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nm23H2抗體對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP2蛋白表達量及磷酸化的影響 林超艾文兵熊志云彭智馮定坤孫歡 三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，湖北宜昌443000 摘要目的探討nm23-H2抗體對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2蛋白表達量及其磷酸化的影響，并探討其意義。方法將C6細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后,按加入nm23-H2抗體的濃度分對照組（0mg/L）、低濃度組（20mg/L）和高濃度組（40mg/L）3組，通過采用免疫組化、Western法檢測C6細(xì)胞中MMP-2蛋白表達量及磷酸化的變化。結(jié)果Western結(jié)果顯示，各實驗組中，MMP-2表達量及其磷酸化程度隨nm23-H2抗體濃度的增高呈降低趨勢，表現(xiàn)為劑量依賴性關(guān)系，3組相互比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。免疫組化結(jié)果顯示：對照組MMP-2陽性細(xì)胞數(shù)為（61.606.60）%，低濃度組為（31.005.94）%，高濃度組為（17.576.15）%，3組相互比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。結(jié)論nm23-H2對C6細(xì)胞MMP-2蛋白表達量及磷酸化起調(diào)節(jié)作用，使用特異性抗體對其拮抗后，MMP-2蛋白表達量及磷酸化水平均呈下降趨勢。 關(guān)鍵詞nm23-h2；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；mmp-2 R73A1674-074（4）12（a）042-02 現(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)，nm23-H2是Rho-GTPases/nm23信號通路的重要分子，可通過影響Rho蛋白的活性而干擾細(xì)胞的侵襲1；由于上述膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲行為與MMP-2同樣有重要的關(guān)聯(lián)。因此，nm23-H2在細(xì)胞內(nèi)是否可以通過影響MMP-2而發(fā)揮作用有待進一步探索。該研究xx年27月間采用不同濃度的nm23-H2抗體處理C6細(xì)胞，觀察其對MMP-2蛋白的表達量及其磷酸化的影響，并探討其作用機制，以期為腦膠質(zhì)瘤的治療提供實驗依據(jù)，報道如下。 1材料與方法 1.1材料 實驗自xx年2月開始，xx年7月結(jié)束。C6細(xì)胞由華中科技大學(xué)免疫學(xué)教研室提供；nm23-H2抗體；抗MMP-2抗體，HRP-羊抗兔LgG等均購自武漢博士德生物有限公司，纖連蛋白、新生小牛血清及常規(guī)生化試劑、儀器設(shè)備均由三峽大學(xué)分子生物學(xué)實驗室提供。 1.2方法 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組大鼠C6細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，待其進入對數(shù)生長期后，調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)濃度為11041105/mL，并按nm23抗體加入的濃度分為對照組（0mg/L）、低濃度組（20mg/L）和高濃度組（40mg/L）3組。20h后收集細(xì)胞樣品，并加入0.4mLRIPA裂解液，取上清備用。 1.2.2WesternBlot法檢測C6細(xì)胞中MMP-2蛋白樣品行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移于PVDF膜上，常規(guī)封閉液處理2h，依次加入一抗（抗MMP-2抗體12000稀釋，和羊抗兔二抗（13000），室溫作用1h后顯影。ImageJ軟件檢測各組MMP-2、磷酸化的MMP-2、-actin平均光密度比值均數(shù)。 1.2.3免疫組化法檢測C6細(xì)胞中MMP-2蛋白表達調(diào)整C6細(xì)胞濃度為1104/mL，依次加入不同濃度的nm23-H2抗體，后依次滴加MMP-2一抗（12000）、IgG二抗，于室溫孵育12h。后加入SABC試劑，PBS漂洗后DAB顯色，切片在高倍鏡下觀察并計數(shù)。 1.3統(tǒng)計方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，進行t檢驗。 2結(jié)果 2.1Westernblotting法檢測nm23-H2抗體對C6細(xì)胞MMP-2蛋白表達量及磷酸化的影響 如圖14所示，不同濃度nm23-H2抗體對MMP-2的表達量及磷酸化均有明顯抑制作用，隨著濃度的增加，其對MMP-2蛋白表達及磷酸化的抑制作用呈增強趨勢。 圖1、2所示，隨著nm23-H2抗體濃度的升高，MMP-2蛋白表達量及磷酸化均呈下降趨勢，圖3、4均為內(nèi)參。注：1為對照組，2為低濃度組（20mg/L），3為高濃度組（40mg/L）。 2.2ImageJ軟件檢測各組MMP-2、磷酸化MMP-2、-actin蛋白條帶平均光密度比值均數(shù) 隨nm23-H2處理濃度的增加，MMP-2蛋白及磷酸化MMP-2/-actin光密度比值呈下降趨勢，3組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05)，見表1。 2.3免疫組化法檢測nm23-H2抗體對膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2表達的影響 隨nm23-H2處理濃度的增加，細(xì)胞MMP-2陽性細(xì)胞數(shù)減少，且效果與劑量呈正相關(guān)。3組相互比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05)，見表2。 3討論 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，Rho-GTPases/nm23是一種新近發(fā)現(xiàn)的腦膠質(zhì)瘤信號通路，該通路所涉及的蛋白表達量與細(xì)胞的惡性程度密切相關(guān)。已證實，通路中的核心蛋白nm23-H2具有3種酶的活性作用：組氨酸蛋白激酶、二磷酸核苷激酶、3-5核酸外切酶活性2。對多個胞內(nèi)外蛋白存在影響3。該結(jié)果顯示，MMP-2表達量及其磷酸化程度隨nm23-H2抗體濃度的增高呈降低趨勢，表現(xiàn)為劑量依賴性關(guān)系，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。目前研究認(rèn)為，在眾多腫瘤的惡性生長過程中，MMP-2的激活是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。其本身磷酸化的程度直接關(guān)系到蛋白的活性狀態(tài)，與MMP-2部分基團的甲基化同等重要4。在該研究結(jié)果提示MMP-2可能受nm23-H2上游的干擾和調(diào)控。免疫組化的結(jié)果顯示：對照組MMP-2陽性細(xì)胞數(shù)為（61.606.60）%，低濃度組為（31.005.94）%，高濃度組為（17.576.15）%，3組相互比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。與Western檢測結(jié)果基本吻合。國內(nèi)外其他學(xué)者也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有效抑制nm23-H2活性后，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞向周圍組織的侵襲。由于nm23-H2在細(xì)胞內(nèi)的濃度不同，對腫瘤細(xì)胞中MMP-2的干預(yù)作用自然不同5。MMP-2在胞漿升的高表達往往提示腫瘤可能早期就已侵襲正常組織。其次，在膠質(zhì)瘤的生長微環(huán)境下，隨著MMP-2等蛋白表達的增強，不僅可以增強細(xì)胞自身的侵襲性生長，并可以誘導(dǎo)細(xì)胞基質(zhì)的廣泛破壞，二者之間可以相互作用，共同促進腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為6。該實驗研究也同樣證明了這一點。 其他學(xué)者通過免疫組化等方法證實：nm23-H2與同家族的nm23-H1不同，其關(guān)鍵點在于：nm23-H2可通過結(jié)合C-myc基因啟動子中的NHEIII1區(qū)域的G4序列，從而激活C-myc7-8。通過后者進一步完成相應(yīng)的生物學(xué)作用。該實驗中，將不同濃度的nm23-H2抗體與C6細(xì)胞共培養(yǎng)，研究在Rho-GTPases/nm23通路中，nm23-H2所能發(fā)揮的作用。該研究證實，nm23-H2抗體通過對nm23-H2的抑制，可以在一定程度上，降低MMP-2蛋白的表達及磷酸化程度，表明nm23-H2與MMP-2蛋白之間必然存在某種聯(lián)系，說明二者很有可能在上游蛋白水平存在調(diào)控機制，基因水平的調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后的修飾過程中可能存在影響，有待我們后期進一步研究。 參考文獻 1艾文兵，陶勝忠，薛德麟.人腦膠質(zhì)瘤中VEGF和整合素v3的表達及相關(guān)性研究J.腫瘤防治研究,xx,32(2):70-72. 2李宗河，何學(xué)令腺病毒介導(dǎo)的nm23h1對人惡性黑色素瘤A375體外抑制作用的研究J.國外醫(yī)生，xx，32(6):273278 3羅猛,朱大興,弓磊.nm23-H1基因的肺癌細(xì)胞株的建立及生物學(xué)行為改變J.中國肺癌雜志，xx,15(3):139-145. 4管孝臣，秦文星.腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的作用及臨床意義J.實用臨床醫(yī)藥雜志，xx，15(7):142144 5付軍，劉曉梅，陳忠平.mTOR信號通路調(diào)控CD133陽性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新的分子機制J.中國神經(jīng)腫瘤雜志，xx,8(2):75-81. 6湯少鵬，梁慶正.食管癌患者血清中MMP-2和M