可移動(dòng)的遺傳因子轉(zhuǎn)座和染色體外遺傳因子.ppt

第三章,可移動(dòng)的遺傳因子（轉(zhuǎn)座子） 和染色體外遺傳因子,生化教研室 林麗彬,主要內(nèi)容,第一節(jié) 轉(zhuǎn) 座 子 第二節(jié) 質(zhì) 粒 第三節(jié) 遺傳重組,第一節(jié) 轉(zhuǎn) 座 子,轉(zhuǎn)座子(transposons) 概念：,轉(zhuǎn)座子是基因組突變的主要因素之一。,轉(zhuǎn)座子（transponsn,簡(jiǎn)稱Tn）是原核生物和真核 生物基因組中存在著可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的一些DNA序列。這些DNA序列可以通過切割、重新整合等一系列過程從基因組的一個(gè)位置“跳躍”到另一個(gè)位置。故又稱跳躍基因。,一、轉(zhuǎn)座子的分類和結(jié)構(gòu)特征,（一）原核生物轉(zhuǎn)座子的類型：,1、插入序列（insertion sequences，IS） 最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子。, 二個(gè)分離的反向末端重復(fù)序列 (inverted terminal repeats, ITR) 一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因,2、復(fù)合轉(zhuǎn)座子 類轉(zhuǎn)座子 由IS類轉(zhuǎn)座組件構(gòu)成的復(fù)合體。,組成：兩端為IS序列或類IS序列 中間編碼抗生素物質(zhì),3、轉(zhuǎn)座子A家族類轉(zhuǎn)座子（Tn A家族） 攜帶轉(zhuǎn)座和耐藥等基因的獨(dú)立體家族。,組成：兩端為ITR，而不是IS 中間編碼區(qū)含轉(zhuǎn)座酶編碼基因，及 抗生素抗性和解離酶等編碼基因。,4、轉(zhuǎn)座噬菌體類轉(zhuǎn)座子（了解）,（二）真核生物轉(zhuǎn)座子的類型（了解）,1、酵母菌中的轉(zhuǎn)座子Ty因子： 2、果蠅中的轉(zhuǎn)座子P因子、FB因子等： 3、玉米中轉(zhuǎn)座子玉米調(diào)控元件 4、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄病毒、病毒超家族 及非病毒超家族。,轉(zhuǎn)座子共同特點(diǎn),.兩端有反向重復(fù)序列 .轉(zhuǎn)座后靶位點(diǎn)是正向重復(fù) .編碼與轉(zhuǎn)座有關(guān)的蛋白轉(zhuǎn)座酶 .可以在基因組中移動(dòng),（一）類型,1、復(fù)制型轉(zhuǎn)座 （replicative transposition）,2、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座（nonreplicative transposition）,3、保守轉(zhuǎn)座（conservative tranposition）,二、轉(zhuǎn)座子機(jī)制,1、復(fù)制型轉(zhuǎn)座,轉(zhuǎn)座是伴隨著新拷貝的復(fù)制。TnA轉(zhuǎn)座子家族的移 動(dòng)只能通過復(fù)制型轉(zhuǎn)座,轉(zhuǎn)座酶：交錯(cuò)切割原來的轉(zhuǎn)座子末端和靶序列。,解離酶：作用于新的轉(zhuǎn)座子拷貝,需要兩種酶：轉(zhuǎn)座酶和解離酶。,2、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座,一個(gè)位點(diǎn)移到另一位點(diǎn)。一種酶：轉(zhuǎn)座酶 。轉(zhuǎn)座 后供體中無轉(zhuǎn)座子。插入序列和復(fù)合轉(zhuǎn)座子Tn10、 Tn5均利用這一機(jī)制移動(dòng)。,3、保守轉(zhuǎn)座,宿主的修復(fù)系統(tǒng)能識(shí)別此處雙鏈斷裂并進(jìn)行修復(fù),保守型轉(zhuǎn)座是另一種非復(fù)制型的轉(zhuǎn)座過 程，該過程中轉(zhuǎn)座元件從供體部位被切除并通過一系列的過程插入到靶部位，在該過程中每個(gè)核苷鍵皆被保留。,IS插入，與宿主的單鏈末端相連接,缺口由DNA聚合酶和連接酶加以填補(bǔ)，插入的IS兩端形成了DR或靶重復(fù)。,轉(zhuǎn)座過程：,非復(fù)制型轉(zhuǎn)座（插入序列）的轉(zhuǎn)座過程：,轉(zhuǎn)座酶交錯(cuò)切開宿主靶位點(diǎn),+,轉(zhuǎn)座酶交錯(cuò)切割原來的轉(zhuǎn)座子末端和靶序列。,復(fù)制型的轉(zhuǎn)座過程：,切割產(chǎn)生的靶序列3端和轉(zhuǎn)座子5端之間發(fā)生DNA鏈交換，形成假復(fù)制叉。,然后以靶序列的3端為復(fù)制引物，以轉(zhuǎn)座子鏈為模板進(jìn)行復(fù)制產(chǎn)生共合體。,最后在解離酶的作用下，2個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座子發(fā)生同源重組并釋放出2個(gè)復(fù)制子。,三、轉(zhuǎn)座效應(yīng)（了解）,1、轉(zhuǎn)座的遺傳效應(yīng)：,轉(zhuǎn)座最典型的作用是引起不穩(wěn)定的突變等位基因。,導(dǎo)致受體DNA基因突變，插入導(dǎo)致基因失活是轉(zhuǎn)座 最直接的效應(yīng)。,干擾宿主基因與調(diào)控元件之間的關(guān)系，或改變DNA 結(jié)構(gòu)而影響基因表達(dá)。,轉(zhuǎn)座引起的DNA重排,引起插入突變、產(chǎn)生新的基因、產(chǎn)生染色體畸變、引起生物進(jìn)化,3、異常轉(zhuǎn)座的效應(yīng)：,4、對(duì)宿主細(xì)胞活力的影響：,異常轉(zhuǎn)座包括：一端轉(zhuǎn)座、部分轉(zhuǎn)座、隱藏位點(diǎn)轉(zhuǎn)座、協(xié)同轉(zhuǎn)座、倒位轉(zhuǎn)座,影響細(xì)胞DNA代謝，介導(dǎo)基因異常重排。 三種形式： 修復(fù)切割所留下的切口 轉(zhuǎn)座子內(nèi)部的重排 轉(zhuǎn)座子間的重排,2、精確轉(zhuǎn)座的結(jié)構(gòu)效應(yīng)：,轉(zhuǎn)座事件可介導(dǎo)兩側(cè)的宿主DNA發(fā)生一系列的基因重排。,逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子：指內(nèi)部含逆轉(zhuǎn)錄酶編碼序列, 通過DNARNADNA 方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座, 即轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的RNA , 再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成新的轉(zhuǎn)座子DNA 并整合到基因組中。,四、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子,逆轉(zhuǎn)錄病毒：將含有逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA病毒稱為 逆轉(zhuǎn)錄病毒。,逆轉(zhuǎn)錄酶由逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA編碼,所以逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與逆轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)，是真核生物轉(zhuǎn)座子的重要類型。,逆轉(zhuǎn)錄病毒與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的區(qū)別：,逆轉(zhuǎn)錄病毒是具有感染能力的病毒顆粒，可以 在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移。,逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是宿主DNA基因組的組分，可以 在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座，但不能在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移。,1、逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu),（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒：,基因組由兩條相同的正鏈RNA組成。典型逆轉(zhuǎn)錄病毒具有g(shù)ag、pol、env三個(gè)結(jié)構(gòu)基因。如圖：,編碼病毒核心蛋白,編碼逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白水解酶和整合酶,編碼包膜糖蛋白。,（2）逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子：,與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)有許多相似之處，但env基因被破壞或沒有，故逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子不能形成感染粒子。,2.逆轉(zhuǎn)錄病毒與轉(zhuǎn)座, 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生原病毒像溶源性噬菌體DNA一樣，成為宿主基因組的一部分； 細(xì)胞DNA序列可能與病毒序列重組，并經(jīng)過轉(zhuǎn)座作用插入新位點(diǎn)，改變細(xì)胞的性質(zhì)。,逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的線形病毒DNA，由整合酶催化插入宿主靶位點(diǎn)DNA，這一整合過程與轉(zhuǎn)座子一樣。,3、逆轉(zhuǎn)錄病毒與轉(zhuǎn)導(dǎo)（了解）,逆轉(zhuǎn)錄病毒可轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞的序列，常被稱 為轉(zhuǎn)導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒。,原病毒DNA整合在C-onc基因附近，二者可 融合在一起，轉(zhuǎn)錄后形成一條即含病毒序列又含 C-onc的RNA，后者如含包裝信號(hào)可被包裝進(jìn) 病毒顆粒中，形成含有一條融合RNA和一條正 常病毒RNA的二倍體病毒顆粒。 二者分子之間發(fā)生重組將會(huì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)錄 病毒基因組。病毒攜帶V-onc，即具有轉(zhuǎn)化能力。,LTR,gag,pol,env,LTR,Virus DNA,Virus protein,LTR,gag,LTR,V-onc,Transforming Virus DNA,Virus protein,逆轉(zhuǎn)錄病毒和攜帶細(xì)胞基因序列病毒基因組比較,3.逆轉(zhuǎn)錄病毒與轉(zhuǎn)錄,病毒超家族（vira superfamivly）：反轉(zhuǎn)錄病毒編碼反轉(zhuǎn)錄酶或整合酶，所以有轉(zhuǎn)座能力。反轉(zhuǎn)錄子不同于反轉(zhuǎn)錄病毒，它們自已并不形成獨(dú)立的感染顆粒。但對(duì)于轉(zhuǎn)座機(jī)制等其它方面它們是相似的。這一組稱為。,逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分類,非病毒超家族（nonviral suberfamily）：另一類反轉(zhuǎn)錄子其內(nèi)外部特點(diǎn)相似，表明它們起源于RNA序列。它們并不編碼具有轉(zhuǎn)座功能的蛋白，轉(zhuǎn)座的酶是通過別處編碼的酶來作用的。這一組就稱為.。,第二節(jié) 質(zhì) 粒,質(zhì)粒（plasmid）：為多數(shù)細(xì)菌和某些真核細(xì)胞染色體外的環(huán)狀雙鏈DNA分子 。,特點(diǎn)：,能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立復(fù)制，帶有某些遺傳信息，會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 但質(zhì)粒并不是它的宿主細(xì)胞所必需的。,質(zhì)粒（plasmid）, 存在于細(xì)菌等細(xì)胞質(zhì)中 雙鏈環(huán)狀DNA分子 大約 1-200 Kb 具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力 不能獨(dú)立存活 在子細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù) 并表達(dá)其遺傳信息,3. col質(zhì)粒：編碼大腸埃希菌的細(xì)菌素,一、質(zhì)粒遺傳學(xué)類型,2. R質(zhì)粒,1. F質(zhì)粒,3. col質(zhì)粒,4.質(zhì)粒噬菌體,1. F質(zhì)粒：編碼細(xì)菌性菌毛,2. R質(zhì)粒： 編碼細(xì)菌耐藥性,二、質(zhì)粒DNA的特性,（一）質(zhì)粒的復(fù)制,質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制分兩種類型：,1、嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制：,依賴細(xì)菌染色體的多種酶系統(tǒng)。,只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，與細(xì)菌的繁 殖密切相關(guān)。受細(xì)胞核控制，與染色體DNA復(fù)制 相伴隨。 需要蛋白質(zhì)合成和 DNA pol 的存在。 每個(gè)細(xì)胞只有 15個(gè)拷貝。,在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)都可進(jìn)行復(fù)制。不受細(xì)胞 核控制， 需用DNApol的存在。 在細(xì)胞內(nèi)有10200個(gè)以上,甚至多達(dá)數(shù)千個(gè)。,質(zhì)粒復(fù)制方式： 均為半保留復(fù)制，并在復(fù)制周期內(nèi)保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)。 質(zhì)粒復(fù)制形式多樣，包括： 單向復(fù)制、雙向復(fù)制、單向與雙向并存。,2、松弛型質(zhì)粒的復(fù)制：,（二）質(zhì)粒的不相容性,質(zhì)粒的不相容性是指細(xì)菌質(zhì)粒不能在相同細(xì)胞 中同時(shí)存在的現(xiàn)象。,當(dāng)某種質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)存在時(shí)，會(huì)阻止其它質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞寄宿，這種質(zhì)粒稱為不相容質(zhì)粒。,四、質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)記,選擇標(biāo)記是指能夠賦予宿主易于檢測(cè)的表型。包括抗生素抗性標(biāo)記，以及一些生化表型的標(biāo)記。,抗生素抗性基因是目前使用最廣泛的 選擇標(biāo)記。常用的有 ：,1、氨芐青霉素抗性基因 ampr 2、四環(huán)素抗性基因 tetr 3、氯霉素抗性基因cmr 或 cat,三、特殊細(xì)菌質(zhì)粒（了解）,（一）F 質(zhì)粒 性質(zhì)粒,F 質(zhì)粒是一種環(huán)狀的DNA分子，分子量94.5kb； F 質(zhì)粒有整合進(jìn)入細(xì)胞染色體而產(chǎn)生Hfr細(xì)胞 的能力； 染色體上有20多個(gè)整合位點(diǎn)，F(xiàn)質(zhì)粒對(duì)其親和力 不同，形成Hfr 細(xì)胞株的頻率也是不同的； F 質(zhì)粒的整合方向可以是順時(shí)針，也可逆時(shí)針； F 質(zhì)?？蓮囊粋€(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一無F 質(zhì)粒的細(xì)胞。,（二）R 質(zhì)粒耐藥性質(zhì)粒,R 質(zhì)粒由抗性轉(zhuǎn)移因子（RTF）和決定抗性 因子（r-決定子）兩部分DNA片段組成。,（三）Col 質(zhì)粒大腸桿菌質(zhì)粒,是能產(chǎn)生大腸桿菌素的大腸桿菌質(zhì)粒，可以 抑制或殺死不含Col 質(zhì)粒的親緣細(xì)菌。,R 質(zhì)粒含有對(duì)抗生素的抗性基因，使宿主細(xì) 菌產(chǎn)生對(duì)抗生素的抗性，這種耐藥性是可以 遺傳的。,在減數(shù)分裂時(shí)，通過同源染色體的交換和非同源染色體的獨(dú)立分配，使子代細(xì)胞的遺傳信息產(chǎn)生了重新組合，這種現(xiàn)象稱為遺傳重組。（genetic recombination）,第三節(jié) 遺傳重組,遺傳重組定義：,廣義的遺傳重組：指任何產(chǎn)生新的基因組合，從而造成基因型變化的過程，包括獨(dú)立分配或基因交換。,狹義的遺傳重組：僅涉及DNA分子的斷裂并重 新連接而造成基因重新組合的過程，即基因交換。,遺傳重組類型,1.同源重組 2.位點(diǎn)特異性重組 3.轉(zhuǎn)座作用 4.異常重組,依據(jù)對(duì)DNA序列和所需蛋白質(zhì)因子的要求,一、同源重組 （homologous recombination）,發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式。 通過鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子大片同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。,1、同源重組的產(chǎn)生：,產(chǎn)生條件：只要兩條DNA序列相同或相似，就可 以在序列的任何一點(diǎn)發(fā)生同源重組。,二、同源重組的分子機(jī)制, 兩個(gè)DNA分子單鏈的同一部位發(fā)生斷裂。 兩個(gè)斷裂的單鏈的游離末端彼此交換，連接形成Holliday連接體。 通過分支移動(dòng)產(chǎn)生同另一分子的互補(bǔ)序列形成異源雙鏈DNA。 Holliday交叉的上部或下部旋轉(zhuǎn)1800，中間體 切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為： 片段重組體和拼接重組體。,普遍公認(rèn)的是1964年提出的Holliday模型，該模型于1975年得到改進(jìn)：,片段重組體 基本無重組發(fā)生：,拼接重組體交換重組：,切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。,切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體 異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。,片段重組體,拼接重組體,RecBCD核酸酶 RecA蛋白 RuvAB和RuvC蛋白,（三）、同源重組的酶學(xué),對(duì)大腸桿菌的研究最為深入，主要蛋白質(zhì)有：,1、RecBCD蛋白,RecBCD是一種多功能酶，具有外切核酸酶、解 螺旋酶、ATP酶和序列特異的單鏈內(nèi)切酶活性。,單鏈內(nèi)切酶活性和解旋酶活性使DNA產(chǎn)生具有游離末端的單鏈RecA的作用位點(diǎn),RecBCD有固定切割位點(diǎn),單鏈區(qū)的 chi 位點(diǎn)3方46NT處切斷單鏈(單鏈內(nèi)切酶),chi位點(diǎn)：5-GCTGGTGG-3目前發(fā)現(xiàn)的重組熱點(diǎn)，E.coli基因組中大約每10Kb出現(xiàn)一個(gè)該位點(diǎn).,5,3,RecBCD 切割產(chǎn)生3單鏈末端,chi位點(diǎn)：5-GCTGGTGG-3,2、RecA 蛋白,活性,RecA 有單、雙鏈 DNA 結(jié)合活性,RecA 有 ATPase 活性,RecA 有啟動(dòng)一個(gè)分子的單鏈侵入到另一雙螺旋分 子的能力，即聯(lián)會(huì)同源 DNA,功能：,在ATP的協(xié)助下， 促進(jìn)各種DNA分子進(jìn)行同源配對(duì)或分子入侵，形成同源配對(duì)的聯(lián)合分子。,RecA 蛋白催化雙鏈和單鏈 DNA 的反應(yīng)階段,3、其它蛋白,、RuvA：識(shí)別 Holliday 結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn),、RuvB：為分枝遷移提供動(dòng)力（ATPase ）,RuvAB最主要的功能： 憑借其解旋酶活性，推動(dòng)Holliday中間體的分支遷移。, Ruv C 的作用：,Ruv C 是一種核酸內(nèi)切酶-專一性識(shí)別Holliday 結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn)。,拆分分三步進(jìn)行：,功能：在重組中誘發(fā)Holliday中間體的拆分作用。,第一： Ruv C 結(jié)合于Holliday中間體； 第二：改變DNA構(gòu)象，需用Mg2 或Ca2 ； 第三：切割，需用Mg2。,（四）、同源重組的主要途徑,（1）Rec BCD 途徑：是最重要的一條途徑。 （2）Rec F 途徑：在Rec BCD 途徑不能運(yùn)作 的情況下，大腸桿菌啟動(dòng)該途徑。 （3）Rec E 途徑：不用Rec BCD ，也不用Rec A。 （4）Red 途徑：為重組缺陷途徑，是噬菌體 專用途徑。,概念：發(fā)生在專一序列而順序極少相同的DNA分子間，不依賴于DNA序列的同源性，而依賴于能與某些酶相結(jié)合的特異DNA序列的重組。,二、 位點(diǎn)特異性重組,概念：,噬菌體基因組整合到細(xì)菌染色體基因組中屬此種重組,特點(diǎn)：,在特定的結(jié)合序列部位，有專一的酶催化斷裂 重接-產(chǎn)生精確的DNA重排,都具有整合作用的兩個(gè)基本特征, 典型的保守性重組-交換是相互的和保存原先 的DNA，即DNA不失去、不合成、不交換對(duì)等 部分（有時(shí)是一個(gè)DNA分子整合到另一個(gè)DNA 分子中，又稱整合式重組）, 發(fā)生在噬菌體和細(xì)菌DNA短同源序列的專一性 核苷酸上，需要位點(diǎn)專一性的蛋白質(zhì)因子參與。,位點(diǎn)特異性重組與同源重組的區(qū)別：, 同源重組中DNA鏈的切斷是完全隨機(jī)的； 位點(diǎn)特異性重組是在某些特異的DNA 序列處發(fā)生重組。, 同源重組后染色體內(nèi)的DNA序列一般仍按 原來的順序排列； 位點(diǎn)特異性重組中DNA節(jié)段的相對(duì)位置發(fā) 生了移動(dòng)，即DNA序列發(fā)生重排，從而得 到不同的結(jié)果。,（一）噬菌體對(duì)E.coli 的整合,1、噬菌體DNA的整合作用：,噬菌體感染大腸桿菌后，有兩種生活方式：, 裂解生長途徑（溶菌生長）：lysis pathway 溶源菌生長途徑：lysogenic pathway,噬菌體在溶源周期和裂解周期中，其DNA狀態(tài) 不同，兩種狀態(tài)的相互轉(zhuǎn)變（整合與切離）是通 過位點(diǎn)特異性重組實(shí)現(xiàn)的。 這些特異位點(diǎn)叫附著點(diǎn)（attachment site）， 簡(jiǎn)稱為 att。,BOB,att B,att P,POP,Int IHF,Int Xis IHF,BOP,POB,att L,att R,原噬菌體,切除,整合,細(xì)菌DNA,噬菌體,核心序列 “O”完全一致（同源部分）-位點(diǎn)特異性重組發(fā)生的地方,整合后的附著位點(diǎn)為 attL（BOP） attR（POB）,噬菌體的整合作用有兩個(gè)特點(diǎn)：, DNA和宿主DNA的交換是可逆的， 原先存在的DNA序列全部被保存下來，并 無丟失。, 噬菌體和細(xì)菌的DNA之間有一段很短的 同源序列，重組交換必須通過其中的一個(gè) 特定的核苷酸。,2、噬菌體整合的分子機(jī)制：,分成三個(gè)階段：,