《酶聯(lián)免疫分析法》PPT課件.ppt

,第七章 酶聯(lián)免疫分析法,第七章 酶聯(lián)免疫分析法,基本要求： 了解免疫分析發(fā)展史，掌握抗原、抗體和免疫反應的原理，了解免疫分析法的分類，熟悉酶標記免疫分析法中使用的酶，熟悉ELISA的原理，掌握ELISA的固相載體、包被與封閉、稀釋液、洗滌液、酶反應終止液及ELISA法常用酶的底物系統(tǒng)，掌握ELISA的酶聯(lián)方法和試驗方法，熟悉ELISA反應條件的選擇，掌握ELISA的定量計算，了解ELISA的靈敏度提高途徑，熟悉ELISA放大系統(tǒng)。了解化學發(fā)光分析的原理，熟悉化學發(fā)光劑的種類，熟悉化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析常用的標記酶和發(fā)光增強劑，熟悉生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析常用的生物發(fā)光反應體系。,第七章 酶聯(lián)免疫分析法,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述 第二節(jié) 光度酶聯(lián)免疫分析 第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,一、免疫分析 1、免疫分析發(fā)展史 免疫分析（Immunoassay，IA）是利用待測物質（抗原或抗體）與其相對應物質（抗體或抗原）之間專一特異性反應而建立起來的一種高選擇性分析方法。 免疫分析主要基于用抗體（或抗原）作為選擇性化學試劑以分析測定抗原（或抗體）及半抗原。 宋代 人工痘苗預防烈性傳染病天花 1971年 第一屆國際免疫學會議 將免疫學與微生物學分開發(fā)展成一門獨立的學科。,“免疫（immunity）”一詞源于 “immunitas”，原意是免除稅賦和差役。 研究早期免疫學多集中在抗體抗感染能力研究。 20世紀中期以后，人們逐漸開始對各種抗原、微生物的作用進行研究，發(fā)展出基礎免疫學、臨床免疫學、免疫學檢測、醫(yī)學免疫學等多個分支。 現(xiàn)代免疫學將“免疫”定義為：機體對“自己”和“異己”識別、應答過程中所產生的生物學效應的總和，正常情況下是維持內環(huán)境穩(wěn)定的一種生理性功能。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,2、抗原、抗體與免疫反應 抗原是能夠引起免疫反應的分子。 免疫原性（immunogenicity）指誘導刺激免疫系統(tǒng)產生抗體或致敏淋巴細胞的能力。 具有免疫原性的物質稱為免疫原（immunogen）。 免疫反應原性（immunoreactivity）或抗原性（antigenicity），指能與相應抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結合，引起免疫反應的性能。 具備上述兩種特性的物質為完全抗原，僅具有免疫反應性的物質被稱為半抗原（hapten）。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,抗體是能與抗原發(fā)生特異性結合的免疫球蛋白。 所有的抗體都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白都是抗體。 例如無免疫活性的免疫球蛋白（如骨髓瘤蛋白）就不是抗體，盡管其結構與抗體相似。 抗體主要存在于血清內，但在其他體液及外分泌液中也有存在。 抗原抗體分子之間存在著結構互補性和親和性，使得抗原與相應抗體之間極易發(fā)生結合反應，這種反應具有高特異性（即專一性）和可逆性。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,抗原、抗體發(fā)生如下免疫反應： Ag+Ab Ag-Ab 該免疫反應遵循可逆生物大分子相互作用的熱動力學基本原理，其反應式為 式中：Ab為游離的抗體結合位點的濃度；Ag為游離的抗原結合位點的濃度；Ab-Ag為抗原-抗體復合物的濃度；k1為正反應速率常數(shù)；k2為負反應速率常數(shù)；K為反應平衡常數(shù)（親和常數(shù)）。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,這種抗原-抗體反應既可發(fā)生于體內（in vivo），也可發(fā)生于體外（in vitro）。 抗體主要存在于血清中，在抗原、抗體的檢測中多采用血清做試驗，所以體外抗原-抗體反應也稱為血清學反應（serologic reaction）。 基于抗原-抗體反應的檢測技術主要應用于以下幾個方面：用已知抗原檢測未知抗體； 用已知抗體檢測未知抗原； 定性或定量檢測體內各種大分子物質； 用已知抗體檢測某些藥物、激素等各種半抗原物質。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,二、酶標記免疫分析法及常用標記酶 1、免疫分析法分類,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,2、酶標記免疫分析法中使用的酶 （1）酶聯(lián)免疫分析中使用的酶應符合下列條件： 純度高、催化反應的轉化速率高、專一性強； 具有足夠的偶聯(lián)用標記基團，與抗原、抗體蛋白分子偶聯(lián)后仍保持較高的催化活性； 使用穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性好； 測定酶活性的方法簡便、靈敏、快速； 待測體液中不存在與標記酶相同的酶；,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,待測溶液中應該無底物、反應抑制劑和其他與酶發(fā)生反應的干擾物質； 酶的來源、純化和供應較方便，價格較低廉； 均相酶免疫測定法中使用的酶，還要求當抗體與半抗原-酶結合物結合后，酶活性表現(xiàn)出抑制或激活。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,（2）酶的評價指標 通常用RZ和酶的比活力評價標記酶的質量。 RZ表示酶蛋白中活性部分與非活性部分最大吸光度的比值。 酶的比活力指在特定條件下，每1mg酶或每1ml酶液所具有的酶活性單位數(shù)。 （3）酶聯(lián)免疫分析中的常用酶 下表列出了酶聯(lián)免疫分析中的常用酶。其中EC編號是根據(jù)國際酶學委員會的規(guī)定采用四碼編號法確定的每個酶的系統(tǒng)編號。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,酶聯(lián)免疫分析常用酶,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）是一種提取自辣根中，相對分子質量為44kDa的糖蛋白。 其酶學活性部分包括脫輔基蛋白和血紅素基團，輔基亞鐵血紅素在403nm波長呈現(xiàn)最大光吸收值。 HRP的純度以RZ值即A403nm/A275nm的值來衡量，高純度HRP制劑的RZ3.0。 通常以能在20、pH為6.0、20s的時間內催化底物鄰苯三酚產生1mg紅桔酚（purpurogallin）作為HRP酶的1個活性單位。 用于標記的HRP比活性應大于250U/mg。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）幾乎存在于動物和人體的所有組織中，尤其在肝臟、胎盤、白細胞、腎小管中含量高。 AP是一種磷酸酯的水解酶，它能夠催化磷酸單酯、磷酸核苷及6-磷酸糖類等的水解，在釋放磷酸鹽的同時產生有色的或熒光的產物。 堿性磷酸酶的分子質量為80100kDa，最適pH為8.010.0，隨酶源和底物的不同而變化。 AP活性的測定以對硝基磷酸苯酯（PNP）作為底物。 用作標記的AP比活力應大于1000U/mg。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）即-D-葡萄糖氧化還原酶，一般由黑曲霉和青霉產生。 它催化O2和-D-葡萄糖的反應形成H2O2和D-葡萄糖酸-內酯，酯再與水反應生成葡糖酸。 其反應最適pH范圍為4.07.0，pH5.5時，反應速率最大。葡萄糖氧化酶對-D-葡萄糖的-異頭碳有高度專一性。 葡萄糖氧化酶的比活力至少為20U/mg。 葡萄糖氧化酶在4下可穩(wěn)定存在612個月。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,-D-半乳糖苷酶（-D-galactosidase，Gal）即乳糖酶（-lactase），廣泛存在于植物、動物器官、細菌、酵母和真菌中。 當Gal催化水解-D-半乳糖苷時，若得到的半乳糖殘基轉移到水分子受體，稱為水解；若受體是糖或醇時，稱為轉半乳糖苷。 Gal催化-D-半乳糖苷水解反應的最適pH為7.5，轉化效率很高，且比HRP易于標記，背景值低，穩(wěn)定性好。 Gal比活力應不少于30U/mg，5能保存12年。,第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,一、光度酶聯(lián)免疫分析 1、酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）原理 使抗原或抗體結合到某種固相載體表面； 抗原或抗體與某種酶聯(lián)結成酶標抗原或抗體； 在測定時，使受檢標本和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相抗原或固相抗體起反應； 用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例； 加入酶反應底物，底物被酶催化為有色產物，產物量與標本中受檢物的量相關，用分光光度法進行定量。,*Ag是酶標志抗原，Ag是未標志抗原，Ab是特異性抗體，(F)表示游離型的*Ag，(B)表示結合型的*Ag-Ab。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,2、ELISA的固相載體 良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。 最常用的是聚苯乙烯。 聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 ELISA載體的形式有小試管、小珠和微量反應板。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,3、固相載體的包被與封閉 （1）包被（coating）指將抗原或抗體連接到固相載體上的過程。 以聚苯乙烯微量反應板為例，通常先將抗原或抗體溶于pH 9.6的碳酸鹽緩沖液（或pH 7.2的磷酸鹽緩沖液，pH 78的Tris-HCl緩沖液）中，加滿反應孔，置4過夜，洗滌即可。 包被濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協(xié)調選定。 一般蛋白質的包被濃度為0.120g/ml。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（2）封閉（blocking）指繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。 封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質的再吸附。 所有的ELISA固相載體均需封閉。 常用封閉劑有0.05%0.5% BSA；10%小牛血清或1%明膠；脫脂奶粉，比較價廉，可高濃度使用（5%）。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,4、稀釋液、洗滌液和酶反應終止液 （1）稀釋液用于稀釋酶標抗體及標本。 常用中性PBS或Tris-HCl緩沖液，其中含有無關高濃度蛋白（如10動物血清、1BSA（牛血清白蛋白）、1明膠等）和非離子型表面活性劑（如0.05Tween 20或TritonX-100等）。 （2）洗滌液一般與稀釋液相同，常用PBS或Tris-HCl緩沖液。 四種常用的抗體稀釋液和三種常用的洗滌液列于表7-2。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,表7-2 常用的抗體稀釋液和洗滌液,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（3）酶反應終止液 辣根過氧化物酶（HRP）反應終止液為2mol/L4mol/L H2SO4（HRP在酸性條件下喪失酶活性）。 很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標記酶，用3mol/L NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一段時間。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,5、ELISA法常用酶的底物系統(tǒng) ELISA法對底物的要求： 價廉易得、安全； 顯色性和穩(wěn)定性好； 底物本身最好為無色物質； 終止酶催化反應后，底物不應再繼續(xù)地自發(fā)性變性； 其最終產物可溶、易于測定及光吸收值高。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（1）辣根過氧化物酶的底物系統(tǒng) 常見底物有鄰苯二胺（OPD，產物橙紅色，測定波長492nm）、5-氨基水楊酸（5-AS，產物橙色，測定波長550nm）、3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB，產物紅色，測定波長450nm）、2,2-連氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸鹽）（ABTS）等。 ABTS的反應曲線不好。 OPD溶液具有光敏性，相對來說不穩(wěn)定，且具有誘變特性。 TMB的背景值低，溶液穩(wěn)定，沒有誘變特性。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（2）堿性磷酸酶的底物系統(tǒng) 常用的底物為對硝基磷酸苯酯（PNP），水解的產物為黃色的對硝基苯酚，可在405nm處檢測其吸光度的變化，該底物的轉化效率高，線性關系好。 用酚酞磷酸酯為底物，水解生成的酚酞在堿性條件下呈紅色，可在530nm處光度法測定。 此外還可以百里酚酞單磷酸酯等為底物。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（3）-D-半乳糖苷酶的底物系統(tǒng) 常見底物有鄰硝基苯-D-半乳糖苷（ONPG），其水解的產物鄰硝基苯酚在405nm處具有最大吸光度值。 其他的底物有對硝基苯-D-半乳糖苷（PNPG）、苯基-D-半乳糖苷、氯酚紅-D-半乳糖苷（CPRG）、9-羥基-3-異吩噁唑酮-D-半乳糖苷（RG）等。 （4）青霉素酶（PNC）的底物系統(tǒng) 常用底物有溴麝香草酚藍（BTB）、青霉酮酸還原淀粉-碘復合物（SIC）、溴甲酚紫（BCP）和溴麝香草酚藍（21）等。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,二、ELISA酶聯(lián)方法和試驗方法 1、ELISA酶聯(lián)方法 ELISA酶聯(lián)方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。 （1）戊二醛交聯(lián)法 戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以聯(lián)結具有氨基的酶和蛋白質。 戊二醛交聯(lián)法有一步法、兩步法兩種。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,圖7-2 戊二醛一步法反應原理,一步法 將戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應后即得酶標記抗體。 該法操作簡便、有效，重復性好。 缺點是交聯(lián)反應是隨機的，酶與酶、抗體與抗體之間有可能交聯(lián)。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,圖7-3 戊二醛二步法反應原理,兩步法 先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標抗體；或先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結。 兩步法的產物中絕大部分的酶與蛋白質是以1:1的比例結合的，有助于本底的改善。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（2）過碘酸鹽氧化法 本法只適用于含糖量較高的酶。 辣根過氧化物酶（HRP）的標記常用此法。 反應時，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為活潑的醛基，可與蛋白質上的氨基形成Schiff氏堿而結合。 圖7-4 過碘酸鹽氧化法,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,2、ELISA試驗方法 ELISA法中有三個必要試劑：固相抗原或抗體；酶標記抗原或抗體；酶反應底物。 根據(jù)試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。 如雙抗體夾心法、間接法、競爭法、異種動物抗體雙夾心法、抗酶抗體法、競爭性抑制法、雙夾心法和抗原直接包被法等方法。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（1）雙抗體夾心法 雙抗體夾心法（double antibody sandwich，DAS-ELISA）由Clark和Adams于1977年建立，是最經典的ELISA檢測法。 該法的靈敏度高，特異性強，但提純免疫球蛋白和制備酶標記物要求技術性強，成本較高。 該法只適用于二價或二價以上較大分子抗原的檢出和定量分析，而不能用于半抗原等小分子的測定。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,圖7-5 雙抗體夾心法,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（2）間接法 間接法（indirect ELISA）是最常用的ELISA檢測方法，其原理是利用酶標記的抗體和已與固相抗原結合的受檢抗體相結合。 該法只要更換不同的固相抗原，就可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。 該方法不必為每個待測抗體（或抗原）制備特異性的酶標抗抗體（或酶標抗體），極大地簡化了實驗。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,圖7-6 間接法,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（3）競爭法 競爭法（competing ELISA）是利用待測抗原和酶標抗原與特異性抗體競爭結合，或待測抗體和酶標抗體與特異性抗原競爭結合而進行測定的一種方法（圖7-7）。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,圖7-7 競爭法,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（4）異種動物抗體雙夾心法 異種動物抗體雙夾心法（圖7-8），又稱間接雙抗體夾心法（indirect DAS-ELISA）或三抗體夾心法（triple antibodies sandwich，TAS-ELISA）。 此法可用通用的酶標記抗體檢驗多種病毒，它不僅免去了標記每種抗體，而且靈敏度有所提高。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,圖7-8 異種動物抗體夾心法,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（5）抗酶抗體法 抗酶抗體法（圖7-9）是利用免疫學反應而不是用化學交聯(lián)反應來制備酶結合物，常用HRP為標記酶作為抗原免疫動物制備抗HRP抗體。 可用一種動物（如兔）制備特異性抗體（第一抗體）和抗酶抗體（第三抗體），再用另一種動物（如羊）制備抗第一種動物（兔）IgG的抗體（第二抗體）。 讓這種抗IgG的第二抗體把第一抗體（兔IgG）和抗酶抗體（也為兔IgG）通過免疫學反應連接起來。 最后讓酶與抗酶抗體結合，通過對底物的作用而揭示在固相載體上待測抗原的存在。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,優(yōu)點:HRP通過免疫學反應與抗體結合，避免了用化學方法交聯(lián)時抗體活性的改變，也避免了HRP與其他蛋白質分子結合，防止標記抗體和游離的未標記抗體之間的競爭，提高了標記抗體的質量。 在純化化學交聯(lián)反應制備的酶結合物的過程中，除去未標記抗體比較困難，而且該法僅在制備抗酶抗體時用少量純HRP作抗原，所以用較粗制的HRP與抗酶抗體形成免疫復合物，并不影響其質量，這大大節(jié)約了價格較昂貴的精制HRP。 因為制備抗酶抗體必須在動物中進行，故抗酶抗體法多適用于檢測動物中的抗體。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,圖7-9 抗酶抗體法,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,三、ELISA反應條件的選擇 1、酶標抗體濃度的選擇 先用200L IgG（100 mg/ml）包被小孔，再將酶標記抗體球蛋白系列稀釋并加入小孔中，洗滌后，加底物反應，終止后測定吸光度。 選擇吸光度為1的稀釋度作為酶標抗體最適濃度。,圖7-10 酶標抗體濃度的選擇,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,2、包被濃度的選擇 當包被抗原的濃度較低時，包被量隨抗原濃度的增加而增大；當包被抗原達到一定濃度后，包被量為定值，不再隨抗原濃度的增加而增大。 此濃度稱為抗原的飽和包被濃度。,圖7-11 抗原包被量和ELISA反應的關系,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,表7-3 SM-EDA-GA包被法中鏈霉素包被質量濃度對ELISA實驗誤差的影響,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,3、酶-底物反應時間的選擇 抗原與抗體、抗體與酶標抗體反應一般在37反應23h達到高峰。 時間太短，敏感性下降，時間太長，吸附的抗原或復合物（在這個溫度下）可能脫落。 酶-底物反應時間一般采用15min、30min或45min，也可以標準陽性血清為準，隨時測定其OD值，當達到規(guī)定的OD值時，即終止反應。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,四、ELISA的定量計算與靈敏度 1、ELISA的定量計算 一般采用分光光度計測定結合物中的酶量和抗體蛋白（IgG）量，酶量和IgG計算方法如下。 其中，0.4表示酶的A403nm值為1時，酶量為0.4mg/ml；0.42表示酶的A403nm值為1時，其相應A280nm值為0.42；0.62表示在A280nm值為1時，IgG量為0.62mg/ml；0.94表示酶、戊二醛結合后，A280nm增加約6。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,酶結合物中結合的酶量、酶結合率計算方法： 以采用過碘酸鈉氧化法進行酶聯(lián)為例，摩爾比值計算方法： 酶量為1mg/ml，摩爾比值為1.52.0，酶結合率在30%以上時，可獲得較好的ELISA分析結果。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,2、ELISA的靈敏度與ELISA放大系統(tǒng) （1）ELISA的靈敏度 ELISA的檢出限已經達到10-810-12g，但對某些測定仍需更高的靈敏度。 傳統(tǒng)ELISA中顯色劑發(fā)色團的吸光度是限制ELISA靈敏度的主要因素。 改用熒光標記或其他化學發(fā)光物標記抗體替代酶標記抗體可以提高靈敏度。 改變傳統(tǒng)ELISA的操作程序也可以提高靈敏度，如SIMIT技術。 采用放大系統(tǒng)是提高ELISA靈敏度的主要途徑。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（2）ELISA放大系統(tǒng) 生物素-親和素放大系統(tǒng)可增加抗體（或抗原）的標記率。 生物素與親和素結合速率較快且結合物的穩(wěn)定性高（K=1015），不會在孵育和各種洗滌過程中脫落。 生物素對抗體和酶的標記率高（10個生物素分子/抗體分子），且生物素分子易于活化，標記后不影響抗體和酶的活性。 每個親和素分子能結合4個生物素，因而可偶聯(lián)更多的聯(lián)結生物素的酶分子，從而提高ELISA的敏感性。 生物素-親和素標記體系有靈活多變的運用方式，可以適應不同的分析設計。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,微粒放大。用適當?shù)奈⒘４婷?抗體結合物也可以獲得放大效果。 每個微粒表面可以同時結合大量記酶和抗體分子。在包含微粒放大的夾心ELISA法中，微粒通過結合于其上的第二抗體結合于抗原。微粒上又結合著標記酶，其數(shù)量遠比第二抗體能結合的標記酶多，因此得以放大。 例如，微顆粒放大系統(tǒng)用微顆粒硅膠（直徑約40nm）作為中間體連接酶和抗體，避免酶和抗體直接連接。酶微顆粒硅膠可連接上千個酶分子，可使體系增敏，已用于測定甲胎蛋白，靈敏度放大兩個數(shù)量級。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,五、ELISA法的應用 酶免疫測定具有高度的特異性和敏感性，幾乎所有的可溶性抗原-抗體系統(tǒng)均可用以檢測，它的最小可測值達ng甚至pg水平。 酶免疫測定在各應用領域中的普及，應歸功于商品試劑盒和自動或半自動檢測儀器的問世。 目前應用較廣的酶免疫檢測項目一般有試劑盒出售。 完整的ELISA試劑盒應包含包被好的固相載體、酶結合物、底物和各種濃縮的稀釋液、緩沖液等。 這些試劑在冰箱中可保存半年以上，因此實驗室中只需要用蒸餾水稀釋全套試劑即可。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,六、微量致敏性雜質青霉噻唑蛋白的測定 基因工程藥品在生產過程中為防止污染，在細胞培養(yǎng)或發(fā)酵過程中常需加入一定量的青霉素。 青霉素在水溶液中很容易和蛋白質結合形成過敏性雜質青霉噻唑（benzyl penicilloyl，BPO）蛋白，為確?；蚬こ趟幤返漠a品質量，可以用ELISA對基因工程藥品中是否殘存有青霉噻唑蛋白進行檢測，其對樣品中結合青霉素的絕對檢出量小于0.310-6。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,其實驗步驟如下： （1）包被：用碳酸緩沖液（0.1mol/L，pH 9.6）直接包被待測抗原，200L/孔； 包被BPO4-CY作為陽性對照，并設有包被抗原不加抗BPO血清和不包被抗原但加抗BPO血清兩組陰性對照； 此外，實驗中還設有待測抗原-BSA抗血清相互作用組作為陰性血清對照；4冰箱過夜。 （2）用洗滌液（BPS 0.01mol/L，pH 7.2）洗滌三次，每次3min。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（3）與特異性抗體反應：在經洗滌好的酶標板中加入稀釋至一定滴度的抗BPO血清或抗BPO單克隆抗體，200L/孔，37保溫2h。 （4）洗滌三次。 （5）與酶聯(lián)抗抗體反應：再加入150稀釋的GAR-IgG-HRP 200L/孔，37保溫1h。 （6）洗滌三次。 （7）顯色：加入OPD底物液，200L/孔，37顯色。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,（8）用1mol/L的硫酸終止反應，50L/孔，用酶標儀測定其在492nm波長處的光吸收值。 （9）結果判斷：當陽性孔呈陽性，陰性血清呈陰性時實驗成立。 若當待測抗原的測定結果大于陰性對照均值（X）與其2倍標準差（SD）之和（X+2SD），判為陽性； 若小于X+SD，判為陰性； 若在X+2SD與X+SD之間需要調整試驗條件重新測試。 ELISA測定125SerIL-2中青霉噻唑蛋白的結果如下（見表7-4）：,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,表7-4 ELISA實驗測定125SerIL-2*中青霉噻唑蛋白,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,包被樣品稀釋至約210-6mg（110-16mol）/孔時，ELISA反應仍為陽性，提示樣品中BPO的量大于110-5mol，即待測樣品中含有結合青霉素的絕對含量為千分之一左右。,第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法,一、化學發(fā)光分析 1、化學發(fā)光（chemiluminescence，CL） 一些物質在進行化學反應時，吸收了化學反應過程中產生的化學能，使得分子外層電子激發(fā)到激發(fā)態(tài)，生成激發(fā)態(tài)產物。當電子從激發(fā)態(tài)的最低振動能級回到基態(tài)的各個振動能級時，以光輻射的形式釋放能量，這個發(fā)光過程稱為化學發(fā)光，其反應過程如下： 發(fā)光效率表示一個化學發(fā)光分子的量子產率，指每摩爾反應物輻射出光子的量。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,2、化學發(fā)光分析 化學發(fā)光分析是根據(jù)化學反應產生的光輻射確定物質含量的一種痕量分析方法。 化學發(fā)光免疫分析（CLIA）是將化學發(fā)光反應與免疫反應相結合而對抗體、抗原或半抗原進行測定的一種免疫分析方法。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,3、化學發(fā)光劑 用作標記的化學發(fā)光劑應符合以下條件： 能參與化學發(fā)光反應； 與抗原或抗體偶聯(lián)后能形成穩(wěn)定結合物； 偶聯(lián)后仍保留高的量子產率和反應動力； 不改變或極少改變被標記物的物理化學特性，特別是免疫活性。 常用的化學發(fā)光劑有吖啶酯類化合物、氨基苯二酰肼類化合物、咪唑類化合物、苯酚類化合物、芳基草酸酯類化合物等。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,（1）吖啶酯類化合物 吖啶酯是三環(huán)有機化合物，很容易氧化。 當其在堿性介質中氧化時，經歷共價鍵的斷裂，產生二氧酮的中間體，然后形成電激發(fā)的N-甲基吖啶酮。當它回復到基態(tài)時在430nm處釋放出光子。 在加入H2O2及隨后加入NaOH調節(jié)至所需pH之前維持一低pH以實現(xiàn)最佳氧化過程，可加速其氧化反應。 吖啶酯氧化反應如圖7-12所示。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,圖7-12 吖啶酯氧化反應過程,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,吖啶酯類化學發(fā)光劑的典型代表是光澤精（N,N-二甲基吖啶硝酸酯）。 它在堿性條件下，與H2O2等過氧化物作用形成發(fā)光體激發(fā)態(tài)N-甲基吖啶酮。 能促使光澤精激發(fā)的物質還有丙酮、次黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、羥胺及抗壞血酸等。 光澤精的氧化反應如圖7-13所示。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,圖7-13 光澤精的氧化反應,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,吖啶酯類化合物作為化學發(fā)光標記物有顯著的優(yōu)點： 氧化反應不需催化劑，只需要在堿性環(huán)境中就可以進行，發(fā)光反應快速，在1s內光子散射達到高峰，整個過程在2s內完成，可充分計數(shù)，背景噪聲低。 這類化合物與被標記物的結合發(fā)生在分子一定部位，在氧化反應過程中，結合物被分解，吖啶酯分子從發(fā)光的部分斷裂并分離下來，所以吖啶酯的發(fā)光不受抑制，敏感度不受標記反應的影響，試劑穩(wěn)定性好。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,（2）氨基苯二酰肼類化合物 魯米諾（5-氨基-2,3-二氫-1,4-酞嗪二酮）、異魯米諾（6-氨基-2,3-二氫-1,4-酞嗪二酮）及其衍生物如氨丁基乙基異魯米諾（ABEI）、氨己基乙基異魯米諾（AHEI）、氨丁基乙基魯米諾（ABENH）等均屬于這一類化學發(fā)光劑。 魯米諾類化合物的發(fā)光反應必須有催化劑（如過氧化物酶）催化，且與蛋白或肽結合后其發(fā)光作用減弱，因此魯米諾類化合物在CLIA中是很好的底物，但已較少用于CLIA的標記。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,圖7-14 魯米諾、異魯米諾及其某些衍生物的結構式,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,圖7-15 魯米諾化學發(fā)光反應過程,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,（3）咪唑類化合物 咪唑類發(fā)光劑主要是咯吩堿。 其反應過程首先是咯吩堿在堿性二甲亞砜水溶液中形成過氧化物中間體，再進行重排，降解，伴隨產生化學發(fā)光，如圖7-16所示。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,圖7-16 咯吩堿的化學發(fā)光反應,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,（4）苯酚類化合物 用于化學發(fā)光免疫測定的酚類物質主要是鄰苯三酚（焦性沒食子酸），它是一種強還原劑，在催化劑（如HRP、血紅素）催化下，與H2O2反應產生化學發(fā)光。 （5）芳基草酸酯類化合物 這類化合物主要有雙-（2,4,6-三氯苯基）草酸酯（TCPO）和雙-（2,4-二硝基苯基）草酸酯（DNPO）。 此類物質的發(fā)光反應是在反應體系中加入一種熒光染料如8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）作為熒光載體，通過過氧化草酸酯中間產物捕獲化學能，使熒光體處于激發(fā)態(tài)，退激至基態(tài)時，放出光子。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,二、化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 1、化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 以在酶催化反應中可以產生化學發(fā)光的發(fā)光物質作為底物，以化學發(fā)光法檢測酶的活性，則為化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析（chemiluminescent enzyme immuno- assay，CLEIA）。 CLEIA方法的檢測限低至10-17mol/L，達到或超過放射免疫分析的靈敏度。 化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析實際上是一種酶聯(lián)免疫測定過程。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,2、CLEIA常用的標記酶 CLEIA方法中最常用的是辣根過氧化物酶和葡萄糖氧化酶（GOD）。 此外還有丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、螢火蟲素酶、堿性磷酸酶（AP）和-D-半乳糖苷酶等。 HRP標記的CLEIA，常用的底物為魯米諾或其衍生物。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進行，通常以0.1mol/L、pH8.6的Tris緩沖液作底物液，魯米諾和H2O2在無HRP催化時也能緩慢自發(fā)發(fā)光，而在最后光強度測定中造成空白干擾，因而宜分別配制成兩瓶試劑溶液，只在用前即刻混合。 HRP催化魯米諾的氧化反應可被某些酚類物質（如對碘苯酚）或螢火蟲熒光素酶等增強。 增強劑的作用是增強發(fā)光和延長發(fā)光時間，由此可提高敏感度。 另外一些金屬配合物能催化魯米諾的化學發(fā)光反應。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,利用GOD對葡萄糖的催化氧化產生H2O2，用化學發(fā)光反應底物檢測產生的H2O2，可間接測定GOD的活性。 常見發(fā)光反應底物有魯米諾、TCPO等。 如Masako和Akio以GOD為標記酶，魯米諾-H2O2作為發(fā)光底物，以流動注射化學發(fā)光分析測定17-羥基孕甾酮、甲胎蛋白和胰島素，檢測限分別為0.5pg/ml、0.1ng/ml和0.1ng/ml，而且分析速度快，測定結果精密度好。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,3、CLEIA常用的發(fā)光增強劑 在反應體系中引入增強劑，可增強化學發(fā)光強度，提高化學發(fā)光測定的信噪比，提高化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析靈敏度。 最常用的增強劑有螢火蟲熒光素、苯并噻唑、苯酚取代物、取代聯(lián)苯胺、酸類衍生物、萘酚等。 例如，螢火蟲素、6-羥基苯噻唑衍生物等能加強HRP催化魯米諾等的化學發(fā)光反應，使其強度提高80倍； 某些酸類衍生物尤其是對碘酸、苯甲酸等的增強效果更佳，可使其發(fā)光強度提高1000倍，且延長發(fā)光持續(xù)時間。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,三、生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 在18851887年，Dubois從發(fā)光昆蟲和有雙殼的軟體動物體內提煉出各種材料，發(fā)現(xiàn)這些材料混合在一起能產生發(fā)光；他將其中可被穩(wěn)定加熱的物質稱為熒光素，而將加熱不穩(wěn)定的物質稱為熒光素酶。 生物發(fā)光現(xiàn)象的化學本質就是熒光素與熒光素酶發(fā)生化學反應，可看成是特殊形式的化學發(fā)光。 一般而言，生物發(fā)光量子產率和特異性均比化學發(fā)光高，量子產率接近100，發(fā)光強度大，持續(xù)時間長，發(fā)光穩(wěn)定，故生物發(fā)光分析靈敏度高，容易測定。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,將高靈敏度的生物發(fā)光與特異性的酶聯(lián)免疫分析技術相結合便形成生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法（BLEIA）。 常采用戊二醛法將熒光素酶與抗原或抗體結合。 現(xiàn)在已經可以提取純度很高的熒光素和熒光素酶，建立起了各種各樣的生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法，這些方法應用于生物體液中各種激素、藥物、微生物、抗原、抗體等成分的測定。 生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析在臨床分析上也越來越廣泛地引起人們的重視。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,最常用于生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析的生物發(fā)光反應有以下兩種： （1）熒光素-熒光素酶生物發(fā)光體系。 熒光素（LH2）和熒光素酶（E）在三磷酸腺苷（ATP）、Mg2+、O2存在下，可產生焦磷酸（PPi）和一磷酸腺苷（AMP），接著O2和E，LH2，AMP引導熒光素脫羧，形成激發(fā)態(tài)產物氧化熒光素（L*），它在返回基態(tài)時發(fā)光，發(fā)射光的波長max=562nm。 利用上述生物發(fā)光反應與一個酶催化的反應相耦合，即可進行生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析。,第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析,例如用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶標記三硝基甲苯（TNT），利用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶能催化葡萄糖-6-磷酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的反應與生物發(fā)光反應相耦合。 葡