivity,andgoodrep roducibility.Thebiologicaltagsoftissuespecificprote inswefoundhaveapotentialapplyingvalueintheearlydiag nosisofhepatoma.Thesetagsarealsomeaningfulinscreeni ngandidentifyingsignalproteinsfromserumandtissuespe cimenindifferenttypesofhepatoma.Certainfoundationha sbeenestablishedinstudyingtheetiopathogenesisofhepa tomaatthelevelofproteins,aswellasthesearchingofnewt herapeutictargetsites. 【Keywords】SELDITOFMS;proteinarrayanalysis;liverne oplasms;tumorcells,cultured;distinctprotein 【摘要】目的：運(yùn)用表面增強(qiáng)激光解吸/離子化/飛行 時(shí)間質(zhì)譜技術(shù),檢測(cè)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株（HepG2）,轉(zhuǎn)染 乙肝病毒的肝癌細(xì)胞株（）與正常肝細(xì)胞株（LO2）蛋白質(zhì) 的差異表達(dá)，篩選肝細(xì)胞癌的標(biāo)志蛋白，為進(jìn)一步研究肝 癌發(fā)病的蛋白質(zhì)組學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ).方法：常規(guī)培養(yǎng)上述 3 種細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞后采用 SELDITOFMS 技術(shù)用 WCX2 芯片檢測(cè) HepG2,LO2 細(xì)胞內(nèi)蛋白 質(zhì)組學(xué)的差異表達(dá).結(jié)果：WCX2 芯片共捕獲 91 個(gè)蛋白，在 Mr500015000 區(qū)段，與正常肝細(xì)胞株比較，有 7 個(gè)蛋白質(zhì) 在兩種肝癌細(xì)胞中出現(xiàn)明顯變化，其中 2 個(gè)蛋白在肝癌細(xì) 胞中表達(dá)量增高，5 個(gè)蛋白在肝癌細(xì)胞中表達(dá)量降低；另外 兩種肝癌細(xì)胞株也有其各自的標(biāo)志蛋白，9 個(gè)蛋白分子在 HepG2 表達(dá)量增高，10 個(gè)蛋白分子在表達(dá)量增高.結(jié)論： SELDI 蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)可作為檢測(cè)肝癌早期生物標(biāo)記的方 法，它簡(jiǎn)便，敏感性高，重復(fù)性好，本文發(fā)現(xiàn)的這些組織 特異性蛋白生物標(biāo)記對(duì)肝癌的早期診斷有潛在的應(yīng)用價(jià)值， 對(duì)我們從血清或組織標(biāo)本中篩選和鑒定不同型別肝癌細(xì)胞 之間的標(biāo)志蛋白有重要意義，從而為從蛋白質(zhì)水平研究肝 癌的發(fā)病機(jī)制及新的治療靶位的尋找奠定了一定的基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】表面增強(qiáng)激光解吸/離子化/飛行時(shí)間質(zhì)譜； 蛋白質(zhì)陳列分析；肝腫瘤；腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)的；差異蛋白 0 引言 原發(fā)性肝癌在我國(guó)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率 在部分城市中占惡性腫瘤死因的第二位.每年有 11 萬(wàn)人死 于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的 45%.肝癌早期沒(méi)有明顯 體征，多數(shù)病人確診時(shí)已屬晚期，難以治愈，死亡率很高. 所以，對(duì)于肝癌的早期診斷，在無(wú)癥狀的人群中發(fā)現(xiàn)早期 病例，對(duì)控制肝癌的病死率有現(xiàn)實(shí)的意義.因此，研究并尋 找有價(jià)值的預(yù)警肝癌的標(biāo)志物，成為進(jìn)一步提高肝癌臨床 治療水平的關(guān)鍵.任何疾病在出現(xiàn)病理變化之前，細(xì)胞內(nèi)的 蛋白質(zhì)在成分和數(shù)量上都會(huì)有相應(yīng)的改變，癌癥的發(fā)生是 一個(gè)多基因多階段多因子的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，HCC 也不例外，目 前對(duì)肝癌發(fā)生機(jī)制的研究大都是在基因水平，但是 mRNA 的 水平并不能真正代表所表達(dá)的蛋白質(zhì)水平，因此，要求對(duì) 生物功能的執(zhí)行者蛋白質(zhì)進(jìn)行研究. 蛋白質(zhì)組是指一個(gè)基因組、一個(gè)細(xì)胞或組織或一種生 物體所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)1.蛋白質(zhì)組學(xué) （Proteomics）是蛋白質(zhì)組概念的延伸，是在整體水平上 研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動(dòng)規(guī)律的學(xué)科.蛋白質(zhì)組學(xué)技 術(shù)為研究腫瘤標(biāo)志物與腫瘤進(jìn)展轉(zhuǎn)移研究提供良好的技術(shù) 平臺(tái),為研究開(kāi)辟了新的手段和視角.SELDI 蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 是近年來(lái)新興的一種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，它具有簡(jiǎn)單、快捷、 靈敏等特點(diǎn)，可以檢測(cè)分子量在 Mr500500000 之間的蛋白 或多肽，而且所需樣本體積小（400L） 2-3.我們應(yīng) 用細(xì)胞裂解液裂解體外培養(yǎng)的 3 種細(xì)胞（LO2,HepG2,） ，進(jìn) 行了表面增強(qiáng)激光解吸/離子化/飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù) （SELDITOFMS）分析，初步建立了正常肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞 與轉(zhuǎn)染乙肝病毒的肝癌細(xì)胞的蛋白表達(dá)圖譜4 ，發(fā)現(xiàn)了 一系列（信噪比）差異表達(dá)的蛋白，為今后從血清或肝癌 組織中篩選標(biāo)志蛋白提供科學(xué)依據(jù). 1 材料與方法 材料正常肝細(xì)胞株（LO2）購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；肝 癌細(xì)胞株（HepG2）及攜帶乙肝病毒的肝癌細(xì)胞株（）由第 四軍醫(yī)大學(xué)吳力克主任醫(yī)師贈(zèng)送.HPLC 水，乙晴，三氟乙酸， 白芥子酸（SPA）,TritonX100，尿素，4 羥乙基哌嗪乙磺酸 （HEPES） ，表面活性劑（CHAPS）均購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司， 蛋白質(zhì)芯片時(shí)間質(zhì)譜分析儀（PBSC）及 WCX2（弱陽(yáng)離子 交換芯片）購(gòu)自美國(guó) CiphergenBiosystems 公司. 方法 細(xì)胞總蛋白質(zhì)的提取 LO2,HepG2 細(xì)胞采用含 100mL/L 胎牛血清的 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞另外加入終濃度 200g/L 的 G418,細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用無(wú)菌細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，PBS 洗 3 次，加入裂解液 （8mol/Lurea,40g/LCHAPS,40mmol/LTrisHCl，pH） 200L,4劇烈震蕩 30min,20817