實(shí)驗(yàn)七細(xì)胞骨架觀察.ppt

細(xì)胞骨架組分的 熒光染色觀察,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握細(xì)胞骨架的顯示方法 掌握熒光顯微鏡的使用方法 了解熒光顯微鏡下細(xì)胞骨架的基本形態(tài)結(jié)構(gòu),背景知識(shí),常用熒光探針介紹,狹義的細(xì)胞骨架指細(xì)胞質(zhì)骨架，包括微絲、微管和中間纖維。 廣義的細(xì)胞骨架包括細(xì)胞核骨架、細(xì)胞質(zhì)骨架、細(xì)胞膜骨架和細(xì)胞外基質(zhì)。,細(xì)胞骨架,2019/7/15,微管,2019/7/15,微絲,2019/7/15,中間纖維,背景知識(shí),S.D.Pone用考馬斯亮藍(lán)染人皮膚成纖維細(xì)胞的細(xì)胞骨架獲得成功。1982年上海植物生理所陳梓卿采用植物細(xì)胞為材料也獲成功。實(shí)踐證明這是一種簡(jiǎn)單易行的方法。 當(dāng)細(xì)胞用適當(dāng)濃度的triton X -100溶液（聚乙二醇辛基苯基醚，一種非離子去垢劑）處理，能夠溶解質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中及細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)，而微絲束結(jié)合得比較緊密，不容易被去除 ，經(jīng)固定和染色后，可在光鏡下觀察到由微絲組成的纖維束。,細(xì)胞骨架研究中常用藥物,實(shí)驗(yàn)原理,鬼筆環(huán)肽(phalloidin) 是從一種毒性菇類中分離的劇毒生物堿，它同細(xì)胞松弛素的作用相反, 只與聚合的微絲結(jié)合, 而不與肌動(dòng)蛋白單體分子結(jié)合。它同聚合的微絲結(jié)合后, 抑制了微絲的解體, 因而破壞了微絲的聚合和解聚的動(dòng)態(tài)平衡。 由于鬼筆環(huán)肽非常特異地結(jié)合并穩(wěn)定聚合態(tài)肌動(dòng)蛋白, 因而對(duì)肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)平衡造成嚴(yán)重影響. 此外, 較高濃度的鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞有毒害作用. 因此, 用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記微絲并不是用于研究活體細(xì)胞的理想方法.,G-actin,F-actin,ATP、 Mg2+、高K+、Na+,Ca2+、低Na+、K+,實(shí)驗(yàn)步驟,材料： CHO（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞）、雞胚成纖維細(xì)胞 試劑： 1.PEM：50mM pipes (pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 2.0.5% Triton X-100溶于PEM緩沖液中。 3.4%多聚甲醛溶于PEM緩沖液中。,取出蓋片，于小平皿中37預(yù)溫 PEM洗3次(每次 1mL),Triton X-100處理約10min(1mL),37預(yù)溫 PEM洗3次(每次 1mL),37預(yù)溫 4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min (1mL),37預(yù)溫 PEM洗3次,55nM Alex -phalloidin 10L濕盒中室溫染色30min。,37預(yù)溫 PEM洗數(shù)3次,滴加10L Ho.33342復(fù)染色,用小砂輪切去長(zhǎng)方形蓋玻片的一角作為標(biāo)記以便識(shí)別細(xì)胞面。 細(xì)胞密度60-80%,注意蓋玻片的正反面,切勿產(chǎn)生氣泡！,在parafilm 膜上加PEM ，待蓋玻片被沖起后，再輕輕揭下蓋玻片。,避光操作,熒光鏡下觀察,注意事項(xiàng),注意不要弄碎蓋片，分清細(xì)胞所在面； 各步洗細(xì)胞要輕，勿使細(xì)胞脫落； 熒光觀察注意避光操作 節(jié)約試劑。,思考題,PEM