GB5009.204-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中丙烯酰胺的測定.pdf

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) GB 5009.2042014 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙烯酰胺的測定 2014-12-01 發(fā)布 2015-05-01 實施 GB 5009.2042014 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB/T 5009.2042005 食品中丙烯酰胺含量的測定方法氣相色譜一質(zhì)譜（GC-MS）法 。 本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 5009.2042005相比，主要變化如下： 增加第一法 穩(wěn)定性同位素稀釋的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法； 氣相色譜-質(zhì)譜法將外標(biāo)法改為穩(wěn)定性同位素稀釋法。GB 5009.2042014 1 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙烯酰胺的測定 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中丙烯酰胺的測定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于熱加工（如煎、炙烤、焙烤等）食品中丙烯酰胺的測定。 第一法 穩(wěn)定性同位素稀釋的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法 2 原理 本標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù)，在試樣中加入13C3標(biāo)記的丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)溶液，以水為提取溶劑，經(jīng)過固相萃取柱或基質(zhì)固相分散萃取凈化后，以液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜的多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)或選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)進行檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。 3 試劑和材料 注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。 3.1 試劑 3.1.1 甲酸 (HCOOH)：色譜純。 3.1.2 甲醇 (CH3OH)：色譜純。 3.1.3 正己烷 (n-C6H14)：分析純，重蒸后使用。 3.1.4 乙酸乙酯 (CH3COOC2H5)：分析純，重蒸后使用。 3.1.5 無水硫酸鈉 (Na2SO4) ：400 ，烘烤 4 h。 3.1.6 硫酸銨 (NH4)2SO4。 3.1.7 硅藻土：ExtrelutTM 20 或相當(dāng)產(chǎn)品。 3.2 標(biāo)準(zhǔn)品 3.2.1 丙烯酰胺 (CH2=CHCONH2) 標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%） 。 3.2.2 13C3-丙烯酰胺（13CH2=13CH13CONH2）標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%） 。 3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 3.3.1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 3.3.1.1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1000 mg/L）：準(zhǔn)確稱取丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容，使丙烯酰胺濃度為 1000 mg/L，置20 冰箱中保存。 3.3.1.2 丙烯酰胺中間溶液 （100 mg/L） ： 移取丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液 1 mL， 加甲醇稀釋至 10 mL， 使丙烯酰胺濃度為 100 mg/L，置20 冰箱中保存。 3.3.1.3 丙烯酰胺工作溶液（10 mg/L）：移取丙烯酰胺中間溶液 1 mL，用 0.1% 甲酸溶液稀釋至GB 5009.2042014 2 10 mL，使丙烯酰胺濃度為 10 mg/L。臨用時配制。 3.3.1.4 丙烯酰胺工作溶液（1 mg/L）：移取丙烯酰胺工作溶液1 mL，用 0.1%甲酸溶液稀釋至10 mL,，使丙烯酰胺濃度為 1 mg/L。臨用時配制。 3.3.2 13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)溶液 3.3.2.1 13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)儲備溶液（1000 mg/L）：準(zhǔn)確稱取13C3-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容，使13C3-丙烯酰胺濃度為 1 000 mg/L，置20 冰箱保存。 3.3.2.2 內(nèi)標(biāo)工作溶液（10 mg/L） ：移取內(nèi)標(biāo)儲備溶液 1 mL，用甲醇稀釋至 100 mL，使13C3-丙烯酰胺濃度為 10 mg/L，置20 冰箱保存。 3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液 取 6 個 10 mL 容量瓶，分別移取 0.1 mL、0.5 mL、1 mL 丙烯酰胺工作溶液 II （1 mg/L） 和 0.5 mL、1 mL 和 3 mL 丙烯酰胺工作溶液 I（10 mg/L）與內(nèi)標(biāo)工作溶液（10 mg/L）0.1 mL，用 0.1%甲酸溶液稀釋至刻度。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中丙烯酰胺的濃度分別為 10 g/L、50 g/L、100 g/L、500 g/L、1000 g/L、3000 g/L，內(nèi)標(biāo)濃度為 100 g/L。臨用時配制。 4 儀器和設(shè)備 4.1 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS）。 4.2 HLB 固相萃取柱：6 mL、200 mg，或相當(dāng)產(chǎn)品。 4.3 Bond Elut-Accucat固相萃取柱：3 mL、200 mg，或相當(dāng)產(chǎn)品。 4.4 組織粉碎機。 4.5 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。 4.6 氮氣濃縮器。 4.7 振蕩器。 4.8 玻璃層析柱：柱長 30 cm，柱內(nèi)徑 1.8 cm。 4.9 渦旋混合器。 4.10 超純水裝置。 4.11 分析天平：感量為 0.1 mg。 4.12 離心機：轉(zhuǎn)速10000 r/m。 5 分析步驟 5.1 試樣制備 5.1.1 樣品提取 取 50 g 試樣，經(jīng)粉碎機粉碎，20冷凍保存。準(zhǔn)確稱取試樣 1 g2 g（精確到 0.001 g） ，加入 10 mg/L 13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)工作溶液 10 L（或 20 L） ，相當(dāng)于 100 ng（或 200 ng）的13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)，再加入超純水 10 mL，振搖 30 min 后，于 4000 r/m 離心 10 min，取上清液待凈化。 5.1.2 樣品凈化 注：任選下列一種方法進行凈化。 5.1.2.1 基質(zhì)固相分散萃取方法（選擇 1） ：在試樣提取的上清液中加入硫酸銨 15 g，振蕩 10 min，使其充分溶解，于 4000 r/m 離心 10 min，取上清液 10 mL，備用。如上清液不足 10 mL，則用飽和硫酸銨補足。取潔凈玻璃層析柱，在底部填少許玻璃棉并壓緊，依次填裝 10 g 無水硫酸鈉、2 g 硅藻土。稱取5 g 硅藻土 ExtrelutTM 20 與上述試樣上清液攪拌均勻后，裝入層析柱中。用 70 mL 正己烷淋洗，控制流GB 5009.2042014 3 速為 2 mL/min，棄去正己烷淋洗液。用 70 mL 乙酸乙酯洗脫丙烯酰胺，控制流速為 2 mL/min，收集乙酸乙酯洗脫溶液， 并在 45 水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干， 用乙酸乙酯洗滌蒸發(fā)瓶殘渣三次 （每次 1 mL） ，并將其轉(zhuǎn)移至已加入 1 mL 0.1%甲酸溶液的試管中， 渦旋振蕩。 在氮氣流下吹去上層有機相后， 加入 1 mL正己烷，渦旋振蕩，于 3500 r/m 離心 5 min，取下層水相經(jīng) 0.22 m 水相濾膜過濾，待 LC-MS/MS 測定。 5.1.2.2 固相萃取柱凈化（選擇 2）：在試樣提取的上清液中加入 5 mL 正己烷，振蕩萃取 10 min，于10000 r/m 離心 5 min，除去有機相，再用 5 mL 正己烷重復(fù)萃取一次，迅速取水相 6 mL 經(jīng) 0.45 m 水相濾膜過濾， 待進行 HLB 固相萃取柱凈化處理。 HLB 固相萃取柱使用前依次用 3 mL 甲醇、 3 mL 水活化。取上述濾液 5 mL 上 HLB 固相萃取柱，收集流出液，并用 4 mL 80%的甲醇水溶液洗脫，收集全部洗脫液，并與流出液合并待進行 Bond Elut-Accucat 固相萃取柱凈化；Bond Elut-Accucat 固相萃取柱依次用 3 mL 甲醇、3mL 水活化后，將 HLB 固相萃取柱凈化的全部洗脫液上樣，在重力作用下流出，收集全部流出液，在氮氣流下將流出液濃縮至近干，用 0.1%甲酸溶液定容至 1.0 mL，待 LC-MS/MS 測定。 5.2 儀器參考條件 5.2.1 色譜條件 色譜柱為Atlantis C18柱（5 m、2.1 mm I.D. 150 mm）或等效柱。 預(yù)柱：C18保護柱（5 m、2.1 mm I.D. 30 mm）或等效柱。 流動相：甲醇/0.1%甲酸（10：90，體積分?jǐn)?shù)）。 流速：0.2 mL/min 。 進樣體積：25 L。 柱溫：26 。 5.2.2 質(zhì)譜參數(shù) 5.2.2.1 三重四極串聯(lián)質(zhì)譜儀 檢測方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM） 。 電離方式：陽離子電噴霧電離源（ESI+） 。 毛細管電壓：3 500 V。 錐孔電壓：40 V。 射頻透鏡 1 電壓： 30.8 V。 離子源溫度：80 。 脫溶劑氣溫度：300 。 離子碰撞能量：6 eV。 丙烯酰胺：母離子 m/z 72、子離子 m/z 55、子離子 m/z 44。 13C3丙烯酰胺：母離子 m/z 75、子離子 m/z 58、子離子 m/z 45。 定量離子：丙烯酰胺為 m/z 55，13C3丙烯酰胺為 m/z 58。 5.2.2.2 離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀 檢測方式：選擇反應(yīng)離子監(jiān)測（SRM） 。 電離方式：陽離子電噴霧電離源（ESI+） 。 噴霧電壓：5 000 V。 加熱毛細管溫度：300 。 鞘氣：N2，40 Arb。 輔助氣：N2，20 Arb。 碰撞誘導(dǎo)解離（CID） ：10 V。 碰撞能量：40 V。 GB 5009.2042014 4 丙烯酰胺：母離子 m/z 72、子離子 m/z 55、子離子 m/z 44。 13C3丙烯酰胺：母離子 m/z 75、子離子 m/z 58、子離子 m/z 45。 定量離子：丙烯酰胺為 m/z 55，13C3丙烯酰胺為 m/z 58。 5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜系統(tǒng)，測定相應(yīng)的丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)的峰面積，以各標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的丙烯酰胺進樣濃度（g/L）為橫坐標(biāo)，以丙烯酰胺（m/z 55）和13C3 丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)(m/z 58)的峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 5.4 試樣溶液的測定 將試樣溶液注入液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜系統(tǒng)中，測得丙烯酰胺（m/z 55）和13C3丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)(m/z 58)的峰面積比，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中丙烯酰胺進樣濃度（g/L），平行測定次數(shù)不少于兩次。 5.5 質(zhì)譜分析 分別將試樣和標(biāo)準(zhǔn)系列工作液注入液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀中，記錄總離子流圖和質(zhì)譜圖（見附錄 A中圖 A.1圖 A.2）及丙烯酰胺和內(nèi)標(biāo)的峰面積，以保留時間及碎片離子的豐度定性，要求所檢測的丙烯酰胺色譜峰信噪比(S/N)大于 3， 被測試樣中目標(biāo)化合物的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物的保留時間一致， 同時被測試樣中目標(biāo)化合物的相應(yīng)監(jiān)測離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物的色譜峰豐度比一致，允許的偏差見表 1。 表 1 定性測定時相對離子豐度的最大允許偏差 相對離子豐度 （基線峰的%） 允許的相對偏差 (RSD) 50% 20% 20%50% 25% 10%20% 30% 10% 50% 6 分析結(jié)果的表述 試樣中丙烯酰胺含量按公式（1）內(nèi)標(biāo)法計算： MfAX （1） 式中： X試樣中丙烯酰胺的含量，單位為微克每千克（g/kg）； A試樣中丙烯酰胺（m/z 55）色譜峰與13C3丙烯酰胺內(nèi)標(biāo) (m/z 58) 色譜峰的峰面積比值對應(yīng)的丙烯酰胺質(zhì)量，單位為納克（ng） ； f試樣中內(nèi)標(biāo)加入量的換算因子（內(nèi)標(biāo)為 10 L 時 f=1 或內(nèi)標(biāo)為 20 L 時 f=2）； M加入內(nèi)標(biāo)時的取樣量 ，單位為克（g） 。 計算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字 （或小數(shù)點后 1 位）。 7 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%。 8 其他 GB 5009.2042014 5 方法定量限為10 g/kg。 第二法 穩(wěn)定性同位素稀釋的氣相色譜-質(zhì)譜法 9 原理 本標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù)， 在試樣中加入13C3標(biāo)記的丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)溶液， 以水為提取溶劑，試樣提取液采用基質(zhì)固相分散萃取凈化、溴試劑衍生后，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)或氣相色譜-質(zhì)譜儀的選擇離子監(jiān)測(SIM)進行檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。 10 試劑和材料 注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為超純水。 10.1 試劑 10.1.1 正己烷 (n-C6H14)：分析純，重蒸后使用。 10.1.2 乙酸乙酯 (CH3COOC2H5)：分析純，重蒸后使用。 10.1.3 無水硫酸鈉 (Na2SO4)：400 ，烘烤 4 h。 10.1.4 硫酸銨 (NH4)2SO4。 10.1.5 硫代硫酸鈉（Na2S2O35H2O） 。 10.1.6 溴 (Br2)。 10.1.7 氫溴酸 (HBr)：含量48.0%。 10.1.8 溴化鉀 (KBr)。 10.1.9 超純水，電導(dǎo)率（25）0.01 mS/m。 10.1.10 溴試劑。 10.1.11 硅藻土：ExtrelutTM 20 或相當(dāng)產(chǎn)品。 10.2 試劑配制 10.2.1 飽和溴水：量取 100 mL 超純水，置于 200 mL 的棕色試劑瓶中，加入 8 mL 溴，4 避光放置8 h，上層為飽和溴水溶液。 10.2.2 溴試劑：稱取溴化鉀 20.0 g，加超純水 50 mL，使完全溶解，再加入 1.0 mL 氫溴酸和 16.0 mL飽和溴水，搖勻，用超純水稀釋至 100 mL，4 避光保存。 10.2.3 硫代硫酸鈉溶液（0.1 mol/L） ：稱取硫代硫酸鈉 2.48 g，加超純水 50 mL，使完全溶解，用超純水稀釋至 100 mL，4避光保存。 10.2.4 飽和硫酸銨溶液：稱取 80 g 硫酸銨晶體，加入超純水 100 mL，超聲溶解，室溫放置。 10.3 標(biāo)準(zhǔn)品 10.3.1 丙烯酰胺(CH2=CHCONH2)標(biāo)準(zhǔn)品：純度99%。 10.3.2 13C-丙烯酰胺（13CH2=13CH13CONH2）標(biāo)準(zhǔn)品：純度98%。 10.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 10.4.1 丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)溶液：同 3.3.1 和 3.3.2。 10.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液：取 5 個 10 mL 容量瓶，分別移取 0.1 mL、0.5 mL、2 mL 丙烯酰胺工作溶液（1 mg/L）和 0.5 mL 及 1 mL 丙烯酰胺工作溶液（1 mg/L）與 0.5 mL 內(nèi)標(biāo)工作溶液（1 mg/L），用超純水稀釋至刻度。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中丙烯酰胺濃度分別為 10 g/L、50 g/L、200 g/L、500 g/L、GB 5009.2042014 6 1000 g/L，內(nèi)標(biāo)濃度為 50 g/L。臨用時配制。 11 儀器和設(shè)備 11.1 氣相色譜-四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)。 11.2 色譜柱：DB-5ms柱（30 m 0.25 mm i.d. 0.25 m）或等效柱。 11.3 組織粉碎機。 11.4 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。 11.5 氮氣濃縮器。 11.6 振蕩器。 11.7 玻璃層析柱：柱長 30 cm，柱內(nèi)徑 1.8 cm。 11.8 渦旋混合器。 11.9 超純水裝置。 11.10 分析天平：感量為 0.1 mg。 11.11 離心機：轉(zhuǎn)速10 000 r/m。 12 分析步驟 12.1 試樣制備 12.1.1 樣品提取 取 50 g 試樣，經(jīng)粉碎機粉碎，20冷凍保存。準(zhǔn)確稱取試樣 2 g(精確到 0.001 g） ，加入 10.0 mg/L 13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)溶液 10 L（或 20 L） ，相當(dāng)于 100 ng（或 200 ng）的13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)，再加入超純水 10 mL，振蕩 30 min 后，于 4 000 r/m 離心 10 min，取上清液備用。 12.1.2 樣品凈化 在試樣提取的上清液中加入硫酸銨 15 g，振蕩 10 min，使其充分溶解，于 4 000 r/m 離心 10 min，取上清液 10 mL，備用。如上清液不足 10 mL，則用飽和硫酸銨補足。取潔凈玻璃層析柱，在底部填少許玻璃棉，壓緊，依次填裝無水硫酸鈉 10 g、ExtrelutTM 20 硅藻土 2 g。稱取 5g ExtrelutTM 20 硅藻土與上述備用的試樣上清液攪拌均勻后，裝入層析柱中。用 70 mL 正己烷淋洗，控制流速為 2 mL/min，棄去正己烷淋洗液。用 70 mL 乙酸乙酯洗脫，控制流速為 2 mL/min，收集乙酸乙酯洗脫溶液，并在 45 水浴下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干， 用乙酸乙酯洗滌蒸發(fā)瓶殘渣三次 （每次 1 mL） ， 并將其轉(zhuǎn)移至已加入 1 mL 超純水的試管中， 渦旋振蕩。 在氮氣流下吹去上層有機相后，加入 1 mL 正己烷， 渦旋振蕩，于 3500 r/m離心 5 min，取下層水相備用衍生。 12.1.3 衍生 試樣的衍生： 在試樣提取液中加入溴試劑 1 mL， 渦旋振蕩， 4 放置至少 1 h 后， 加入 0.1 mol/L 硫代硫酸鈉溶液約 100 L，渦旋振蕩除去剩余的衍生劑；加入 2 mL 乙酸乙酯，渦旋振蕩 1 min，于 4 000 r/m 離心 5 min，吸取上層有機相轉(zhuǎn)移至加有 0.1 g 無水硫酸鈉的試管中，加入乙酸乙酯 2 mL 重復(fù)萃取，合并有機相； 靜置至少 0.5 h， 轉(zhuǎn)移至另一試管， 在氮氣流下吹至近干， 加 0.5 mL 乙酸乙酯溶解殘渣 （注意：根據(jù)儀器的靈敏度，調(diào)整溶解殘渣的乙酸乙酯體積，通常情況下，采用串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，其使用量為 0.5 mL，采用單級質(zhì)譜儀檢測，其使用量為 0.1 mL。 ） ，備用。 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的衍生：量取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各 1.0 mL，按照上述試樣衍生方法同步操作。 13 儀器參考條件 GB 5009.2042014 7 13.1 色譜條件 色譜柱：DB-5 ms 柱（30 m 0.25 mm I.D. 0.25 m）或等效柱。 進樣口溫度：120 保持 2 min，以 40 /min 速度升至 240 ，并保持 5 min。 色譜柱程序溫度： 65 保持1 min， 以15 /min速度升至200 ， 再以40 /min的速度升至240 ，并保持 5 min。 載氣：高純氦氣（純度99.999%） ，柱前壓為 69 mPa，相當(dāng)于 10 psi。 不分流進樣，進樣體積 1 L。 13.2 質(zhì)譜參數(shù) 檢測方式：選擇離子掃描（SIM）采集。 電離模式：電子轟擊源（EI） ，能量為 70 eV。 傳輸線溫度：250 。 離子源溫度：200 。 溶劑延遲：6 min；質(zhì)譜采集時間：6 min12 min。 丙烯酰胺監(jiān)測離子為 m/z 106、133、150 和 152，定量離子為 m/z 150。 13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)監(jiān)測離子為 m/z 108、136、153 和 155，定量離子為 m/z 155。 13.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將衍生的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入氣相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)，測定相應(yīng)的丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)的峰面積，以各標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的丙烯酰胺進樣濃度（g/L）為橫坐標(biāo)，以丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)13C3丙烯酰胺定量離子質(zhì)量色譜圖上測得的峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制線性曲線。 13.4 試樣溶液的測定 將衍