可移動的遺傳因子轉(zhuǎn)座和染色體外遺傳因子.ppt

第三章,可移動的遺傳因子（轉(zhuǎn)座子） 和染色體外遺傳因子,生化教研室 林麗彬,主要內(nèi)容,第一節(jié) 轉(zhuǎn) 座 子 第二節(jié) 質(zhì) 粒 第三節(jié) 遺傳重組,第一節(jié) 轉(zhuǎn) 座 子,轉(zhuǎn)座子(transposons) 概念：,轉(zhuǎn)座子是基因組突變的主要因素之一。,轉(zhuǎn)座子（transponsn,簡稱Tn）是原核生物和真核 生物基因組中存在著可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的一些DNA序列。這些DNA序列可以通過切割、重新整合等一系列過程從基因組的一個位置“跳躍”到另一個位置。故又稱跳躍基因。,一、轉(zhuǎn)座子的分類和結(jié)構(gòu)特征,（一）原核生物轉(zhuǎn)座子的類型：,1、插入序列（insertion sequences，IS） 最簡單的轉(zhuǎn)座子。, 二個分離的反向末端重復(fù)序列 (inverted terminal repeats, ITR) 一個轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因,2、復(fù)合轉(zhuǎn)座子 類轉(zhuǎn)座子 由IS類轉(zhuǎn)座組件構(gòu)成的復(fù)合體。,組成：兩端為IS序列或類IS序列 中間編碼抗生素物質(zhì),3、轉(zhuǎn)座子A家族類轉(zhuǎn)座子（Tn A家族） 攜帶轉(zhuǎn)座和耐藥等基因的獨立體家族。,組成：兩端為ITR，而不是IS 中間編碼區(qū)含轉(zhuǎn)座酶編碼基因，及 抗生素抗性和解離酶等編碼基因。,4、轉(zhuǎn)座噬菌體類轉(zhuǎn)座子（了解）,（二）真核生物轉(zhuǎn)座子的類型（了解）,1、酵母菌中的轉(zhuǎn)座子Ty因子： 2、果蠅中的轉(zhuǎn)座子P因子、FB因子等： 3、玉米中轉(zhuǎn)座子玉米調(diào)控元件 4、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄病毒、病毒超家族 及非病毒超家族。,轉(zhuǎn)座子共同特點,.兩端有反向重復(fù)序列 .轉(zhuǎn)座后靶位點是正向重復(fù) .編碼與轉(zhuǎn)座有關(guān)的蛋白轉(zhuǎn)座酶 .可以在基因組中移動,（一）類型,1、復(fù)制型轉(zhuǎn)座 （replicative transposition）,2、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座（nonreplicative transposition）,3、保守轉(zhuǎn)座（conservative tranposition）,二、轉(zhuǎn)座子機制,1、復(fù)制型轉(zhuǎn)座,轉(zhuǎn)座是伴隨著新拷貝的復(fù)制。TnA轉(zhuǎn)座子家族的移 動只能通過復(fù)制型轉(zhuǎn)座,轉(zhuǎn)座酶：交錯切割原來的轉(zhuǎn)座子末端和靶序列。,解離酶：作用于新的轉(zhuǎn)座子拷貝,需要兩種酶：轉(zhuǎn)座酶和解離酶。,2、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座,一個位點移到另一位點。一種酶：轉(zhuǎn)座酶 。轉(zhuǎn)座 后供體中無轉(zhuǎn)座子。插入序列和復(fù)合轉(zhuǎn)座子Tn10、 Tn5均利用這一機制移動。,3、保守轉(zhuǎn)座,宿主的修復(fù)系統(tǒng)能識別此處雙鏈斷裂并進行修復(fù),保守型轉(zhuǎn)座是另一種非復(fù)制型的轉(zhuǎn)座過 程，該過程中轉(zhuǎn)座元件從供體部位被切除并通過一系列的過程插入到靶部位，在該過程中每個核苷鍵皆被保留。,IS插入，與宿主的單鏈末端相連接,缺口由DNA聚合酶和連接酶加以填補，插入的IS兩端形成了DR或靶重復(fù)。,轉(zhuǎn)座過程：,非復(fù)制型轉(zhuǎn)座（插入序列）的轉(zhuǎn)座過程：,轉(zhuǎn)座酶交錯切開宿主靶位點,+,轉(zhuǎn)座酶交錯切割原來的轉(zhuǎn)座子末端和靶序列。,復(fù)制型的轉(zhuǎn)座過程：,切割產(chǎn)生的靶序列3端和轉(zhuǎn)座子5端之間發(fā)生DNA鏈交換，形成假復(fù)制叉。,然后以靶序列的3端為復(fù)制引物，以轉(zhuǎn)座子鏈為模板進行復(fù)制產(chǎn)生共合體。,最后在解離酶的作用下，2個拷貝的轉(zhuǎn)座子發(fā)生同源重組并釋放出2個復(fù)制子。,三、轉(zhuǎn)座效應(yīng)（了解）,1、轉(zhuǎn)座的遺傳效應(yīng)：,轉(zhuǎn)座最典型的作用是引起不穩(wěn)定的突變等位基因。,導(dǎo)致受體DNA基因突變，插入導(dǎo)致基因失活是轉(zhuǎn)座 最直接的效應(yīng)。,干擾宿主基因與調(diào)控元件之間的關(guān)系，或改變DNA 結(jié)構(gòu)而影響基因表達。,轉(zhuǎn)座引起的DNA重排,引起插入突變、產(chǎn)生新的基因、產(chǎn)生染色體畸變、引起生物進化,3、異常轉(zhuǎn)座的效應(yīng)：,4、對宿主細胞活力的影響：,異常轉(zhuǎn)座包括：一端轉(zhuǎn)座、部分轉(zhuǎn)座、隱藏位點轉(zhuǎn)座、協(xié)同轉(zhuǎn)座、倒位轉(zhuǎn)座,影響細胞DNA代謝，介導(dǎo)基因異常重排。 三種形式： 修復(fù)切割所留下的切口 轉(zhuǎn)座子內(nèi)部的重排 轉(zhuǎn)座子間的重排,2、精確轉(zhuǎn)座的結(jié)構(gòu)效應(yīng)：,轉(zhuǎn)座事件可介導(dǎo)兩側(cè)的宿主DNA發(fā)生一系列的基因重排。,逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子：指內(nèi)部含逆轉(zhuǎn)錄酶編碼序列, 通過DNARNADNA 方式進行轉(zhuǎn)座, 即轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的RNA , 再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成新的轉(zhuǎn)座子DNA 并整合到基因組中。,四、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子,逆轉(zhuǎn)錄病毒：將含有逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA病毒稱為 逆轉(zhuǎn)錄病毒。,逆轉(zhuǎn)錄酶由逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA編碼,所以逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與逆轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)，是真核生物轉(zhuǎn)座子的重要類型。,逆轉(zhuǎn)錄病毒與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的區(qū)別：,逆轉(zhuǎn)錄病毒是具有感染能力的病毒顆粒，可以 在細胞之間轉(zhuǎn)移。,逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是宿主DNA基因組的組分，可以 在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座，但不能在細胞之間轉(zhuǎn)移。,1、逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu),（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒：,基因組由兩條相同的正鏈RNA組成。典型逆轉(zhuǎn)錄病毒具有g(shù)ag、pol、env三個結(jié)構(gòu)基因。如圖：,編碼病毒核心蛋白,編碼逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白水解酶和整合酶,編碼包膜糖蛋白。,（2）逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子：,與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)有許多相似之處，但env基因被破壞或沒有，故逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子不能形成感染粒子。,2.逆轉(zhuǎn)錄病毒與轉(zhuǎn)座, 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生原病毒像溶源性噬菌體DNA一樣，成為宿主基因組的一部分； 細胞DNA序列可能與病毒序列重組，并經(jīng)過轉(zhuǎn)座作用插入新位點，改變細胞的性質(zhì)。,逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的線形病毒DNA，由整合酶催化插入宿主靶位點DNA，這一整合過程與轉(zhuǎn)座子一樣。,3、逆轉(zhuǎn)錄病毒與轉(zhuǎn)導(dǎo)（了解）,逆轉(zhuǎn)錄病毒可轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細胞的序列，常被稱 為轉(zhuǎn)導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒。,原病毒DNA整合在C-onc基因附近，二者可 融合在一起，轉(zhuǎn)錄后形成一條即含病毒序列又含 C-onc的RNA，后者如含包裝信號可被包裝進 病毒顆粒中，形成含有一條融合RNA和一條正 常病毒RNA的二倍體病毒顆粒。 二者分子之間發(fā)生重組將會產(chǎn)生轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)錄 病毒基因組。病毒攜帶V-onc，即具有轉(zhuǎn)化能力。,LTR,gag,pol,env,LTR,Virus DNA,Virus protein,LTR,gag,LTR,V-onc,Transforming Virus DNA,Virus protein,逆轉(zhuǎn)錄病毒和攜帶細胞基因序列病毒基因組比較,3.逆轉(zhuǎn)錄病毒與轉(zhuǎn)錄,病毒超家族（vira superfamivly）：反轉(zhuǎn)錄病毒編碼反轉(zhuǎn)錄酶或整合酶，所以有轉(zhuǎn)座能力。反轉(zhuǎn)錄子不同于反轉(zhuǎn)錄病毒，它們自已并不形成獨立的感染顆粒。但對于轉(zhuǎn)座機制等其它方面它們是相似的。這一組稱為。,逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分類,非病毒超家族（nonviral suberfamily）：另一類反轉(zhuǎn)錄子其內(nèi)外部特點相似，表明它們起源于RNA序列。它們并不編碼具有轉(zhuǎn)座功能的蛋白，轉(zhuǎn)座的酶是通過別處編碼的酶來作用的。這一組就稱為.。,第二節(jié) 質(zhì) 粒,質(zhì)粒（plasmid）：為多數(shù)細菌和某些真核細胞染色體外的環(huán)狀雙鏈DNA分子 。,特點：,能在宿主細胞內(nèi)獨立復(fù)制，帶有某些遺傳信息，會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。 但質(zhì)粒并不是它的宿主細胞所必需的。,質(zhì)粒（plasmid）, 存在于細菌等細胞質(zhì)中 雙鏈環(huán)狀DNA分子 大約 1-200 Kb 具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力 不能獨立存活 在子細胞中保持恒定的拷貝數(shù) 并表達其遺傳信息,3. col質(zhì)粒：編碼大腸埃希菌的細菌素,一、質(zhì)粒遺傳學(xué)類型,2. R質(zhì)粒,1. F質(zhì)粒,3. col質(zhì)粒,4.質(zhì)粒噬菌體,1. F質(zhì)粒：編碼細菌性菌毛,2. R質(zhì)粒： 編碼細菌耐藥性,二、質(zhì)粒DNA的特性,（一）質(zhì)粒的復(fù)制,質(zhì)粒在細胞內(nèi)的復(fù)制分兩種類型：,1、嚴緊型質(zhì)粒的復(fù)制：,依賴細菌染色體的多種酶系統(tǒng)。,只在細胞周期的一定階段進行復(fù)制，與細菌的繁 殖密切相關(guān)。受細胞核控制，與染色體DNA復(fù)制 相伴隨。 需要蛋白質(zhì)合成和 DNA pol 的存在。 每個細胞只有 15個拷貝。,在整個細胞周期中隨時都可進行復(fù)制。不受細胞 核控制， 需用DNApol的存在。 在細胞內(nèi)有10200個以上,甚至多達數(shù)千個。,質(zhì)粒復(fù)制方式： 均為半保留復(fù)制，并在復(fù)制周期內(nèi)保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)。 質(zhì)粒復(fù)制形式多樣，包括： 單向復(fù)制、雙向復(fù)制、單向與雙向并存。,2、松弛型質(zhì)粒的復(fù)制：,（二）質(zhì)粒的不相容性,質(zhì)粒的不相容性是指細菌質(zhì)粒不能在相同細胞 中同時存在的現(xiàn)象。,當某種質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)存在時，會阻止其它質(zhì)粒進入細胞寄宿，這種質(zhì)粒稱為不相容質(zhì)粒。,四、質(zhì)粒中的選擇性標記,選擇標記是指能夠賦予宿主易于檢測的表型。包括抗生素抗性標記，以及一些生化表型的標記。,抗生素抗性基因是目前使用最廣泛的 選擇標記。常用的有 ：,1、氨芐青霉素抗性基因 ampr 2、四環(huán)素抗性基因 tetr 3、氯霉素抗性基因cmr 或 cat,三、特殊細菌質(zhì)粒（了解）,（一）F 質(zhì)粒 性質(zhì)粒,F 質(zhì)粒是一種環(huán)狀的DNA分子，分子量94.5kb； F 質(zhì)粒有整合進入細胞染色體而產(chǎn)生Hfr細胞 的能力； 染色體上有20多個整合位點，F(xiàn)質(zhì)粒對其親和力 不同，形成Hfr 細胞株的頻率也是不同的； F 質(zhì)粒的整合方向可以是順時針，也可逆時針； F 質(zhì)粒可從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一無F 質(zhì)粒的細胞。,（二）R 質(zhì)粒耐藥性質(zhì)粒,R 質(zhì)粒由抗性轉(zhuǎn)移因子（RTF）和決定抗性 因子（r-決定子）兩部分DNA片段組成。,（三）Col 質(zhì)粒大腸桿菌質(zhì)粒,是能產(chǎn)生大腸桿菌素的大腸桿菌質(zhì)粒，可以 抑制或殺死不含Col 質(zhì)粒的親緣細菌。,R 質(zhì)粒含有對抗生素的抗性基因，使宿主細 菌產(chǎn)生對抗生素的抗性，這種耐藥性是可以 遺傳的。,在減數(shù)分裂時，通過同源染色體的交換和非同源染色體的獨立分配，使子代細胞的遺傳信息產(chǎn)生了重新組合，這種現(xiàn)象稱為遺傳重組。（genetic recombination）,第三節(jié) 遺傳重組,遺傳重組定義：,廣義的遺傳重組：指任何產(chǎn)生新的基因組合，從而造成基因型變化的過程，包括獨立分配或基因交換。,狹義的遺傳重組：僅涉及DNA分子的斷裂并重 新連接而造成基因重新組合的過程，即基因交換。,遺傳重組類型,1.同源重組 2.位點特異性重組 3.轉(zhuǎn)座作用 4.異常重組,依據(jù)對DNA序列和所需蛋白質(zhì)因子的要求,一、同源重組 （homologous recombination）,發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式。 通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子大片同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。,1、同源重組的產(chǎn)生：,產(chǎn)生條件：只要兩條DNA序列相同或相似，就可 以在序列的任何一點發(fā)生同源重組。,二、同源重組的分子機制, 兩個DNA分子單鏈的同一部位發(fā)生斷裂。 兩個斷裂的單鏈的游離末端彼此交換，連接形成Holliday連接體。 通過分支移動產(chǎn)生同另一分子的互補序列形成異源雙鏈DNA。 Holliday交叉的上部或下部旋轉(zhuǎn)1800，中間體 切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為： 片段重組體和拼接重組體。,普遍公認的是1964年提出的Holliday模型，該模型于1975年得到改進：,片段重組體 基本無重組發(fā)生：,拼接重組體交換重組：,切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。,切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體 異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。,片段重組體,拼接重組體,RecBCD核酸酶 RecA蛋白 RuvAB和RuvC蛋白,（三）、同源重組的酶學(xué),對大腸桿菌的研究最為深入，主要蛋白質(zhì)有：,1、RecBCD蛋白,RecBCD是一種多功能酶，具有外切核酸酶、解 螺旋酶、ATP酶和序列特異的單鏈內(nèi)切酶活性。,單鏈內(nèi)切酶活性和解旋酶活性使DNA產(chǎn)生具有游離末端的單鏈RecA的作用位點,RecBCD有固定切割位點,單鏈區(qū)的 chi 位點3方46NT處切斷單鏈(單鏈內(nèi)切酶),chi位點：5-GCTGGTGG-3目前發(fā)現(xiàn)的重組熱點，E.coli基因組中大約每10Kb出現(xiàn)一個該位點.,5,3,RecBCD 切割產(chǎn)生3單鏈末端,chi位點：5-GCTGGTGG-3,2、RecA 蛋白,活性,RecA 有單、雙鏈 DNA 結(jié)合活性,RecA 有 ATPase 活性,RecA 有啟動一個分子的單鏈侵入到另一雙螺旋分 子的能力，即聯(lián)會同源 DNA,功能：,在ATP的協(xié)助下， 促進各種DNA分子進行同源配對或分子入侵，形成同源配對的聯(lián)合分子。,RecA 蛋白催化雙鏈和單鏈 DNA 的反應(yīng)階段,3、其它蛋白,、RuvA：識別 Holliday 結(jié)構(gòu)的連接點,、RuvB：為分枝遷移提供動力（ATPase ）,RuvAB最主要的功能： 憑借其解旋酶活性，推動Holliday中間體的分支遷移。, Ruv C 的作用：,Ruv C 是一種核酸內(nèi)切酶-專一性識別Holliday 結(jié)構(gòu)的連接點。,拆分分三步進行：,功能：在重組中誘發(fā)Holliday中間體的拆分作用。,第一： Ruv C 結(jié)合于Holliday中間體； 第二：改變DNA構(gòu)象，需用Mg2 或Ca2 ； 第三：切割，需用Mg2。,（四）、同源重組的主要途徑,（1）Rec BCD 途徑：是最重要的一條途徑。 （2）Rec F 途徑：在Rec BCD 途徑不能運作 的情況下，大腸桿菌啟動該途徑。 （3）Rec E 途徑：不用Rec BCD ，也不用Rec A。 （4）Red 途徑：為重組缺陷途徑，是噬菌體 專用途徑。,概念：發(fā)生在專一序列而順序極少相同的DNA分子間，不依賴于DNA序列的同源性，而依賴于能與某些酶相結(jié)合的特異DNA序列的重組。,二、 位點特異性重組,概念：,噬菌體基因組整合到細菌染色體基因組中屬此種重組,特點：,在特定的結(jié)合序列部位，有專一的酶催化斷裂 重接-產(chǎn)生精確的DNA重排,都具有整合作用的兩個基本特征, 典型的保守性重組-交換是相互的和保存原先 的DNA，即DNA不失去、不合成、不交換對等 部分（有時是一個DNA分子整合到另一個DNA 分子中，又稱整合式重組）, 發(fā)生在噬菌體和細菌DNA短同源序列的專一性 核苷酸上，需要位點專一性的蛋白質(zhì)因子參與。,位點特異性重組與同源重組的區(qū)別：, 同源重組中DNA鏈的切斷是完全隨機的； 位點特異性重組是在某些特異的DNA 序列處發(fā)生重組。, 同源重組后染色體內(nèi)的DNA序列一般仍按 原來的順序排列； 位點特異性重組中DNA節(jié)段的相對位置發(fā) 生了移動，即DNA序列發(fā)生重排，從而得 到不同的結(jié)果。,（一）噬菌體對E.coli 的整合,1、噬菌體DNA的整合作用：,噬菌體感染大腸桿菌后，有兩種生活方式：, 裂解生長途徑（溶菌生長）：lysis pathway 溶源菌生長途徑：lysogenic pathway,噬菌體在溶源周期和裂解周期中，其DNA狀態(tài) 不同，兩種狀態(tài)的相互轉(zhuǎn)變（整合與切離）是通 過位點特異性重組實現(xiàn)的。 這些特異位點叫附著點（attachment site）， 簡稱為 att。,BOB,att B,att P,POP,Int IHF,Int Xis IHF,BOP,POB,att L,att R,原噬菌體,切除,整合,細菌DNA,噬菌體,核心序列 “O”完全一致（同源部分）-位點特異性重組發(fā)生的地方,整合后的附著位點為 attL（BOP） attR（POB）,噬菌體的整合作用有兩個特點：, DNA和宿主DNA的交換是可逆的， 原先存在的DNA序列全部被保存下來，并 無丟失。, 噬菌體和細菌的DNA之間有一段很短的 同源序列，重組交換必須通過其中的一個 特定的核苷酸。,2、噬菌體整合的分子機制：,分成三個階段：,