《病毒檢驗(yàn)技術(shù)》PPT課件.ppt

第十七章 病毒檢驗(yàn)技術(shù),本 章 內(nèi) 容,學(xué)習(xí)目標(biāo)及重點(diǎn),學(xué)習(xí)目標(biāo)： 掌握病毒標(biāo)本采集和送檢應(yīng)遵循的原則；病毒檢驗(yàn)鑒定常用技術(shù) 熟悉病毒血清學(xué)診斷常用的方法 了解病毒感染的實(shí)驗(yàn)室快速診斷 學(xué)會(huì)病毒的培養(yǎng)基本操作 本章重點(diǎn)： 病毒標(biāo)本采集和運(yùn)送原則。 病毒學(xué)診斷及鑒定常用方法。 病毒培養(yǎng)的基本操作。,病毒學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)是用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法對(duì)臨床和流行病學(xué)現(xiàn)場(chǎng)送檢的標(biāo)本（如人或宿主的血液、組織、尿、糞便和組織液等）進(jìn)行病毒學(xué)的定性和定量分析，為病毒感染和病毒性疾病的診斷、治療和預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。 檢驗(yàn)程序包括標(biāo)本的采集、分離培養(yǎng)鑒定、快速診斷。,第一節(jié) 標(biāo)本的采集、處理與運(yùn)送,一、標(biāo)本的采集與處理 1. 采集時(shí)間：發(fā)病早期或急性期盡快采集。 很多急性病毒感染，癥狀出現(xiàn)前病毒已經(jīng)開(kāi)始釋放，癥狀初期病毒量即迅速達(dá)到峰值，之后平緩下降至疾病痊愈，不過(guò)也有例外。,第一節(jié) 標(biāo)本的采集、處理與運(yùn)送,一、標(biāo)本的采集與處理 2.采集部位：取決于臨床癥狀和所懷疑感染的病毒。 從病原體入侵部位取材 從病原體感染的靶器官取材 根據(jù)病原體的排泄途徑取材 從環(huán)境中采集標(biāo)本 如：流感病毒感染-鼻咽拭子 乙型腦炎病毒感染-腦脊液 輪狀病毒感染-糞便 乙型肝炎病毒感染-血液,第一節(jié) 標(biāo)本的采集、處理與運(yùn)送,一、標(biāo)本的采集與處理 3.采集方法與處理 提高病毒的分離率，防止標(biāo)本污染。,采集時(shí)無(wú)菌操作,可加入抗生素以殺死雜菌,二、標(biāo)本的運(yùn)送與保存 1.標(biāo)本的運(yùn)送 盡快送檢 冷凍、冷藏運(yùn)輸 防漏、專(zhuān)人、標(biāo)記 2.標(biāo)本的保存 -70可較長(zhǎng)時(shí)間保存 可加入甘油或二甲基亞砜（DMSO）、Hanks液或小牛血清等以防病毒失活,第一節(jié) 標(biāo)本的采集、處理與運(yùn)送,不同的病毒分離時(shí)采用不同的分離方法,這主要取決于目的病毒的生物學(xué)特性。 主要有細(xì)胞培養(yǎng)法、雞胚培養(yǎng)法、動(dòng)物接種法等,而對(duì)細(xì)胞、雞胚不敏感,又沒(méi)有合適動(dòng)物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。,第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,一、 病毒的分離培養(yǎng) 2.雞胚培養(yǎng),第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,原代細(xì)胞培養(yǎng) 二倍體細(xì)胞培養(yǎng) 傳代細(xì)胞,羊膜腔接種 尿囊腔接種 卵黃囊接種 絨毛尿囊膜接種,組織細(xì)胞培養(yǎng),雞胚培養(yǎng),動(dòng)物接種,是將離體活組織塊或分散的組織細(xì)胞加以培養(yǎng)的技術(shù)總稱(chēng)，為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。,（一）組織細(xì)胞培養(yǎng),雞成纖維細(xì)胞,Hep-2細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)瓶,Vero細(xì)胞,第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,1.原代細(xì)胞 原代細(xì)胞是指從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞。原代細(xì)胞的培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說(shuō)是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。 2.二倍體細(xì)胞 是指原代細(xì)胞在體外分裂50代以后仍能保持其二倍染色體數(shù)目。二倍體細(xì)胞株來(lái)源于正常人胎兒組織，主要用于培養(yǎng)病毒制備疫苗等。,3.傳代細(xì)胞 傳代細(xì)胞來(lái)源于腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞株傳代過(guò)程中變異的細(xì)胞稱(chēng)為傳代細(xì)胞，它們能在體外無(wú)限期地傳代。大多是腫瘤細(xì)胞或突變的二倍體細(xì)胞。 常用的傳代細(xì)胞株有Hela細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞），Hep-2（人喉上皮癌細(xì)胞）、Vero（非洲綠猴腎細(xì)胞）等。,15,2.雞胚培養(yǎng),第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,雞胚培養(yǎng)法是用來(lái)培養(yǎng)某些對(duì)雞胚敏感的動(dòng)物病毒的一種培養(yǎng)方法，此方法可用以進(jìn)行多種病毒的分離、培養(yǎng)，毒力的滴定，中和試驗(yàn)以及抗原和疫苗的制備等。,16,一般選用914d的雞胚,來(lái)源充足、 組織分化程度低、 本身很少攜帶病毒和細(xì)菌、 對(duì)接種病毒不產(chǎn)生抗體及 病毒較易增殖等,2.雞胚培養(yǎng),優(yōu)點(diǎn)：,第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,選擇不同的接種部位是病毒分離成功的關(guān)鍵 常用的主要有： 尿囊腔接種、羊膜腔接種、卵黃囊接種、絨毛尿囊膜接種,2.雞胚培養(yǎng),第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,不同病毒在雞胚的不同部位的生長(zhǎng)特性差異很大,2.雞胚培養(yǎng),尿囊腔接種,羊膜腔接種,尿 囊 腔,羊 膜 腔,常用接種途徑： 尿囊腔接種、羊膜腔接種、卵黃囊接種、絨毛尿囊膜接種,常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒 和新城疫病毒的適應(yīng)和傳代培養(yǎng),常用于臨床流感病毒初次分離,第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,卵黃囊接種,絨毛尿囊膜接種,卵 黃 囊,絨毛尿囊膜,人工氣室,2.雞胚培養(yǎng),主要用于蟲(chóng)媒病毒、衣原體及立克次體的分離和繁殖。,常用于牛痘病毒、天花病毒、單純皰疹病毒的分離,卵 黃 囊,第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,3.動(dòng)物接種,常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和雞等 常用的接種途徑包括皮下、皮內(nèi)、腹腔、靜脈、角膜、鼻腔及腦內(nèi)接種等方式,第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,二、病毒增殖的觀察 （一）病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的鑒定指標(biāo) 1細(xì)胞形態(tài)的改變 2紅細(xì)胞吸附 3細(xì)胞培養(yǎng)液pH值改變 （二）病毒數(shù)量及病毒感染性測(cè)定 1血凝試驗(yàn) 2中和試驗(yàn) 3空斑形成試驗(yàn) 4半數(shù)感染量（ID50）和組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）,第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,二、病毒增殖的觀察 （一）病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的鑒定指標(biāo) 1細(xì)胞形態(tài)的改變 （1） 細(xì)胞病變效應(yīng)（cytophathic effect，CPE）,第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,正常細(xì)胞 病變細(xì)胞,是指某些病毒特別是無(wú)包膜的病毒感染組織細(xì)胞后，正常生長(zhǎng)的梭形細(xì)胞變圓、變性、壞死、溶解及從培養(yǎng)瓶壁脫落，細(xì)胞堆積形成葡萄狀,第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,（2）多核巨細(xì)胞,1細(xì)胞形態(tài)的改變,多見(jiàn)于有包膜的病毒，如呼吸道合胞病毒、麻疹病毒等，由感染細(xì)胞融合而成多核巨細(xì)胞,第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,（3）包涵體,1細(xì)胞形態(tài)的改變,某些病毒感染宿主細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)一種光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，多為圓形、卵圓形或不定形。一般是由完整的病毒顆?；蛏形囱b配的病毒亞基聚集而成，稱(chēng)為包涵體。,第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,2紅細(xì)胞吸附 有些病毒感染細(xì)胞后,細(xì)胞膜上可鑲嵌著病毒基因編碼產(chǎn)生的糖蛋白,其中有些能吸附特定種類(lèi)的紅細(xì)胞,或?qū)⒓?xì)胞培養(yǎng)單層刮下后,經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理,可以凝集特定種類(lèi)的紅細(xì)胞,此類(lèi)糖蛋白在細(xì)胞表面形成刺突,稱(chēng)為血凝素。 3細(xì)胞培養(yǎng)液pH值改變,二、病毒增殖的觀察,病毒感染細(xì)胞后，可使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化，導(dǎo)致培養(yǎng)液pH值改變。,第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,（二）病毒數(shù)量及病毒感染性測(cè)定,二、病毒增殖的觀察,1血凝試驗(yàn),病毒顆粒,紅細(xì)胞,某些病毒（如流感病毒）表面的血凝素（HA）能引起人或某些哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，將這類(lèi)病毒感染細(xì)胞后收集的病毒液作不同稀釋?zhuān)园l(fā)生血凝反應(yīng)的病毒液的最高稀釋度作為該病毒的血凝效價(jià)（即滴度），可對(duì)病毒含量進(jìn)行半定量測(cè)定。,血凝現(xiàn)象,第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,能使紅細(xì)胞完全凝集的病毒的最高稀釋倍數(shù)為該病毒的血凝效價(jià)，此效價(jià)為1個(gè)血凝單位（HAU）,第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,病毒液中若先加入病毒的特異性抗體，抗體與病毒表面的抗原特異性結(jié)合，從而抑制病毒與紅細(xì)胞的血凝現(xiàn)象，稱(chēng)為血凝抑制試驗(yàn)。,第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,2中和試驗(yàn)（Nt） 在體外孵育病毒與特異性抗體的混合物，使病毒與抗體相互反應(yīng)，再將混合物接種到敏感的宿主體內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后觀察CPE或紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象是否消失，即特異性抗體是否中和相應(yīng)病毒，從而測(cè)定殘存的病毒感染力的一種方法,3空斑形成試驗(yàn),第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,是一種檢查和準(zhǔn)確測(cè)定病毒滴度的方法。 將稀釋的病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。病毒吸附后，再覆蓋一層融化的半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂，使病毒在單層細(xì)胞培養(yǎng)中有限擴(kuò)散。 結(jié)果是每一個(gè)有感染性的病毒在單層細(xì)胞中可產(chǎn)生一個(gè)局限性的感染灶。用活性染料 (如中性紅) 染色，則活細(xì)胞著色，受病毒感染而破壞的細(xì)胞不著色，形成肉眼可見(jiàn)的空斑/蝕斑(plaque)。 每個(gè)蝕斑是由一個(gè)感染性病毒顆粒形成的，稱(chēng)作空斑形成單位 (plaque forming unit, PFU)。 病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用PFUml表示。,4半數(shù)感染量（ID50）和組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）,測(cè)定病毒感染雞胚、動(dòng)物或細(xì)胞后，引起50%死亡或病變的最小量。用來(lái)估計(jì)病毒感染的強(qiáng)弱程度，但不能準(zhǔn)確測(cè)定感染性病毒顆粒的多少,第二節(jié) 病毒的分離與鑒定,第三節(jié) 病毒學(xué)檢測(cè)及診斷,一、形態(tài)學(xué)檢查及診斷 1. 光學(xué)顯微鏡檢查： *直接觀察到較大的病毒體（如痘病毒） *包涵體 狂犬病毒感染-嗜酸性包涵體 巨細(xì)胞病毒感染-“貓頭鷹眼”狀的嗜酸性包涵體,2. 電子顯微鏡檢查： *透射電子顯微鏡 用于觀察病毒的大小、形態(tài)與結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)等 *掃描電子顯微鏡： 用于觀察病毒和細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)和附屬結(jié)構(gòu)等,一、形態(tài)學(xué)檢查及診斷,掃描電子顯微鏡,第三節(jié) 病毒學(xué)檢測(cè)及診斷,第三節(jié) 病毒學(xué)檢測(cè)及診斷,（1）標(biāo)本制備,超濾法 超速離心法 接種細(xì)胞快速增殖法 免疫凝集法,（2）常用觀察方法 負(fù)染色法 超薄切片法 免疫電鏡法,病毒顆粒具有亮度，在周?chē)^暗的背景上顯示亮點(diǎn),過(guò)程與病理切片過(guò)程相似,免疫組織化學(xué)與電鏡技術(shù)的結(jié)合,透射電子顯微鏡,第三節(jié) 病毒學(xué)檢測(cè)及診斷,二、血清學(xué)檢測(cè)及診斷 原理：用已知的病毒抗原檢測(cè)患者血清中的抗體水平或 用已知的病毒抗體直接檢測(cè)標(biāo)本中的病毒抗原 1.病毒抗原的檢測(cè)：用熒光素、酶或膠體金等標(biāo)記物標(biāo)記病毒抗體檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)病毒抗原。如ELISA檢測(cè)HBsAg,第三節(jié) 病毒學(xué)檢測(cè)及診斷,2.病毒抗體的檢測(cè)：已知病毒抗原多數(shù)為通過(guò)基因工程技術(shù)制備的重組抗原，其次是從患者標(biāo)本中分離純化的抗