重組DNA在大腸桿菌中的誘導表達

實驗報告 題目:單元三:重組DNA在大腸桿菌中的誘導表達 指導老師:鄧慶麗 日期:2013/10/31-201311/1一實驗目的：(1) 了解和掌握IPTG誘導表達的原理和操作方法。(2) 了解降解物阻遏的現(xiàn)象及其機理。2 實驗原理：本實驗使用的是載體是已重組好的 pGFPuv ，宿主細胞為大腸桿菌，目的基因的產物為融合蛋白，目的蛋白為綠色熒光蛋白GFP，非目的蛋白即融合部分為標簽6His，用于單元四的親和層析分析。本實驗采用的啟動子為可調控的強啟動子乳糖操縱子lac。操縱子是原核基因表達的協(xié)調單位。通常由2個以上功能相關的結構基因以及一些調節(jié)序列（如啟動子序列、操縱序列等）組成。乳糖操縱子由三個結構基因Z、Y、A和操縱序列、啟動子、CAP結合位點等調節(jié)序列組成，如下圖1所示：乳糖操縱子的調節(jié)包括誘導效應和降解物阻遏效應。(1) 誘導表達當沒有乳糖存在時，調節(jié)基因lacI表達，轉錄的mRNA翻譯成阻遏蛋白。阻遏蛋白與操縱序列l(wèi)acO結合，阻礙了結合在旁邊啟動子的RNA聚合酶向前移動，使目的基因（本實驗中的綠色熒光蛋白基因GFP）不能轉錄，也就不能翻譯出蛋白質。也就是說，當沒有乳糖存在時，乳糖操縱子處于阻礙狀態(tài)，如下圖2所示：當有乳糖存在時，乳糖轉化為異乳糖，異乳糖作為誘導物與阻遏蛋白結合，使阻遏蛋白的構象發(fā)生改變，而不能結合到操縱序列上，RNA聚合酶可以從啟動子向3端移動，于是，結構基因可以轉錄出mRNA，然后翻譯出蛋白質。也就是說，當有乳糖存在時，乳糖操縱子被誘導，如下圖3所示： 乳糖操縱子的誘導物是異乳糖。IPTG是異乳糖的結構類似物。由于IPTG不會被分解，它的誘導作用是持久的。(2) 葡萄糖降解物的阻遏作用代謝物基因激活蛋白（Catabolite gene Activation Protein）CAP，又稱cAMP受體蛋白屬于激活蛋白的一種，對乳糖操縱子進行正調節(jié)。CAP分子內分別有DNA結合區(qū)和cAMP結合區(qū)。當CAP與cAMP結合后，就可結合DNA促進乳糖操縱子的轉錄。葡萄糖降解物能抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，從而降低cAMP的濃度，抑制乳糖操縱子的轉錄。本實驗使用的表達載體 pGFPuv 上含有乳糖操縱子的調節(jié)序列，目的基因表達的是帶 6His 的重組綠色熒光蛋白。在IPTG的誘導下，融合蛋白表達可增強105倍，并且可用金屬螯合親和層析分離純化，最終獲得純的重組綠色熒光蛋白。三材料與試劑：(1)材料工程菌：BL21(DE3)p32a、BL21(DE3)pGFPuv(2)試劑LB 液體培養(yǎng)基 ：蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（yeast extract）5g、NaCl 10g，加800mL雙蒸水溶解，用10M NaOH調pH至7.2-7.5，定容至1000mL。 分裝，高壓滅菌，4保存。氨芐青霉素溶液：無菌雙蒸水配成100mg/mL，分裝，-20保存，使用終濃度為50g/mL或100g/mL。IPTG溶液（100 mM）：將238.3mg IPTG溶解于10mL雙蒸水，0.22m細菌濾器過濾除菌，分裝，-20保存?zhèn)溆茫A存濃度為100 mM。20%葡萄糖溶液超聲平衡緩沖液：50mM Tris-HCl, 500mM NaCl pH7.04 實驗儀器：超凈工作臺、 低溫搖床、高速冷凍離心機、超聲破碎儀等。5 實驗步驟、現(xiàn)象、結果及分析：1.工程菌的活化(10月30號教師準備) 分別挑取工程菌BL21(DE3)p32a和BL21(DE3)pGFPuv的單菌落接種到5mlLB液體培養(yǎng)基（含氨芐，終濃度為100g/mL，以下同）晚上7點接種37、250rpm培養(yǎng)14h過夜至對數(shù)生長期第二天早上9點左右取出放入4 備用2.放大(10月31號) 往裝于500ml三角瓶中的170ml LB液體培養(yǎng)基中加入170L Amp，搖勻，取三支滅菌試管，用5ml槍各加入5ml LB液體培養(yǎng)基(含氨芐），分別編號為1#，2#，3#，剩下的裝于三角瓶中的液體培養(yǎng)基（含氨芐），編號6#， 全部按1：50的比例接種菌種，操作如下：1#接種100L BL21(DE3)p32a2#接種100L BL21(DE3)pGFPuv3#接種100L BL21(DE3)pGFPuv6#接種3mL BL21(DE3)pGFPuv下午接種于37、250rpm培養(yǎng)約2h，順便配制單元四蛋白質純化及電泳所需試劑。3.誘導1#、 2#不需處理3#加入20葡萄糖250L，至終濃度為1.0；加入25L 100mM IPTG至終濃度為0.5mM。6#加入100mM IPTG約750 L至終濃度為0.5mM。于25、250rpm培養(yǎng)過夜4.收菌 （注意采集標本并編號）（11月1號早上9點開始）從6#三角瓶培養(yǎng)的150mL菌液中取出5mL置于一支試管中（編號為4#）。(1)分別從2 # ，3#， 4#培養(yǎng)物各取100L于EP管用于電泳。（相應編號為S2,S3,S4）。 (2)將1#，2 # ，3#， 4#試管中的菌液分別收集到4個1.5mLEp離心管中(收3次），編上相應編號。 1#，2 # ，3#離心棄上清(10000rpm離心1min)； 4#第三次離心后上清液收集到另一個Ep管，編號為5#。 6#三角瓶中剩余菌液用兩管50mL離心管于8000rpm，4，離心5min，棄上清收集菌體。5.觀察及超聲破碎于紫外燈下觀察1# -5#管收集的菌體或上清液，觀察哪支管有熒光（熒光強弱），記錄觀察到的現(xiàn)象，并拍照。結果如下圖一所示：圖一：1# -5#管紫外觀察結果，從左到右依次為1# -5#管。(1)全部菌體用50ml超聲平衡緩沖液重懸（50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl pH7.0)，即每管用25ml超聲緩沖液重懸，用槍吹散，后倒入50ml燒杯中，置于裝滿碎冰的1L燒杯中，使小燒杯高出大燒杯1cm左右，便于超破時觀察菌液液面。(2)超聲波破菌，破碎之前測得OD600為0.381，三周期后測得OD600為0.134，然后用50ml離心管收集并于8000rpm，4，離心10min，取上清（棄沉淀），保存于-20冰箱，下周層析實驗備用。六.思考與討論(1) 對紫外燈下觀察到的結果作出解釋。答：圖一中從左到右依次為1# -5#管，可以看出4#管綠色熒光最強，2#次之，其余1#、3#、5#均無顏色。原因是1#管中質粒為非重組質粒p32a，不含GFP，因而無法表達產生綠色熒光蛋白，為陰性對照；2#管-4#管中大腸桿菌均含重組質粒 pGFPuv，2#管中未經誘導，綠色熒光蛋白為本底水平的表達，因而顯示出淡淡的綠色熒光；4#管中經過IPTG的誘導表達，GFP產量很高，因而顯示出很深的綠色熒光；而3#管雖然加入了IPTG進行誘導表達，但是還加入了濃度為1%的葡萄糖，導致cAMP濃度降低，從而抑制了乳糖操縱子上游的激活位點，抑制了乳糖操縱子的轉錄，因而無法產生綠色熒光；5#管為4#管最后一次離心的上清液，因菌體未破碎，因而上清液中不含GFP，因而也就無法產生綠色熒光。(2) 為什么誘導表達的大腸桿菌要在其OD600濃度約為0.5時加入IPTG？ 答：大腸桿菌要在其OD600濃度約為0.5時基本進入對數(shù)生長期，菌體生長旺盛，增殖快，對誘導表達而言，會有一個比較好的收率。若濃度較低時，菌體吸收的營養(yǎng)都用于表達外源蛋白，勢必會嚴重影響它的繁殖，菌體量少了，總的外源蛋白表達量也會變少，當在對數(shù)增長期，培養(yǎng)液中已經有足