DB33T556-2005乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附法.doc

DB33/T 2005浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布2005-07-15實(shí)施2005-07-01發(fā)布乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的測(cè)定 酶聯(lián)免疫吸附法Determination of aflatoxin M1 in milk and milk powder-Enzyme-linked immunosorbent assayDB33/T 5562005DB33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)ICS 67.040C 53備案號(hào)：1DB33/T 5562005前 言本標(biāo)準(zhǔn)由杭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局、杭州市農(nóng)業(yè)局共同提出。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由杭州市農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)站負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：胡學(xué)肖、楊華、袁謙、吳玲玲、李容、姚建紅。I引 言黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1在動(dòng)物體內(nèi)的羥基化代謝產(chǎn)物，具有劇毒性和致癌性。目前我國(guó)有關(guān)黃曲霉毒素M1的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法有薄層色譜法、高效液相色譜法和熒光光度法等，本方法是用于定性和半定量的快速測(cè)定法，適合快速檢測(cè)和批量樣品的篩選。II乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的測(cè)定 酶聯(lián)免疫吸附法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于生鮮乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳、乳粉等乳品中黃曲霉毒素M1的測(cè)定。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3 原理標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品試液加入各自板孔，游離的黃曲霉毒素M1與微孔中包被的黃曲霉毒素M1抗體結(jié)合，沒(méi)有結(jié)合的物質(zhì)在洗滌中被清除。再加入黃曲霉毒素M1酶標(biāo)記物，將沒(méi)有結(jié)合的抗體位點(diǎn)全部覆蓋，結(jié)合的酶標(biāo)記物通過(guò)顯色液顯示出來(lái)。最后加入終止液，用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定吸光度值，吸光度值與樣品中的黃曲霉毒素M1含量成反比。4 試劑和溶液4.1 本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為去離子水。4.2 黃曲霉毒素M1試劑盒注：不同品牌的黃曲霉毒素M1試劑盒其操作步驟可能有所不同，溶液配制和測(cè)試程序等可根據(jù)其試劑盒使用說(shuō)明書(shū)略作調(diào)整。：最低檢出限不大于0.02g/kg。4.2.1 微孔板。4.2.2 黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度范圍00.10g/kg。4.2.3 酶標(biāo)記物濃縮液。4.2.4 酶標(biāo)記物稀釋用緩沖液。4.2.5 顯色劑。4.2.6 檸檬酸緩沖液。4.2.7 終止液。4.2.8 樣品稀釋緩沖液。4.2.9 洗板濃縮液。4.3 酶標(biāo)記物工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算用量，用酶標(biāo)記物稀釋用緩沖液（4.1.4）將其濃縮液（4.1.3）以1：100稀釋，切勿渦旋混合，配制后放回試劑盒放置4h以上，備用。4.4 顯色反應(yīng)液：顯色劑（4.1.5）用檸檬酸緩沖液（4.1.6）以1：10稀釋，在使用前配制，避光保存。4.5 洗板工作液：洗板濃縮液（4.1.9）用水以1：20稀釋，備用。4.6 0.36mol/L亞鐵氰化鉀溶液：稱取15.2g K4Fe(CN)63H2O，用水溶解、定容至100mL。4.7 1.04mol/L硫酸鋅溶液：稱取29.9g ZnSO47H2O,用水溶解、定容至100mL。5 儀器和設(shè)備5.1 微孔板酶標(biāo)儀（帶450nm濾光片）。5.2 天平：最小感量0.01g。5.3 冷凍離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速不小于3000rpm。5.4 旋渦混合器。5.5 連續(xù)可調(diào)移液器及配套吸頭：5L50L、20L200L、200L1000L。5.6 脫脂棉簽。5.7 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)玻璃器皿。6 分析步驟6.1 樣品前處理6.1.1 生鮮乳、巴氏殺菌乳、滅菌乳以下簡(jiǎn)稱液態(tài)乳：將待測(cè)樣品搖勻，平行稱取兩份5.0g試樣（精確到0.1g）到10mL離心管中，2 oC8 oC 以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，用脫脂棉簽除去上層脂肪。加入150L亞鐵氰化鉀溶液（4.5），短暫渦旋混合后加入150L硫酸鋅溶液（4.6），渦旋振蕩3min。10oC15 oC 以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，上清液供測(cè)試用。6.1.2 乳粉：平行稱取兩份10.0g待測(cè)乳粉（精確到0.1g）到各自小燒杯中，加水溶解，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，定容至刻度。以下步驟同6.1.1。6.2 測(cè)試程序6.2.1 以下操作均須在20 oC25 oC溫度下進(jìn)行。6.2.2 取出試劑盒，放置1h以上，使其溫度恢復(fù)到20 oC25 oC。將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，并記錄標(biāo)準(zhǔn)和樣品對(duì)應(yīng)的位置。6.2.3 加100L標(biāo)準(zhǔn)溶液（4.1.2）和已處理好的樣品試液到各自微孔中，孵育60min。6.2.4 倒除微孔中的液體，注入洗板工作液（4.4）約300L，重復(fù)洗滌5次，最后在吸水紙上輕輕拍干。6.2.5 在所有微孔中加入100L酶標(biāo)記物工作液（4.2），孵育20min。6.2.6 重復(fù)6.2.3步驟。6.2.7 在所有微孔中加入100L顯色反應(yīng)液（4.3），孵育30min。6.2.8 在所有微孔中加入50L終止液（4.1.7），混勻后60min內(nèi)在450nm處測(cè)定吸光度值。7 分析結(jié)果計(jì)算和表述7.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值（C）為橫坐標(biāo)，相對(duì)吸光度值（B/B0）為縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。相對(duì)吸光度值（%）= B/B0 100 - (1)式中： B 標(biāo)準(zhǔn)（或樣品）的吸光度值；B0 空白（濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)溶液）的吸光度值。7.2 結(jié)果計(jì)算7.2.1 液態(tài)乳中黃曲霉毒素M1的含量按式（2）計(jì)算：X1 = k1Cx - (2)式中：X1 液態(tài)乳中黃曲霉毒素M1的含量，g/kg； k1 液態(tài)乳在前處理過(guò)程中的稀釋倍數(shù)。 Cx 由測(cè)試用上清液的相對(duì)吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的黃曲霉毒素M1的濃度，ng/mL；7.2.2 乳粉中黃曲霉毒素M1的含量按式（3）計(jì)算：X2 = k2CyV/m - (3)式中：X2 乳粉中黃曲霉毒素M1的含量，g/kg； k2 乳粉定容后分取液在前處理過(guò)程中的稀釋倍數(shù)。 Cy 由測(cè)試用上清液的相對(duì)吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的黃曲霉毒素M1的濃度，ng/mL； m 乳粉稱樣量，g； V 乳粉定容體積，mL。計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后兩位。8 檢出限與允許差8.1 檢出限 液態(tài)乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的檢出限分別為0.02g/kg和0.20g/kg。8.2允許差每個(gè)試樣稱取兩份進(jìn)行平行測(cè)定，以其算術(shù)平均值為分析結(jié)果。其分析結(jié)果的相對(duì)偏差應(yīng)不大于15%。9