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藥品的無菌檢查技術(shù),授課人:汪穗福(高級講師) 蘇惠虹(助理講師) 廣州市醫(yī)藥中專學(xué)校 2005年3月,教學(xué)目標,1、學(xué)會直接接種法無菌檢查的操作。 2、懂得無菌檢查供試品溶液的制備。 3、熟知無菌檢查的結(jié)果判斷。 4、學(xué)習(xí)薄膜無菌檢查法的使用。 5、掌握影響無菌檢驗的因素和解決辦法。,教學(xué)重點: 直接接種法無菌檢查的操作。,教學(xué)難點: 薄膜無菌檢查法的使用。,第五節(jié) 直接接種檢查技術(shù),藥品無菌檢查法的具體操作方法可分為直接接種法和薄膜過濾法。中國藥典(2005年版)指出:如供試品性狀允許,應(yīng)優(yōu)先采用薄膜過濾法。進行供試品無菌檢查時,所采用的檢查方法和檢驗條件應(yīng)與驗證的方法相同。直接接種法即每支(或瓶)供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中,除另有規(guī)定外,每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10,同時,硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml,改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。培養(yǎng)基的用量和高度同方法驗證;每種培養(yǎng)基接種的管數(shù)同供試品的檢驗數(shù)量。,由于直接接種法具有操作簡便等優(yōu)點,特別適宜無抑菌和防腐作用藥品的無菌檢查。據(jù)統(tǒng)計,中國藥典(2005年版(二部)共有57種單列品種(占39.3)采用該法規(guī)定。 操作時,用適當?shù)南疽簩┰嚻啡萜鞅砻婊蛲獍b采用浸沒或擦試的方法徹底消毒。如果容器內(nèi)有一定的真空度,可用適宜的無菌器材(如帶有除菌過濾器的針頭),向供試品容器內(nèi)導(dǎo)入無菌空氣,再按無菌操作啟開容器取出內(nèi)容物。 無論使用何種檢查法,其檢查操作過程均包括供試品的處理及接種與培養(yǎng)及觀察兩大步驟。,除另有規(guī)定外,供試品處理按照樣品的不同用以下方法處理與接種。 1混懸液等非澄清水溶液供試品 該類供試品操作最簡單,取規(guī)定量的供試品直接無菌操作接種至各管培養(yǎng)基中。 2固體制劑供試品 取規(guī)定量的供試試品,無菌操作直接接種至各管培養(yǎng)基中;或供試品中加入適宜的溶劑溶解,或按標簽說明復(fù)溶后,取規(guī)定量無菌操作接種至各管培養(yǎng)基中。 3-內(nèi)酰胺類或磺胺類供試品 取規(guī)定量供試品,混合,加入適量的無菌-內(nèi)酰胺酶溶液或?qū)Π被郊姿崛芤菏怪泻?,接種至各管培養(yǎng)基中,或直接接入含-內(nèi)酰胺酶或?qū)Π被郊姿岬母鞴芘囵B(yǎng)基中。 4非水溶性供試品 取規(guī)定量供試品,混合,加入適量的聚山梨酯80或其它適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化,接種至各管培養(yǎng)基中?;蛑苯咏臃N至含聚山梨酯80或其它適宜乳化劑的各管培養(yǎng)基中。,一、供試品的處理及接種,5敷料供試品 取規(guī)定數(shù)量,每個包裝以無菌操作拆開,于不同部位剪取約100 mg或cm3cm的供試品;接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。 6腸線、縫合線等供試品 腸線、縫合線及其它一次性的醫(yī)用材料按規(guī)定量取最小包裝,無菌拆開包裝,接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。 7滅菌醫(yī)用器具供試品 取規(guī)定量,必要時應(yīng)將其拆散或切成小碎塊,接種于各管足以侵沒供試品的適量培養(yǎng)基中。 8放射性藥品 取供試品1瓶(支),接種于裝量為75ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基中。每管接種量為02ml。,接種陰性對照,與此同時另取1支硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基管,加入上述同一容器內(nèi)的供試品稀釋液或0.9滅菌氯化鈉溶液1 ml,作陰性對照。(作陰性對照的目的是說明未接檢品前的培養(yǎng)基和供試品稀釋液及無菌檢查操作都是無菌生長的,而供試品陽性檢出的菌確是來自檢品。)如供試品液未經(jīng)驗證試驗,可同步進行,方法見第五節(jié)的直接接種法的驗證試驗。,接種陽性對照,根據(jù)GMP和中國藥典要求,接種陽性對照應(yīng)在陽性對照室中進行,以防交叉污染。接種時應(yīng)按驗證試驗的結(jié)果選擇陽性對照菌。方法是:在相應(yīng)的培養(yǎng)基中接入小于100個cfu的陽性對照菌(菌液的制備和同培養(yǎng)基靈敏度檢查菌液的制備相同)。供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量(見表62、表63)相同。陽性對照管培養(yǎng)4872 h應(yīng)生長良好。,二、培養(yǎng)及觀察,培 養(yǎng) 基,按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14 d,逐日觀察并記錄,渾濁,新鮮培養(yǎng)基或劃線斜面培養(yǎng)基,培養(yǎng)液涂片,染色,鏡檢,判斷是否有菌,三、結(jié)果判斷,供試品符合規(guī)定,培養(yǎng)基管均澄清,或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長,供試品不符合規(guī)定,培養(yǎng)基管中任何1管顯渾濁并確證有菌生長,除非能充分證明生長的微生物非供試品所含。當滿足下列至少一個條件時,判試驗結(jié)果無效: 對無菌檢查試驗相關(guān)設(shè)施的微生物監(jiān)控數(shù)據(jù)表明其不符合規(guī)定。 對無菌試驗過程的回顧,揭示了本操作程序是錯誤的。 陰性對照管有菌生長。 供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后,確證微生物生長是因無菌試驗中所使用的物品和(或)無菌操作技術(shù)不當引起的。,試驗若經(jīng)確認無效,應(yīng)重試。重試時,重新取同量供試品,依法重試,若無菌生長,判供試品符合規(guī)定;若有菌生長,判供試品不符合規(guī)定。,直接接種法圖示,無抗菌作用的供試品,抽樣,接種于培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基管,培養(yǎng),每天觀察 觀察14天,報告,澄清無混濁,合格,混濁(疑 似情況),鏡檢 重新 培養(yǎng),確證,無菌 有菌,不合格,培 養(yǎng) 基,直接接種法教學(xué)片,第六節(jié) 薄膜過濾法檢查技術(shù),該法是各國藥典和中國藥典規(guī)定的第二種無菌檢查的方法,適用于任何類型藥品的無菌檢查。具有適用性廣,準確性強的特點。中國藥典(2005年版)規(guī)定:如供試品性狀允許,應(yīng)優(yōu)先采用薄膜過濾法。據(jù)統(tǒng)計,中國藥典(2005年版二部)共有88種單列規(guī)定品種(占60.7)規(guī)定采用該法。薄膜過濾法可采用封閉式薄膜過濾器(圖62)或一般薄膜過濾器(圖63),但應(yīng)優(yōu)先選用封閉式薄膜過濾器。,圖6-4:HTY微孔濾膜孔徑測定儀,圖:濾膜阻擋的細菌,一般新購得一批濾膜,因各廠家生產(chǎn)相同規(guī)格的濾膜其質(zhì)量不盡一致,應(yīng)對濾膜任選以下三種方法中的一種進行孔徑大小的測試,符合規(guī)定的濾膜才能用于無菌檢查。 (一) 氣泡法 其原理是測濾膜孔徑的大小,可用氣泡壓力方法(圖6-4)測定。先將濾膜浸入水中,使完全濕潤,然后用鑷子夾住一片濾膜放于氣泡點測定裝置上(硬聚氯乙烯氣泡點測定裝置,上?;S生產(chǎn)DY25)或濾膜孔徑測定儀上,膜上放一塊與濾膜大小相同的尼龍篩網(wǎng),再加上多孔板,將螺旋固定圈旋緊,在多孔板上加35 mm深的水(注意排除氣泡)關(guān)閉放氣閥,啟動空壓機或氮氣閥,使壓力緩緩上升,注意觀查水面上產(chǎn)生第一個氣泡時,記錄壓力表的壓力,氣泡點壓力不應(yīng)小于0.2 MPa(2.2 kg/cm2)。,(二)水流量法,其原理是在一定的壓力下,定量的水在單位時間內(nèi)通過濾膜的流量與孔徑及孔隙率有關(guān)。將濾膜裝于除菌濾器上,開動真空泵,壓力在93 KPa(700 mm Hg)下,抽濾已濾清的水約500 ml,計算出每1 mim的濾速。中國藥典對濾膜的濾速未明確規(guī)定,而SP() 規(guī)定在93 KPa(700 mm Hg)壓力下,濾膜直徑47 mm;流速5575 mm/min。此法操作簡單,但誤差大。,(三) 細菌過濾法,其原理是利用細菌細胞大小穩(wěn)定的特性,可將標準菌株制備的菌液,用待測濾膜過濾,其濾液經(jīng)培養(yǎng)無菌生長,則該濾膜孔徑符合規(guī)定。常用的細菌為粘質(zhì)沙雷菌(CMCC(B)41002),將該菌的斜面培養(yǎng)物,接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,3035培養(yǎng)1820 h,用0.9氯化鈉溶液稀釋至10-3(約相當于7x105cfu/ml)取此菌液1 ml加至50 ml 0.9氯化鈉溶液中,按薄膜過濾法過濾,取該濾液5 ml接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基40 ml中,3035培養(yǎng)24 h,應(yīng)無菌生長,而將濾膜加至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基管中應(yīng)有菌生長,證明該濾膜濾效合格。,三、薄膜過濾法檢查的操作,應(yīng)根據(jù)不同供試品而用不同的樣品處理法來進行。 應(yīng)優(yōu)先選用封閉式薄膜過濾器,濾膜孔徑不大于0.45m,直徑為47mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時,應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。 水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率,應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量為100ml,且總過濾量不宜太大,以避免濾膜上的微生物受損傷。下面就不同供試品的處理操作介紹如下:,1水溶液供試品,取規(guī)定量,直接過濾,或混合至含適量稀釋液的無菌容器內(nèi),混勻,立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑,須用適量的沖洗液沖洗濾膜,沖洗次數(shù)不得少于三次。 沖洗后,如用封閉式過濾器,分別將100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應(yīng)的濾筒內(nèi)。如果僅用薄膜過濾器,則無菌操作取出濾膜,將其剪成3等份;分別置于含50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基容器中,其中1份接種陽性對照值做陽性對照用。,2可溶于水的固體制劑供試品 取規(guī)定量,加適宜的溶劑溶解或按標簽說明復(fù)溶,然后照水溶液供試品項下的方法操作。,3-內(nèi)酰胺類供試品 取規(guī)定量,按水溶液或固體制劑供試品的處理方法處理,立即過濾,用適宜的沖洗液沖洗濾膜。再用含適量-內(nèi)酰胺酶的沖洗液清除殘留在濾筒、濾膜上的抗生素后接種培養(yǎng)基,必要時培養(yǎng)基中可加入少量的-內(nèi)酰胺酶;或?qū)V膜直接接入含適量-內(nèi)酰胺酶的培養(yǎng)基中。接種培養(yǎng)基的方法照水溶液供試品項下的方法操作。,4非水溶性制劑供試品 取規(guī)定量,直接過濾;或混合溶于含聚山梨酯80或其它適宜乳化劑的稀釋液中,充分混合,過濾。用含01%1%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜至少三次。濾膜于含或不含聚山梨酯80的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基接種照水溶液供試品項下的方法操作。,5可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和粘性油劑供試品 取規(guī)定量,混合至適量的無菌十四烷酸異丙酯(無菌十四烷酸異丙酯的制備:采用薄膜過濾法過濾除菌。選用孔徑為0.22m的脂溶性濾膜,并經(jīng)140干熱滅菌2 h)中, 劇烈振搖,使供試品充分溶解,如果需要可適當加熱,但溫度不得超過44),趁熱迅速過濾。若無法過濾,應(yīng)加入不少于100ml的稀釋液,充分振搖萃取,靜置,取下層水相作為供試液過濾。過濾后濾膜沖洗及培養(yǎng)基接種照非水溶液供試品項下的方法操作。,6無菌氣(噴)霧劑供試品 取規(guī)定量,將各容器置冰室冷凍約1 h。以無菌操作迅速在溶器上端鉆一小孔,釋放拋射劑后再無菌開啟容器,然后照水溶性制劑或非水溶性制劑項下的方法操作。,7裝有藥物的注射器供試品 取規(guī)定量,裝上無菌針頭(非包裝中所配帶的),若需要可吸入稀釋液或標簽所示的溶劑溶解,然后照水溶性制劑或非水溶性供試品項下方法操作。同時應(yīng)采用直接接種法進行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查。,8具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具(輸血、輸液袋等)供試品 取規(guī)定量,每個最小包狀用50100ml沖洗液分別沖洗內(nèi)壁,收集沖洗液于無菌容器中,然后照水溶液供試品項下方法操作。同時應(yīng)采用直接接種法進行包裝中所配帶的針頭的無菌檢查。,四、培養(yǎng)及觀察 同直接接種檢查法。 五、結(jié)果判斷 同直接接種檢查法。,開 放 式 薄 膜 過 濾 法 操 作,將藥品加入無菌稀釋劑溶液中,無菌稀釋劑溶劑分3次洗滌濾膜,取下濾膜,除去掉上層濾紙,將濾膜分成3份,加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基管,按規(guī)定溫度和時間進行培養(yǎng),薄膜過濾法檢查 教學(xué)片,第七節(jié) 無菌檢查各種中和(滅活)劑的作用機理,一、硫乙醇酸鹽、半胱氨酸、巰基化合物的作用機理 此類化合物因含有SH基,可以和重金屬結(jié)合,因而能解除或阻止含汞、含砷鹽等重金屬化合物對細菌的毒害或抑制作用。此外硫乙醇酸鹽可維持培養(yǎng)基中氧化還原電位,特別是保持培養(yǎng)基下層的厭氧條件,有利于厭氧菌生長。而半胱氨酸可作為細菌長所需的氮源。,二、青霉素酶的作用機理 青霉素酶是目前較理想的青霉素滅活劑,它能通過破壞青霉素結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酰胺環(huán)迅速完全而特異地使青霉素滅活。,三、 對氨基苯甲酸的作用機理 磺胺類藥物的分子結(jié)構(gòu)與對氨基苯甲酸非常相似,因此它可以竟爭性地取代葉酸結(jié)構(gòu)中的對氨基苯甲酸
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