藥品的無(wú)菌檢查技術(shù).ppt

藥品的無(wú)菌檢查技術(shù),授課人:汪穗福(高級(jí)講師) 蘇惠虹(助理講師) 廣州市醫(yī)藥中專學(xué)校 2005年3月,教學(xué)目標(biāo),1、學(xué)會(huì)直接接種法無(wú)菌檢查的操作。 2、懂得無(wú)菌檢查供試品溶液的制備。 3、熟知無(wú)菌檢查的結(jié)果判斷。 4、學(xué)習(xí)薄膜無(wú)菌檢查法的使用。 5、掌握影響無(wú)菌檢驗(yàn)的因素和解決辦法。,教學(xué)重點(diǎn)： 直接接種法無(wú)菌檢查的操作。,教學(xué)難點(diǎn)： 薄膜無(wú)菌檢查法的使用。,第五節(jié) 直接接種檢查技術(shù),藥品無(wú)菌檢查法的具體操作方法可分為直接接種法和薄膜過(guò)濾法。中國(guó)藥典（2005年版）指出：如供試品性狀允許，應(yīng)優(yōu)先采用薄膜過(guò)濾法。進(jìn)行供試品無(wú)菌檢查時(shí)，所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與驗(yàn)證的方法相同。直接接種法即每支（或瓶）供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中，除另有規(guī)定外，每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10，同時(shí)，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。培養(yǎng)基的用量和高度同方法驗(yàn)證；每種培養(yǎng)基接種的管數(shù)同供試品的檢驗(yàn)數(shù)量。,由于直接接種法具有操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，特別適宜無(wú)抑菌和防腐作用藥品的無(wú)菌檢查。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)藥典（2005年版(二部)共有57種單列品種（占39.3）采用該法規(guī)定。 操作時(shí)，用適當(dāng)?shù)南疽簩?duì)供試品容器表面或外包裝采用浸沒(méi)或擦試的方法徹底消毒。如果容器內(nèi)有一定的真空度，可用適宜的無(wú)菌器材（如帶有除菌過(guò)濾器的針頭），向供試品容器內(nèi)導(dǎo)入無(wú)菌空氣，再按無(wú)菌操作啟開(kāi)容器取出內(nèi)容物。 無(wú)論使用何種檢查法，其檢查操作過(guò)程均包括供試品的處理及接種與培養(yǎng)及觀察兩大步驟。,除另有規(guī)定外，供試品處理按照樣品的不同用以下方法處理與接種。 1混懸液等非澄清水溶液供試品 該類供試品操作最簡(jiǎn)單，取規(guī)定量的供試品直接無(wú)菌操作接種至各管培養(yǎng)基中。 2固體制劑供試品 取規(guī)定量的供試試品，無(wú)菌操作直接接種至各管培養(yǎng)基中；或供試品中加入適宜的溶劑溶解，或按標(biāo)簽說(shuō)明復(fù)溶后，取規(guī)定量無(wú)菌操作接種至各管培養(yǎng)基中。 3-內(nèi)酰胺類或磺胺類供試品 取規(guī)定量供試品，混合，加入適量的無(wú)菌-內(nèi)酰胺酶溶液或?qū)Π被郊姿崛芤菏怪泻?，接種至各管培養(yǎng)基中，或直接接入含-內(nèi)酰胺酶或?qū)Π被郊姿岬母鞴芘囵B(yǎng)基中。 4非水溶性供試品 取規(guī)定量供試品，混合，加入適量的聚山梨酯80或其它適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化，接種至各管培養(yǎng)基中?；蛑苯咏臃N至含聚山梨酯80或其它適宜乳化劑的各管培養(yǎng)基中。,一、供試品的處理及接種,5敷料供試品 取規(guī)定數(shù)量，每個(gè)包裝以無(wú)菌操作拆開(kāi)，于不同部位剪取約100 mg或cm3cm的供試品；接種于各管足以浸沒(méi)供試品的適量培養(yǎng)基中。 6腸線、縫合線等供試品 腸線、縫合線及其它一次性的醫(yī)用材料按規(guī)定量取最小包裝，無(wú)菌拆開(kāi)包裝，接種于各管足以浸沒(méi)供試品的適量培養(yǎng)基中。 7滅菌醫(yī)用器具供試品 取規(guī)定量，必要時(shí)應(yīng)將其拆散或切成小碎塊，接種于各管足以侵沒(méi)供試品的適量培養(yǎng)基中。 8放射性藥品 取供試品1瓶（支），接種于裝量為75ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基中。每管接種量為02ml。,接種陰性對(duì)照,與此同時(shí)另取1支硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基管，加入上述同一容器內(nèi)的供試品稀釋液或0.9滅菌氯化鈉溶液1 ml，作陰性對(duì)照。（作陰性對(duì)照的目的是說(shuō)明未接檢品前的培養(yǎng)基和供試品稀釋液及無(wú)菌檢查操作都是無(wú)菌生長(zhǎng)的，而供試品陽(yáng)性檢出的菌確是來(lái)自檢品。）如供試品液未經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，可同步進(jìn)行，方法見(jiàn)第五節(jié)的直接接種法的驗(yàn)證試驗(yàn)。,接種陽(yáng)性對(duì)照,根據(jù)GMP和中國(guó)藥典要求，接種陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)在陽(yáng)性對(duì)照室中進(jìn)行，以防交叉污染。接種時(shí)應(yīng)按驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果選擇陽(yáng)性對(duì)照菌。方法是：在相應(yīng)的培養(yǎng)基中接入小于100個(gè)cfu的陽(yáng)性對(duì)照菌（菌液的制備和同培養(yǎng)基靈敏度檢查菌液的制備相同）。供試品用量同供試品無(wú)菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量（見(jiàn)表62、表63）相同。陽(yáng)性對(duì)照管培養(yǎng)4872 h應(yīng)生長(zhǎng)良好。,二、培養(yǎng)及觀察,培 養(yǎng) 基,按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14 d,逐日觀察并記錄,渾濁,新鮮培養(yǎng)基或劃線斜面培養(yǎng)基,培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢,判斷是否有菌,三、結(jié)果判斷,供試品符合規(guī)定,培養(yǎng)基管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無(wú)菌生長(zhǎng),供試品不符合規(guī)定,培養(yǎng)基管中任何1管顯渾濁并確證有菌生長(zhǎng),除非能充分證明生長(zhǎng)的微生物非供試品所含。當(dāng)滿足下列至少一個(gè)條件時(shí)，判試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效： 對(duì)無(wú)菌檢查試驗(yàn)相關(guān)設(shè)施的微生物監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)表明其不符合規(guī)定。 對(duì)無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程的回顧，揭示了本操作程序是錯(cuò)誤的。 陰性對(duì)照管有菌生長(zhǎng)。 供試品管中生長(zhǎng)的微生物經(jīng)鑒定后，確證微生物生長(zhǎng)是因無(wú)菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。,試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無(wú)效，應(yīng)重試。重試時(shí)，重新取同量供試品，依法重試，若無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定。,直接接種法圖示,無(wú)抗菌作用的供試品,抽樣,接種于培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基管,培養(yǎng),每天觀察 觀察14天,報(bào)告,澄清無(wú)混濁,合格,混濁（疑 似情況）,鏡檢 重新 培養(yǎng),確證,無(wú)菌 有菌,不合格,培 養(yǎng) 基,直接接種法教學(xué)片,第六節(jié) 薄膜過(guò)濾法檢查技術(shù),該法是各國(guó)藥典和中國(guó)藥典規(guī)定的第二種無(wú)菌檢查的方法，適用于任何類型藥品的無(wú)菌檢查。具有適用性廣，準(zhǔn)確性強(qiáng)的特點(diǎn)。中國(guó)藥典（2005年版）規(guī)定：如供試品性狀允許，應(yīng)優(yōu)先采用薄膜過(guò)濾法。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)藥典（2005年版二部）共有88種單列規(guī)定品種（占60.7）規(guī)定采用該法。薄膜過(guò)濾法可采用封閉式薄膜過(guò)濾器（圖62）或一般薄膜過(guò)濾器（圖63），但應(yīng)優(yōu)先選用封閉式薄膜過(guò)濾器。,圖6-4：HTY微孔濾膜孔徑測(cè)定儀,圖：濾膜阻擋的細(xì)菌,一般新購(gòu)得一批濾膜，因各廠家生產(chǎn)相同規(guī)格的濾膜其質(zhì)量不盡一致，應(yīng)對(duì)濾膜任選以下三種方法中的一種進(jìn)行孔徑大小的測(cè)試，符合規(guī)定的濾膜才能用于無(wú)菌檢查。 （一） 氣泡法 其原理是測(cè)濾膜孔徑的大小，可用氣泡壓力方法（圖6-4）測(cè)定。先將濾膜浸入水中，使完全濕潤(rùn)，然后用鑷子夾住一片濾膜放于氣泡點(diǎn)測(cè)定裝置上(硬聚氯乙烯氣泡點(diǎn)測(cè)定裝置，上海化工廠生產(chǎn)DY25)或?yàn)V膜孔徑測(cè)定儀上，膜上放一塊與濾膜大小相同的尼龍篩網(wǎng)，再加上多孔板，將螺旋固定圈旋緊，在多孔板上加35 mm深的水(注意排除氣泡)關(guān)閉放氣閥，啟動(dòng)空壓機(jī)或氮?dú)忾y，使壓力緩緩上升，注意觀查水面上產(chǎn)生第一個(gè)氣泡時(shí)，記錄壓力表的壓力，氣泡點(diǎn)壓力不應(yīng)小于0.2 MPa(2.2 kg/cm2)。,（二）水流量法,其原理是在一定的壓力下，定量的水在單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)濾膜的流量與孔徑及孔隙率有關(guān)。將濾膜裝于除菌濾器上，開(kāi)動(dòng)真空泵，壓力在93 KPa(700 mm Hg)下，抽濾已濾清的水約500 ml，計(jì)算出每1 mim的濾速。中國(guó)藥典對(duì)濾膜的濾速未明確規(guī)定，而SP() 規(guī)定在93 KPa(700 mm Hg)壓力下，濾膜直徑47 mm；流速5575 mm/min。此法操作簡(jiǎn)單，但誤差大。,（三） 細(xì)菌過(guò)濾法,其原理是利用細(xì)菌細(xì)胞大小穩(wěn)定的特性，可將標(biāo)準(zhǔn)菌株制備的菌液，用待測(cè)濾膜過(guò)濾，其濾液經(jīng)培養(yǎng)無(wú)菌生長(zhǎng)，則該濾膜孔徑符合規(guī)定。常用的細(xì)菌為粘質(zhì)沙雷菌(CMCC(B)41002)，將該菌的斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1820 h，用0.9氯化鈉溶液稀釋至10-3(約相當(dāng)于7x105cfu/ml)取此菌液1 ml加至50 ml 0.9氯化鈉溶液中，按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，取該濾液5 ml接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基40 ml中，3035培養(yǎng)24 h，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，而將濾膜加至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基管中應(yīng)有菌生長(zhǎng)，證明該濾膜濾效合格。,三、薄膜過(guò)濾法檢查的操作,應(yīng)根據(jù)不同供試品而用不同的樣品處理法來(lái)進(jìn)行。 應(yīng)優(yōu)先選用封閉式薄膜過(guò)濾器，濾膜孔徑不大于0.45m，直徑為47mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。 水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過(guò)濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過(guò)濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，且總過(guò)濾量不宜太大，以避免濾膜上的微生物受損傷。下面就不同供試品的處理操作介紹如下：,1水溶液供試品,取規(guī)定量，直接過(guò)濾，或混合至含適量稀釋液的無(wú)菌容器內(nèi)，混勻，立即過(guò)濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用適量的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)不得少于三次。 沖洗后，如用封閉式過(guò)濾器，分別將100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應(yīng)的濾筒內(nèi)。如果僅用薄膜過(guò)濾器，則無(wú)菌操作取出濾膜，將其剪成3等份；分別置于含50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基容器中，其中1份接種陽(yáng)性對(duì)照值做陽(yáng)性對(duì)照用。,2可溶于水的固體制劑供試品 取規(guī)定量，加適宜的溶劑溶解或按標(biāo)簽說(shuō)明復(fù)溶，然后照水溶液供試品項(xiàng)下的方法操作。,3-內(nèi)酰胺類供試品 取規(guī)定量，按水溶液或固體制劑供試品的處理方法處理，立即過(guò)濾，用適宜的沖洗液沖洗濾膜。再用含適量-內(nèi)酰胺酶的沖洗液清除殘留在濾筒、濾膜上的抗生素后接種培養(yǎng)基，必要時(shí)培養(yǎng)基中可加入少量的-內(nèi)酰胺酶；或?qū)V膜直接接入含適量-內(nèi)酰胺酶的培養(yǎng)基中。接種培養(yǎng)基的方法照水溶液供試品項(xiàng)下的方法操作。,4非水溶性制劑供試品 取規(guī)定量，直接過(guò)濾；或混合溶于含聚山梨酯80或其它適宜乳化劑的稀釋液中，充分混合，過(guò)濾。用含01%1%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜至少三次。濾膜于含或不含聚山梨酯80的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基接種照水溶液供試品項(xiàng)下的方法操作。,5可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和粘性油劑供試品 取規(guī)定量，混合至適量的無(wú)菌十四烷酸異丙酯（無(wú)菌十四烷酸異丙酯的制備：采用薄膜過(guò)濾法過(guò)濾除菌。選用孔徑為0.22m的脂溶性濾膜，并經(jīng)140干熱滅菌2 h）中， 劇烈振搖，使供試品充分溶解，如果需要可適當(dāng)加熱，但溫度不得超過(guò)44），趁熱迅速過(guò)濾。若無(wú)法過(guò)濾，應(yīng)加入不少于100ml的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液過(guò)濾。過(guò)濾后濾膜沖洗及培養(yǎng)基接種照非水溶液供試品項(xiàng)下的方法操作。,6無(wú)菌氣（噴）霧劑供試品 取規(guī)定量，將各容器置冰室冷凍約1 h。以無(wú)菌操作迅速在溶器上端鉆一小孔，釋放拋射劑后再無(wú)菌開(kāi)啟容器，然后照水溶性制劑或非水溶性制劑項(xiàng)下的方法操作。,7裝有藥物的注射器供試品 取規(guī)定量，裝上無(wú)菌針頭（非包裝中所配帶的），若需要可吸入稀釋液或標(biāo)簽所示的溶劑溶解，然后照水溶性制劑或非水溶性供試品項(xiàng)下方法操作。同時(shí)應(yīng)采用直接接種法進(jìn)行包裝中所配帶的無(wú)菌針頭的無(wú)菌檢查。,8具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）供試品 取規(guī)定量，每個(gè)最小包狀用50100ml沖洗液分別沖洗內(nèi)壁，收集沖洗液于無(wú)菌容器中，然后照水溶液供試品項(xiàng)下方法操作。同時(shí)應(yīng)采用直接接種法進(jìn)行包裝中所配帶的針頭的無(wú)菌檢查。,四、培養(yǎng)及觀察 同直接接種檢查法。 五、結(jié)果判斷 同直接接種檢查法。,開(kāi) 放 式 薄 膜 過(guò) 濾 法 操 作,將藥品加入無(wú)菌稀釋劑溶液中,無(wú)菌稀釋劑溶劑分3次洗滌濾膜,取下濾膜,除去掉上層濾紙,將濾膜分成3份,加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基管,按規(guī)定溫度和時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng),薄膜過(guò)濾法檢查 教學(xué)片,第七節(jié) 無(wú)菌檢查各種中和(滅活)劑的作用機(jī)理,一、硫乙醇酸鹽、半胱氨酸、巰基化合物的作用機(jī)理 此類化合物因含有SH基，可以和重金屬結(jié)合,因而能解除或阻止含汞、含砷鹽等重金屬化合物對(duì)細(xì)菌的毒害或抑制作用。此外硫乙醇酸鹽可維持培養(yǎng)基中氧化還原電位，特別是保持培養(yǎng)基下層的厭氧條件，有利于厭氧菌生長(zhǎng)。而半胱氨酸可作為細(xì)菌長(zhǎng)所需的氮源。,二、青霉素酶的作用機(jī)理 青霉素酶是目前較理想的青霉素滅活劑，它能通過(guò)破壞青霉素結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酰胺環(huán)迅速完全而特異地使青霉素滅活。,三、 對(duì)氨基苯甲酸的作用機(jī)理 磺胺類藥物的分子結(jié)構(gòu)與對(duì)氨基苯甲酸非常相似，因此它可以竟?fàn)幮缘厝〈~酸結(jié)構(gòu)中的對(duì)氨基苯甲酸