浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院畢業(yè)論文設(shè)計(jì).doc

浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）文獻(xiàn)綜述柑橘發(fā)育階段萜類(lèi)成分的合成及其相關(guān)基因調(diào)控的研究學(xué)生姓名：湯沁學(xué)號(hào)：3071601009專(zhuān)業(yè)：應(yīng)用生物科學(xué)班級(jí)0703指導(dǎo)老師：張波植物萜烯類(lèi)香氣物質(zhì)形成及TPS基因家族表達(dá)的研究1.國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀1.1 果品風(fēng)味研究進(jìn)展風(fēng)味能刺激消費(fèi)者的感官及心理，使各種果品呈現(xiàn)出各自的特征。風(fēng)味是指品嘗過(guò)程中嗅覺(jué)、味覺(jué)和三叉神經(jīng)感覺(jué)的特征的復(fù)雜結(jié)合，它包括人所能感覺(jué)到的食品的香氣、味道、口感和外部特征1。香氣作為風(fēng)味指標(biāo)之一，它的好壞直接影響消費(fèi)者的購(gòu)買(mǎi)，目前對(duì)果品的香氣研究已成為國(guó)際上研究的熱點(diǎn)之一。1.2 萜烯類(lèi)物質(zhì)研究進(jìn)展植物的香味是由其含有的不同揮發(fā)性物質(zhì)所決定的，構(gòu)成果實(shí)香氣的物質(zhì)主要包括酯類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)和萜烯類(lèi)物質(zhì)2。萜烯類(lèi)物質(zhì)是葡萄2、柑橘等3的特征香氣物質(zhì)。1.2.1 物質(zhì)鑒定與分析進(jìn)展自20世紀(jì)60年代起，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)開(kāi)始用于風(fēng)味的分析1。孫曉萍等4采用常壓水蒸氣蒸餾的方法，從四川產(chǎn)花椒中提取揮發(fā)性成分，并采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果鑒定出47種化合物，占色譜總分出峰的97.75，其中主要為揮發(fā)性萜烯類(lèi)化合物及其衍生物等，占總檢出量的89.30。李瑞紅5采用頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)，分別鑒定了處于花蕾期、始花期、盛花期和衰老期的白姜花，共鑒定出49種白姜花的香味組分。柑橘類(lèi)果皮中富含柑橘精油，其主要成分是萜烯類(lèi)、倍半萜烯類(lèi)以及高級(jí)醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)等組成的含氧化合物，其中90以上是萜烯類(lèi)和倍半萜烯3。柴靜6以我國(guó)湖北省具有代表性的優(yōu)勢(shì)柑橘品種為研究對(duì)象，通過(guò)超臨界CO2萃取技術(shù)對(duì)橘皮精油進(jìn)行提取分離；采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同品質(zhì)橘皮精油的香氣成分作了對(duì)比分析；運(yùn)用高效液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)橘皮精油中黃酮類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了分離鑒定。另外,對(duì)檸檬果皮中單萜物質(zhì)的氣相色譜-質(zhì)譜研究顯示，檸檬中單萜物質(zhì)75%為檸檬烯，11%為-萜品烯，4%為-蒎烯7。1.2.2 生物學(xué)功能研究進(jìn)展人類(lèi)已經(jīng)從植物中提取萜烯類(lèi)物質(zhì)，并將其廣泛用于合成香水、香料、藥劑、殺蟲(chóng)劑等制品。作為一種揮發(fā)性物質(zhì)，除了具有巨大的商業(yè)價(jià)值，萜烯類(lèi)物質(zhì)對(duì)植物本身也具有重要的生物學(xué)作用。它不僅在植物生長(zhǎng)發(fā)育，如在激素赤霉素的合成中必不可少，而且在植物和環(huán)境的相互聯(lián)系中也起了極其重要的作用8。1.2.2.1抗蟲(chóng)性棉花抗蟲(chóng)萜烯類(lèi)化合物廣泛存在于棉花各組織器官的色素腺內(nèi)，是棉花中除縮合單寧、黃酮類(lèi)化合物之外又一類(lèi)重要的抗蟲(chóng)性次生物質(zhì)。60年代起就開(kāi)始了萜烯類(lèi)化合物對(duì)棉花抗蟲(chóng)性能的研究9。1.2.2.2抗逆性萜烯類(lèi)物質(zhì)合成前體異戊二烯和單萜烯可以保護(hù)植物，避免瞬時(shí)高溫對(duì)光合器官的損害，并能防止光合器官光合能力下降10。1.2.2.3信號(hào)作用一些萜烯類(lèi)物質(zhì)可作為植物與環(huán)境、植物間以及植物器官間的氣體信號(hào)，這種交流存在于相同品種或不同品種植物間10。1.2.3 物質(zhì)釋放規(guī)律研究 梁寶生等11采用流動(dòng)式采樣與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法研究了意大利撒丁島Noaks Ark自然生態(tài)區(qū)主要灌木黃連木（Pistasica lentiscus）萜烯類(lèi)化合物排特征、排放速率及其日變化。研究發(fā)現(xiàn)，萜烯排放速率隨溫度的升高而增加，并呈指數(shù)相關(guān)。在姜花中的研究發(fā)現(xiàn)，單萜類(lèi)化合物含量隨著花的發(fā)育而逐漸增多4。1.3萜烯類(lèi)合成酶及相關(guān)基因的研究進(jìn)展1.3.1萜烯類(lèi)物質(zhì)的合成途徑萜烯類(lèi)化合物是由五碳化合物異戊二烯為結(jié)構(gòu)單位構(gòu)成的一類(lèi)化合物，根據(jù)數(shù)目不同可分為單萜、倍半萜、雙萜和三萜。萜烯類(lèi)合成路徑是植物中合成芳香揮發(fā)物的主要路徑。單萜，雙萜和三萜，通常由3-磷酸甘油醛或脫氧-5-磷酸木酮糖(DOXP) 通過(guò)異戊萜二磷酸(IPP) 在質(zhì)體中合成。異戊烯基二磷酸(IPP) 和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP) ，是萜烯類(lèi)合成共同的前體。在質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì)中分別合成的單萜底物牻牛兒基二磷酸 (GPP) 和倍半萜底物法尼基二磷酸 (FPP)，最后在萜類(lèi)合成酶( TPS) 的催化下生成各自的產(chǎn)物2。其中，質(zhì)體的三磷酸甘油醛丙酮酸 (GAP -pyruvate) 途徑合成的IPP和DMAPP，通過(guò)關(guān)鍵酶1-脫氧木酮酸-5-磷酸酯合成酶 (DXPS)，最終合成異戊烯和單萜；細(xì)胞質(zhì)的乙酸-甲羥戊酸 (acetate-MVA) 途徑合成的IPP和DMAPP，主要限速酶為3-羥基-3-甲基戊二?；?輔酶 A還原酶 (HMGR)，最終合成倍半萜。（圖一）1.3.2萜類(lèi)合成酶活性及相關(guān)基因調(diào)控研究進(jìn)展根據(jù)萜烯類(lèi)合成的基本途徑可見(jiàn)，萜類(lèi)合成酶是合成萜烯類(lèi)物質(zhì)的主要酶。在萜類(lèi)合成酶的研究上，對(duì)模式植物如擬南芥、玉米、稻、馬鈴薯、苜蓿屬和云杉屬的研究表明，其基因序列和表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）數(shù)據(jù)顯示存在大量的TPS基因家族成員，對(duì)其進(jìn)化機(jī)制及對(duì)調(diào)控萜烯類(lèi)物質(zhì)多樣性已有深入研究8。目前，大量萜類(lèi)合成酶被發(fā)現(xiàn)，隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的提高，例如利用基因組測(cè)序獲得的信息來(lái)進(jìn)行序列拼接，可獲得基因的全長(zhǎng)12。在姜花中利用RT-PCR與RACE相結(jié)合的方法，在花中克隆得到一個(gè)單萜合成酶基因的cDNA全長(zhǎng)序列Hc-monotps，一個(gè)萜類(lèi)合成酶基因Hc-tps1的 3端序列4。Takehiko等從溫州蜜柑中分離出四個(gè)單萜合成酶的基因，CitMTSE1，CitMTS3，CitMTS61和CitMTS62。這四個(gè)基因通過(guò)體外功能試驗(yàn)驗(yàn)證分別編碼d-檸檬烯合成酶，-萜品烯合成酶，-萜品烯合成酶和-蒎烯合成酶。它們相應(yīng)的蛋白質(zhì)構(gòu)成了單萜合成酶的特性。另外，在柑橘發(fā)育的初級(jí)階段mRNA在果皮中表達(dá)活躍13。研究還分離得到CitMTSL1和CitMTSL4基因的cDNA全長(zhǎng)，它們是編碼1,8-桉油素和（E）-羅勒烯的基因。研究顯示這兩種基因轉(zhuǎn)錄積累模式和1,8-桉油素、（E）-羅勒烯表達(dá)模式相一致14。在檸檬外果皮腺體中含有大量單萜物質(zhì)，通過(guò)提取發(fā)育初期果皮中的mRNA，將其反轉(zhuǎn)錄并分離，Joost等7得到四種新的TPS基因家族成員。這些基因編碼的酶以牻牛兒基二磷酸為底物合成的產(chǎn)物為兩種（+）-檸檬烯，（-）-蒎烯和-萜品烯，這些產(chǎn)物構(gòu)成了柑橘精油中常見(jiàn)的17種單萜骨架中的10種，它占到主要成分的90%以上。研究表明檀香揮發(fā)油主要成分為萜烯類(lèi)化合物，其中檀香醇等倍半萜烯類(lèi)占揮發(fā)油總量的60%-80%，通過(guò)克隆技術(shù)獲得了一個(gè)參與檀香揮發(fā)油形成的萜類(lèi)合成酶基因15。Liat等16研究倍半萜瓦倫烯合成的關(guān)鍵基因Cstps1，該基因編碼的倍半萜合成酶以法尼基二磷酸為底物催化形成單一的倍半萜產(chǎn)物瓦倫烯。對(duì)該基因分離研究發(fā)現(xiàn)，Cstps1受到果品發(fā)育的嚴(yán)格調(diào)控，它只在果實(shí)成熟時(shí)才轉(zhuǎn)錄，伴隨著瓦倫烯在果實(shí)中積累，同時(shí)該過(guò)程還受到乙烯的影響。Takuro等17克隆了柚子中非循環(huán)倍半萜合成酶（E）-法尼烯合成酶（CJFS）基因。它含有1867個(gè)核苷酸，其中1680bp編碼序列，編碼含560個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。圖一 萜烯類(lèi)物質(zhì)合成途徑摘自Tholl D. 2006. Terpene synthases and the regulation, diversity and biological roles of terpene metabolism. Curr Opin Plant Biol. 9: 1-8.2.研究方向及進(jìn)展情況2.1研究方向本課題為“柑橘發(fā)育階段萜烯類(lèi)成分的合成及其相關(guān)基因調(diào)控的研究”。主要研究柑橘香氣物質(zhì)，特別是萜烯類(lèi)物質(zhì)釋放的規(guī)律，檢測(cè)和鑒定香氣成分，克隆TPS基因家族成員并研究其表達(dá)模式，揭示在柑橘果實(shí)發(fā)育過(guò)程中萜烯類(lèi)合成較為關(guān)鍵的TPS家族成員，為提高果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)提供一定的理論基礎(chǔ)。2.2進(jìn)展情況1.對(duì)發(fā)育過(guò)程中不同階段的臍橙進(jìn)行采樣，共5個(gè)采樣點(diǎn)，所取樣品放置-80保存；2.對(duì)5個(gè)發(fā)育階段的臍橙果實(shí)進(jìn)行了電子鼻檢測(cè)分析，結(jié)果顯示電子鼻能夠?qū)悠愤M(jìn)行有效區(qū)分，并體現(xiàn)出一定的趨勢(shì)；3.從桃基因組獲取15條TPS基因序列，通過(guò)BLAST等生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)所得序列進(jìn)行分析和聚類(lèi)，初步確定關(guān)鍵基因。3.存在問(wèn)題1.電子鼻檢測(cè)結(jié)果的組內(nèi)差異過(guò)大，可能需要加大實(shí)驗(yàn)的重復(fù)數(shù)；2.從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的部分序列沒(méi)有3UTR區(qū)，需要通過(guò)克隆和RACE技術(shù)來(lái)獲得3UTR區(qū)，進(jìn)而設(shè)計(jì)Q-PCR引物以及檢測(cè)基因表達(dá)模式。4.參考依據(jù)1 陳芳,闞健全等.淺談食品風(fēng)味化學(xué)J.中國(guó)調(diào)味品, 2001(7):30-32.2 魏長(zhǎng)賓,劉勝輝等.果實(shí)香氣成分及其形成研究進(jìn)展J.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009,29(3):59-62. 3 劉濤,謝功昀.柑橘類(lèi)精油的提取及應(yīng)用現(xiàn)狀J.中國(guó)食品添加劑, 2009,1:71.4 孫曉萍,吉永知代等.花椒中萜烯類(lèi)化合物的GC/MS分析J.中國(guó)調(diào)味品, 2007,(5):61-63. 5 李瑞紅.姜花萜類(lèi)合成酶基因的克隆與功能研究. 2008.6 柴倩.橘皮精油提取、成分分析及其貯藏加工過(guò)程中的品質(zhì)變化研究. 2007.7 Joost L, Mazen K, Wilfried S, Francel W, Linus H, Harro J, Harrie A. 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