DB51T658-2007豬肉中己烯雌酚殘留檢測方法-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS-MS）法.doc

NY DB四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布2007-05-01實施2007-03-17發(fā)布豬肉中己烯雌酚殘留檢測方法高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS-MS）法Determination of diethylstilbestrol residues in muscle of pigby high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometryDB51/T 6582007四川省地方標(biāo)準(zhǔn)ICS：65.020.30備案號：1DB51/T 6582007目 次前 言II1 范圍12 規(guī)范性引用文件13 制樣13.1 樣品的制備13.2 樣品的保存14 測定方法14.1 方法提要或原理14.2 試劑和材料14.3 儀器和設(shè)備24.4 測定步驟24.5 結(jié)果計算和表述35 檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度45.1 靈敏度45.2 準(zhǔn)確度45.3 精密度4附錄A （資料性附錄） 己烯雌酚特征離子質(zhì)量色譜圖、特征離子質(zhì)譜圖5I前 言本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.12000 標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則進(jìn)行編制本標(biāo)準(zhǔn)附錄是資料性附錄本標(biāo)準(zhǔn)由四川省畜牧食品局提出并歸口本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：四川省獸藥殘留監(jiān)控中心、四川省獸藥監(jiān)察所本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：謝青、彭莉、岳秀英、熊浩山、官艷麗、王海波、吳曉嵐豬肉中己烯雌酚殘留檢測方法高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS-MS）法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬肉中已烯雌酚殘留檢測的制樣和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS-MS）測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬肉中己烯雌酚的殘留量測定。檢出限為0.5g/kg。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 1.1-2000 標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則 (ISO/IEC Directives, Part 3, 1997, Rules for the structure and drafting of International Standards, NEQ)GB/T 6682-1992 分析實驗室用水規(guī)則和試驗方法農(nóng)牧發(fā)20031號 獸藥殘留試驗技術(shù)規(guī)范（試行）3 制樣3.1 樣品的制備 取適量新鮮或冷凍的空白或供試豬肉組織，絞碎并使之均勻，密封。3.2 樣品的保存-20以下冰箱中貯存?zhèn)溆谩? 測定方法4.1 方法提要或原理豬肉中的己烯雌酚用叔丁基甲基醚提取，正己烷脫脂，Oasis HLB固相萃取柱凈化，氮氣吹干。用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，外標(biāo)法定量。 4.2 試劑和材料以下所用的試劑，除特別注明者外均為分析純試劑；水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。 4.2.1 己烯雌酚（DES） 含己烯雌酚(C18H20O2)不得少于99%4.2.2 叔丁基甲基醚 色譜純4.2.3 乙腈 色譜純4.2.4 甲醇 色譜純4.2.5 正己烷4.2.6 氨水4.2.7 己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液 取己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品約10mg，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置-20保存，保存期不超過1年。4.2.8 己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確量取己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液適量，用乙腈稀釋成濃度為200ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置4冰箱中保存，保存期不超過1個月。4.2.9 Waters OasisTM HLB 固相萃取柱或相當(dāng)者 500mg，6mL。臨用前分別用3mL叔丁基甲基醚、3mL甲醇和3mL水預(yù)處理，保持柱體濕潤。 4.3 儀器和設(shè)備4.3.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀或相當(dāng)者（配電噴霧離子源）4.3.2 天平 感量0.01g4.3.3 分析天平 感量0.00001g4.3.4 漩渦混合儀4.3.5 振蕩器4.3.6 組織勻漿機(jī)4.3.7 冷凍離心機(jī)4.3.8 固相萃取裝置4.3.9 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 4.3.10 氮吹儀4.3.11 微孔濾膜 0.22m 4.3.12 離心管 20mL 、50mL4.4 測定步驟4.4.1 試料的制備試料的制備包括： 取絞碎后的供試樣品,作為供試試料。 取絞碎后的空白樣品,作為空白試料。 取絞碎后空白樣品,添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試料。4.4.2 提取取10000r/min勻漿1min的試料（50.05）g，置50mL離心管中，加叔丁基甲基醚15mL，渦旋1min，振蕩10min，在-4以6000r/min離心10min，將上層清夜移至雞心瓶中。再加叔丁基甲基醚15mL同法操作，合并兩次上清液，于45水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。4.4.3 凈化加80%乙腈溶液2mL于雞心瓶中，旋渦溶解殘留物，然后將其轉(zhuǎn)移至10mL離心管中。加正己烷5mL于雞心瓶中洗滌一并轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，震蕩混合1min，在15以6000 r/min離心10min，棄去上清液。再加正己烷5mL于離心管中同法操作，留下層備用。取上述凈化后的下層溶液，以每34秒1滴的流速通過預(yù)處理后的HLB固相萃取柱，先用甲醇：水（3+7）溶液3mL沖洗，然后加水3mL平衡，再用甲醇:2%氨水(1+9)溶液3mL沖洗，棄去洗液，抽干。用甲醇:叔丁基甲基醚(1+9)溶液7mL洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干，用80%乙腈1mL溶解殘余物，充分渦旋，用0.22m濾膜過濾，濾液供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。4.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈稀釋制得濃度為0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。4.4.5 測定4.4.5.1 液相色譜條件色譜儀：Waters_2695高效液相色譜儀或相當(dāng)者色譜柱：symmetryTM C18 (2.1mm150mm，5m) 或相當(dāng)者柱溫：30流速：0.2mL/min進(jìn)樣量：20L運行時間：15min流動相：A：乙腈，B，水GradienTableTime(min) Flow Rate(mL/min) A(%) B(%) Curve Initial 0.2 40 60 1 4 0.2 95 5 6 8 0.2 95 5 6 15 0.2 40 60 14.4.5.2 質(zhì)譜條件質(zhì)譜儀：Waters Quattro Premier XE或相當(dāng)者電離模式：ESI-掃描方式：負(fù)離子掃描檢測方式：多反應(yīng)檢測電離電壓：2.8KV源溫：110霧化溫度：350。錐孔氣流速：50L/h；霧化氣流速：450L/h；數(shù)據(jù)采集窗口：15min駐留時間：0.2sec定性、定量離子及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞電壓見表1。表1 己烯雌酚定性、定量離子對和錐孔電壓及碰撞電壓藥物定性離子對(m/z)定量離子對(m/z)錐孔電壓(V)碰撞電壓(eV)己烯雌酚（DES）267.1/251267.1/2222830267.1/222354.4.5.3 測定法取試樣溶液和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作單點或多點校準(zhǔn)，按外標(biāo)法以峰面積計算，即得。對照溶液及試樣溶液中己烯雌酚的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流和選擇離子流圖分別見附錄A中圖A.1。4.4.6 空白試驗除不加試料外，采用完全相同的測定步驟進(jìn)行平行操作。4.5 結(jié)果計算和表述按下式計算試樣中己烯雌酚的殘留量：ACsVX= As m式中: X 試樣中己烯雌酚的殘留量(ng/g)；A 試樣溶液中己烯雌酚的峰面積；AS 標(biāo)準(zhǔn)溶液中己烯雌酚的峰面積；cs 標(biāo)準(zhǔn)溶液中己烯雌酚的濃度(ng/mL)；V 溶解殘余物的體積(mL)；m 供試試樣的質(zhì)量(g)。注：計算結(jié)果需扣除空白值，測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留3位有效數(shù)字。5 檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度5.1 靈敏度本方法在豬肉中的檢測限為0.05g/kg，最低