細菌的生理生化反應.ppt

實驗十 細菌的生理生化反應 一、 目的 1.1 了解細菌鑒定中常用的生理生 化試驗反應原理 1.2 掌握測定細菌生理生化反應的 技術(shù)和方法 二、 原理 各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異。 不同微生物因具有不同的酶系統(tǒng)，分解利用糖 類、脂肪類和蛋白類物質(zhì)的能力不同，其發(fā)酵 的類型和產(chǎn)物也不相同。細菌的生理生化反應 在菌株的分類鑒定中有很大作用。 三、 材料 3.1 菌種 大腸桿菌（Escherichia coli） 產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes） 普通變形桿菌（Proteus vulgaris） 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的斜面菌種 3.2 培養(yǎng)基 糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖、乳糖）、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、 蛋白胨水培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、H2S試驗培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng) 基 3.3 試劑 V. P試劑、甲基紅試劑、吲哚試劑、乙醚、1.6%溴甲酚紫指示劑、碘 液。 3.4 器具 恒溫培養(yǎng)箱、試管、移液管、杜氏小管。 四、步驟 (一) 糖類發(fā)酵試驗 （二） 乙酰甲基甲醇試驗(VP試驗) （三） 甲基紅試驗（M.R.試驗） （四） 吲哚試驗 （五） 檸檬酸鹽試驗 （六） 硫化氫試驗 （七） 淀粉水解試驗 (一) 糖類發(fā)酵試驗 原理 可根據(jù)細菌分解利用糖能力的差異表現(xiàn)出是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作為 鑒定菌種的依據(jù)。是否產(chǎn)酸，可在糖發(fā)酵培養(yǎng)基中加入指示劑 ，經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)指示劑的顏色變化來判斷。是否產(chǎn)氣，可在發(fā) 酵培養(yǎng)基中放入倒置杜氏小管觀察。 材料 菌種：大腸桿菌、變形桿菌 培養(yǎng)基：葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)液、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管 步驟 1 試管標記 取分別裝有葡萄糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管各2支，每種糖發(fā)酵 試管中均分別標記大腸桿菌、普通變形菌。 2 接種培養(yǎng) 以無菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應試管中。置37 恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h-48h，觀察結(jié)果。 與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應結(jié)果為陰 性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用“”表示；如培養(yǎng)液呈 黃色，反應結(jié)果為陽性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用 “”表示。 培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應，表明該菌分解糖能 產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用“”表示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性 反應，記錄用“”表示。 結(jié)果觀察 （二） 乙酰甲基甲醇試驗(VP試驗) 原理 某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮 酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化 為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V.P（+）反 應。 材料 菌 種 : 大腸桿菌（Escherichia coli）、 產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes） 培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液 步驟 1 標記試管 :取2支裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，分別標記大腸桿 菌、產(chǎn)氣腸桿菌。 2 接種培養(yǎng) :以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應試管中。置37 恒溫箱中，培養(yǎng)2448h。 取出以上試管，振蕩2min。加入等量V.P試劑；振蕩試管，以使 空氣中的氧溶入，置37恒溫箱中保溫1530min。 若培養(yǎng)液呈紅色，記錄為V.P.試驗 陽性反應（用“”表示）； 若不呈紅色，記錄為V.P.試驗陰性 反應（用“”表示）。 結(jié)果觀察 （三） 甲基紅試驗（M.R.試驗） 原理 腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮 酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀 酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基pH值下降至pH4.2 以下，使甲基紅指示劑變紅。 材料 菌種 同V.P試驗 培養(yǎng)基 同V.P試驗 步驟 同V.P試驗 1 標記試管:取2支裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，分別標記大 腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌。 2 接種培養(yǎng) :以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應試管中。 置37恒溫箱中，培養(yǎng)2448h。 取出以上試管，各加入23滴甲基紅指示 劑，注意沿管壁加入，仔細觀察培養(yǎng)液上層 。 n若培養(yǎng)液上層變成紅色，即為陽性反應 ，用“”表示； n若仍呈黃色，則為陰性反應，用“”表 示。 結(jié)果觀察 （四）吲哚試驗 原理 :有些細菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成 吲哚。吲哚本身沒有顏色，不能直接看見，但當加入吲哚試劑 （對二甲基氨基苯甲醛試劑）時，該試劑與吲哚作用，形成紅 色的玫瑰吲哚。 材料 菌種：同VP試驗 培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基 試劑：二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。 步驟 1 試管標記 :取裝有蛋白胨水培養(yǎng)液的試管2支，分別標記大 腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌。 2 接種培養(yǎng) :以無菌操作分別接種少量菌苔到以上相應試管中 ，置37恒溫箱中培養(yǎng)2448h。 取出以上試管，在培養(yǎng)液中加入乙醚12ml，經(jīng)充分振蕩使吲哚萃取 至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時沿管壁緩慢加入 510滴吲哚試劑（加入吲哚試劑后切勿搖動試管，以防破壞乙醚層影 響結(jié)果觀察）。 如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚試驗陽性反應，否則為 陰性反應，陽性用“”、陰性用“”表示。 結(jié)果觀察 （五）檸檬酸鹽試驗 原理 有些細菌能夠利用檸檬酸鈉作為碳源，如產(chǎn)氣腸桿菌；而另一些細菌則不能 利用檸檬酸鹽，如大腸桿菌。細菌在分解檸檬酸鹽后，產(chǎn)生堿性化合物，使培 養(yǎng)基的pH升高，當培養(yǎng)基中加入1%溴麝香草酚藍指示劑時，就會由綠色變?yōu)?深藍色。（溴麝香草酚藍的指示范圍為：pH小于6.0時呈黃色，pH在6.07.6時 為綠色，pH大于7.6時呈藍色。） 材料 菌種：同VP試驗 培養(yǎng)基：檸檬酸鹽培養(yǎng)基（固體斜面） 步驟 1 試管標記 取裝有檸檬酸鹽培養(yǎng)基固體斜面的試管2支，分別標記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌 。 2 接種培養(yǎng) 以無菌操作分別接種少量菌苔到以上相應試管斜面上做斜面上做“ “之之” ”字形劃線字形劃線，置37 恒溫箱中培養(yǎng)2448h。 結(jié)果觀察 （六）硫化氫試驗 原理 有些細菌能分解含硫的有機物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等 產(chǎn)生硫化氫，硫化氫一遇培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽等，就形成黑色的硫 化鉛或硫化鐵沉淀物。 材料 菌種：大腸桿菌、變形桿菌 培養(yǎng)基： H2S試驗培養(yǎng)基（固體） 步驟 1 試管標記:取裝有H2S試驗固體培養(yǎng)基的試管2支，分別標記大腸桿 菌、變形桿菌 。 2 接種培養(yǎng):以無菌操作分別用接種針接種針挑取少量菌苔到以上相應試管做 穿刺接種穿刺接種，置37恒溫箱中培養(yǎng)2448h。 結(jié)果觀察 （七）淀粉水解試驗 原理 有些細菌可產(chǎn)生淀粉酶水解培養(yǎng)中的淀粉為糊精，或進一 步水解為麥芽糖，淀粉水解后遇碘不再變藍。 材料 菌種：大腸桿菌、枯草桿菌 培養(yǎng)基：淀粉培養(yǎng)基（固體） 步驟 1 培養(yǎng)皿標記 取裝有淀粉培養(yǎng)基（固體）的培養(yǎng)皿一只，在培養(yǎng)皿兩側(cè) 分別標記大腸桿菌、枯草桿菌。 2 接種培養(yǎng) 以無菌操作分別用接種環(huán)挑取少量菌苔到培養(yǎng)皿相應部位 做十字接種十字接種，置37恒溫箱中培養(yǎng)2448h。 結(jié)果觀察 取出平板，加上少量碘液，輕輕搖動，使碘 液鋪滿平板表面，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透 明圈及圈的大小。 六 實驗結(jié)果與分析 1 配制培養(yǎng)基 糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖、乳糖） 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基 蛋白胨水培養(yǎng)基 淀粉培養(yǎng)基色 H2S試驗培養(yǎng)基 檸檬酸鹽培養(yǎng) 每組配制一種培養(yǎng)基,300mL. 實驗內(nèi)容及分工,時間安排 2 灌裝試管 糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖）-水培養(yǎng)液 糖發(fā)酵培養(yǎng)基（乳糖）-水培養(yǎng)液 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基-水培養(yǎng)液 蛋白胨水培養(yǎng)基-水培養(yǎng)液 檸檬酸鹽培養(yǎng)