GB-T17778-2005預(yù)混合飼料中d-生物素的測(cè)定.pdf

I C S 6 5 . 1 2 0B 4 6巧黔中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B / T 1 7 7 7 8 -2 0 0 5 代替 GB / T 1 7 7 7 8 -1 9 9 9預(yù)混合飼料中 d 一 生物素的測(cè)定D e t e r mi n a t i o n o f d - b i o t i n i n p r e mi x2 0 0 5 - 0 9 - 0 5 發(fā)布2 0 0 6 - 0 2 - 0 1 實(shí)施中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局中 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn) 化 管 理 委 員 會(huì)發(fā) 布免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 標(biāo)準(zhǔn)最全面免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 無需注冊(cè) 即可下載GB / T 1 7 7 7 8 -2 0 0 59 li呂本標(biāo)準(zhǔn)是 G B / T 1 7 7 7 8 -1 9 9 9 預(yù)混料中d 一 生物素的測(cè)定 的修訂版。本標(biāo)準(zhǔn)與前版相比主要技術(shù)內(nèi)容變化如下:補(bǔ)充了“ 高效液相色譜法” ， 并規(guī)定其為仲裁法。 一 在“ 分光光度法” 中“ 試樣溶液的提取” 增加了用水先溶解的步驟; 在“ 測(cè)定” 中用“ 吸光度的一階 導(dǎo)數(shù)的峰差值” 代替原“ 吸光度” 。本標(biāo)準(zhǔn)自 實(shí)施之日 起， 代替G B / T 1 7 7 7 8 -1 9 9 9本標(biāo)準(zhǔn)由全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位: 國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心( 武漢) 。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人 : 錢防 、 屈利文 、 楊林 、 楊先奎 。免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 標(biāo)準(zhǔn)最全面免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 無需注冊(cè) 即可下載GB / T 1 7 7 7 8 -2 0 0 5預(yù)混合飼料中 d 一 生物素的測(cè)定范 圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用分光光度儀和高效液相色譜儀測(cè)定預(yù)混合飼料中d 一 生物素含量的兩種方法 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法 1 和方法 2 適用于 d 一 生物素含量大于 1 . 0 mg / k g的復(fù)合預(yù)混合飼料、 維生素預(yù)混合飼料的測(cè)定。 提取液的 濃度范圍為2 . 0 k g / m L - 2 0 . 0 p g / m l . e2規(guī)范性 引用文件 下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件. 其隨后所有的修改單( 不包括勘誤的內(nèi)容) 或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)， 然而， 鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注 日 期的引用文件， 其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn) G B / T 6 6 8 2 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法( n e q I S O 3 6 9 6 : 1 9 8 7 ) G B / T 1 4 6 9 9 . 1 飼料采樣3 方 法 1 分光光度法3 . 1 原 理 用乙醇水溶液將試樣中d 一 生物素提取出來， 在硫酸乙醇溶液中d 一 生物素和4 一 二甲氨基肉桂醛生成橙色化合物， 在一定范圍內(nèi)顏色深淺與 d 一 生物素含量成正比。3 . 2 試劑和材料 除非另有說明， 在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑。水符合 G B / T 6 6 8 2 三級(jí)水的規(guī)定。3 . 2 . 1 無水乙醇。3 . 2 . 2 乙醇溶液: 將 9 0 體積的乙醇與 1 0 體積的水混勻。3 . 2 . 3 硫酸一 乙醇溶液: 將 2 體積的硫酸與9 8 體積的無水乙醇混勻3 . 2 . 4 4 一 二甲氨基肉桂醛無水乙醇溶液: 2 g / L o3 . 2 . 5 d 一 生物素標(biāo)準(zhǔn)溶液3 . 2 . 5 . 1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液: 準(zhǔn)確稱取 0 . 1 0 00gd 一 生物素標(biāo)準(zhǔn)品溶解于乙醇溶液( 3 . 2 . 2 ) 中， 定量轉(zhuǎn)人1 0 0 m L 容量瓶中， 用乙醇水溶液稀釋至刻度， 混勻。 此液1 . 0 0 m L 含d 一 生物素1 . 0 0 m g .3 . 2 . 5 . 2 標(biāo)準(zhǔn)工作液: 準(zhǔn)確移取d 一 生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液( 3 . 2 . 5 . 1 ) 1 . 0 0 mI _ 于5 0 m1 ， 容量瓶中， 加乙醇溶液稀釋至刻度， 混勻。此液1 . 0 0 m L 含d 一 生物素2 0 . 0 a g e3 . 3 儀器與設(shè)備3 . 3 . 1 分光光度計(jì)( 有一階導(dǎo)數(shù)功能) 。3 . 3 . 2 實(shí)驗(yàn)室用超聲波提取器。3 . 3 . 3 分析天平: 感量 。 . 0 0 0 1 g ,3 . 4 試樣的制備 按 G B / T 1 4 6 9 9 . 1規(guī)定方法采樣， 選取飼料樣 品至少 5 0 0 g ， 四分法縮減至 1 0 0 g ， 磨碎， 通過0 . 4 2 m m 孔篩， 混勻， 裝人密閉 容器中， 保存?zhèn)溆谩? . 5 分析步驟3 . 5 . 1 試樣溶液的提取 稱取維生素預(yù)混料約2 g ( 精確至。 . 0 0 0 1 g ) 、 復(fù)合預(yù)混料約 5g -1 0g ( 精確至 0 . 0 0 0 1 g ) ， 置于磨口平底燒瓶中， 加人 5 . 0 0 mL水置超聲波提取器( 3 . 3 . 2 ) 中超聲 2 0 mi n后， 再加人 2 0 ml無水乙醇免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 標(biāo)準(zhǔn)最全面免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 無需注冊(cè) 即可下載GB / T 1 7 7 7 8 -2 0 0 5( 3 . 2 . 1 ) 超聲2 0 mi n ， 然后轉(zhuǎn)移到5 0 m工_ 容量瓶中， 用無水乙醇( 3 . 2 . 1 ) 稀釋至刻度過濾， 棄去開始的1 0 m l ， 余下作為試 樣提取液。3 . 5 . 2 測(cè) 定3 . 5 . 2 . 1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制 精確吸取 d 一 生物素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液( 3 . 2 . 5 . 2 ) 0 . 0 0 , 1 . 0 0 , 2 . 0 0 , 5 . 0 0 , 1 0 . 0 0 mL于 2 5 mL容量瓶中，分別加人乙醇水溶液( 3 . 2 . 2 ) 1 0 . 0 0 , 9 . 0 0 , 8 . 0 0 , 5 . 0 0 , 0 . 0 0 mL . 加人硫酸一 乙醇溶液( 3 . 2 . 3 ) 1 m I和4 -二甲氨基肉桂醛無水乙醇溶液( 3 . 2 . 4 ) 2 m l， 搖勻， 室溫下放置 1h ， 用無水乙醇( 3 . 2 . 1 ) 稀釋至刻度。用 l . 0 c m 比色皿在 5 0 0 n m-5 8 0 n n : 處， 用分光光度計(jì)掃描吸光度的一階導(dǎo)數(shù)， 繪制 d 一 生物素含量與5 2 0 n m和 5 4 6 n m處吸光度的一階導(dǎo)數(shù)的峰差值的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。3 . 5 . 2 . 2 精確吸取 3 . 5 . 1 試樣提取液 1 0 . 0 0 m L于2 5 m工容量瓶中， 加人硫酸一 乙醇溶液( 3 . 2 . 3 ) 1 mL和 4 一 二甲氨基肉桂醛無水乙醇溶液( 3 . 2 . 4 ) 2 ml ， 搖勻， 室溫下放置 1h ， 用無水乙醇( 3 . 2 . 1 ) 稀釋至刻度。用 1 . 0 c m比色皿在 5 0 0 n m-5 8 0 n m處， 用分光光度計(jì)測(cè)定 5 2 0 n m和5 4 6 nn 處吸光度的一階導(dǎo)數(shù)的峰差值， 在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查得試樣提取液中 d 一 生物素的含量3 . 6 分析結(jié)果的計(jì)算和表述3 . 6 . 1 試樣中d 一 生物素的含量按式( 1 ) 計(jì)算。m , V ,仇Z VI。 ” . 。 。 。 。 ( 1 ) 式 中: X- 一 試樣中d 一 生物素的含量， 單位為毫克每千克( mg / k g ) ; m 標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得測(cè)定試樣提取液中d 一 生物素的質(zhì)量， 單位為微克( P g ) ; m, - 一試樣質(zhì)量， 單位為克( g ) , V - 一試樣測(cè)定時(shí)吸取試樣提取液體積， 單位為毫升( ml ) ; V : 一 一 試樣提取液總體積， 單位為毫升( mL ) o3 . 6 . 2 每個(gè)試樣取兩份試料進(jìn)行平行測(cè)定， 以其算術(shù)平均值為測(cè)定結(jié)果， 保留三位有效數(shù)字3 . 7 精密度3 . 7 . ， 重 復(fù)性 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的相對(duì)偏差規(guī)定如表 工 ， 以大于規(guī)定的相對(duì)偏差的情況不超過 5 %為前提。 表 1d 一 生物素含量/ ( m g / k g )相對(duì)偏差/(%) 1 0 02 0 ，。一3 . 7 . 2再現(xiàn)性 在再現(xiàn)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的測(cè)定值的絕對(duì)差值不大于表 2中所示的值， 以大于表 2 中絕對(duì)差值的情況不超過5 %為前提 表 2d 一 生物素含量/ ( mg i k g )絕對(duì)差值/ ( %)李 1 0 0士 4 0一一免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 標(biāo)準(zhǔn)最全面免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 無需注冊(cè) 即可下載GB / T 1 7 7 7 8 -2 0 0 5方法2 高效液相色譜法( 仲裁法)4 1 原理 試樣中的 d 一 生物素用水提取后， 將過濾離心后的試樣溶液注人高效液相色譜儀中進(jìn)行分離， 用紫外檢測(cè)器測(cè)定， 外標(biāo)法計(jì)算 d 一 生物素的含量。4 . 2 試劑和材料 除非另有說明， 本法所用試劑均為分析純， 水為蒸餾水， 色譜用水為去離子水， 符合G B / T 6 6 8 2 中一級(jí)用水規(guī)定。4 . 2 . 1 二乙三胺五乙酸( D T P A ) .4 . 2 . 2 三氟乙酸溶液， 0 . 0 5 %( 體積分?jǐn)?shù)) ， 用氫氧化鈉溶液仁 c ( N a O H ) = 5 m o l / L 調(diào)節(jié)p H至2 . 5 ,4 . 2 . 3 d 一 生物素標(biāo)準(zhǔn)溶液4 . 2 . 3 . 1 d - 生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液: 準(zhǔn)確稱取 。 . 1 0 0 0 g d 一 生物素溶解于水中， 定量轉(zhuǎn)人 1 0 0 ml容量瓶中， 用水稀釋至刻度。此液1 . 0 0 m L 含d 一 生物素1 . 0 0 m g .4 . 2 . 3 . 2 d 一 生物素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液: 準(zhǔn)確量取 d 一 生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 1 . 0 0 m工于 5 0 mL容量瓶中， 用水稀釋至刻度。此液 1 . 0 0 mL含 d 一 生物素 2 0 . 0 p g .4 . 3 儀器、 設(shè)備4 . 3 . 1 實(shí)驗(yàn)室用超聲波提取器。4 . 3 . 2 高效液相色譜儀， 配有紫外或二極管矩陣檢測(cè)器。44 試樣制備 同分光光度法3 . 4 ,4 . 5 分析步驟45 . 飛 試樣溶液的提取 稱取維生素預(yù)混合飼料約2 g ( 精確至。 . 0 0 0 1 g ) 、 復(fù) 合預(yù)混合飼料約5 g ( 精確至。 . 0 0 0 1 g ) ， 置于1 0 0 mL容量瓶中( 若預(yù)混合飼料中含有礦物質(zhì)， 加人 。 . 1 g D T P A) ， 加人三分之二體積的蒸餾水， 在超聲波提取器( 4 . 3 . 1 ) 中超聲提取2 0 m i n ， 冷卻后用水定容至刻度， 過濾， 濾液過 0 . 4 5 p m濾膜， 待上機(jī)。4 . 5 . 2測(cè)定4 . 5 . 2 . 1 商效液相色譜條件 色譜柱: 長 2 5 0 m m， 內(nèi)徑4 . 6 mm, 粒度 5 p m的C , ， 柱。 流動(dòng)相: 8 5 0 mL三氟乙酸溶液( 4 . 2 . 2 ) 加 1 5 0 m L乙臘( 色譜純) 。 流動(dòng)相流速: 1 . 0 ml,/mina 進(jìn)樣體積: 2 0 u L . 檢測(cè)器: 紫外或二極管矩陣檢測(cè)器， 使用波長 2 1 0 n mo4 . 5 . 2 . 2 定f測(cè)定 按高效液相色譜儀說明書調(diào)整儀器操作參數(shù)。向色譜柱注人標(biāo)準(zhǔn)工作液( 4 . 2 . 3 . 2 ) 及試樣提取液( 4 . 5 . 1 ) ， 得到色譜峰面積的響應(yīng)值， 取標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的平均值定量計(jì)算。 標(biāo)準(zhǔn).I作液應(yīng)在分析始末分別進(jìn)樣， 樣品多時(shí)， 分析中間應(yīng)插人標(biāo)準(zhǔn)工作液校正出峰時(shí)間。4 . 6 分析結(jié)果的計(jì)算和表述4 . 6 . 1 試樣中 d 一 生物 素的含量按式( 2 ) 計(jì) 算 :S, XVX 。 X認(rèn)5 。XV,Xm. . . . . . . . . . . . . . . 。 (2)式 中:X 試樣中 d 一 生物素的含量， 單位為毫克每千克( mg / k g ) ;。 試樣質(zhì) 量， 單位為克( 9 ) ;免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 標(biāo)準(zhǔn)最全面免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 無需注冊(cè) 即可下載GB/ T 1 7 7 7 8 -2 0 0 5 5 。 標(biāo)準(zhǔn)工作液峰面積; S試樣提取液峰面積; 1 , 標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度， 單位為微克每毫升( p g / mL ) ; 從標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣體積， 單位為微升( p L ) ; V, 試樣提取液進(jìn)樣體積， 單位為微升( ) , L ) ; V 一 試樣提取液總體積， 單位為毫升( ML ) .4 . 6 . 2 每個(gè)試樣取兩份試料進(jìn)行平行測(cè)定， 以其算術(shù)平均值為測(cè)定結(jié)果， 保留三位有效數(shù)字。4 . 7 精密度4 . 7 . 1 重復(fù)性 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的相對(duì)偏差規(guī)定如表 3 ， 以大于規(guī)定的